專利名稱：兒茶素在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及兒茶素的用途，尤其涉及在制藥領(lǐng)域中的用途。
背景技術(shù)：
糖尿病(Diabetes mellitus)是一種嚴(yán)重危害現(xiàn)代人類健康的疾病， 主要由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起，是一組以慢性血葡萄糖水平增高為 特征的代謝病群。主要特點是血糖過高、糖尿、多尿、多飲、多食、消痩、 疲乏。據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，到2025年糖尿病患者將上升到3億人。在臨 床上糖尿病主要分為兩種類型i型糖尿病和n型糖尿病，其中II型糖尿病 占發(fā)病總數(shù)的8 0% ~ 9 0%， II型糖尿病的病因主要是機體組織對胰島素的阻抗 和胰島B細(xì)胞分泌胰島素相對不足，胰島素阻抗是指胰島素作用的靶器官或 乾組織如肝臟、肌肉、脂肪組織等對一定量的胰島素的生物學(xué)反應(yīng)低于預(yù)計 的正常水平，據(jù)統(tǒng)計，有50。/。新診斷的II型糖尿病患者已存在一種或一種以
上的慢性并發(fā)癥，因此糖尿病及其并發(fā)癥已經(jīng)對人類的健康構(gòu)成了重大的威 脅。
目前臨床上雖有一些藥物用于治療n型糖尿病，但均具有一些毒副作
用。例如，以前認(rèn)為是最有希望的治療II型糖尿病的一類藥物，目前臨床上
仍然使用的thiazolidinedione (四氫噻唑二酮)類藥物，它們是通過過氧
化物酶增生物激活Y受體增加脂肪細(xì)胞分化增殖來提高胰島素敏感性的一
類藥物，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)它們通常導(dǎo)致患者體重增加并具有一些其它的副作用，因
此目前急需安全、有效的靶標(biāo)藥物。
人體和動物體內(nèi)有許多蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶，它們和酪氨酸激酶一道控
制著蛋白質(zhì)酪氨酸的磷酸化作用，這些酶在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著重 要的作用，并且與許多病理現(xiàn)象都有密切的聯(lián)系，其中蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶IB (Protein Tyrosine PhosphataselB, PTP1B)是最熱門的研究對象之一， 因為近年來對PTP1B的體內(nèi)和體外的研究發(fā)現(xiàn)PTP1B是一個治療II型糖尿病 和肥胖癥的重要靶標(biāo)，因此對PTPIB的抑制是一種治療II型糖尿病和肥胖癥 的極有前景的療法。PTP1B由435個氨基酸殘基組成，分子量"666Da,它在 各種細(xì)胞中都廣泛表達(dá)，包括像肝臟、肌肉和脂肪這些作為胰島素代謝的重 要調(diào)節(jié)劑的組織。近年來的研究已經(jīng)證明，PTP1B是胰島素信號的一個特異 性負(fù)調(diào)節(jié)劑，PTP1B基因敲除的小鼠對胰島素有極強的敏感性，并且用高脂 肪食料長期喂養(yǎng)仍然不增加體重；另外還發(fā)現(xiàn)，用PTP1B反義寡核苷酸可以 恢復(fù)糖尿病小鼠對胰島素的敏感性，這也闡明了 PTP1B在糖尿病狀態(tài)下的作 用；另外在糖尿病病人體內(nèi)PTPlB的活性要比正常人高30y。。這些研究表明， PTP1B能調(diào)節(jié)胰島素信號而且這種把PTPIB作為靶標(biāo)來抑制的方式在治療II
型糖尿病和肥胖癥上具有重要的臨床應(yīng)用前景。
近年來，國內(nèi)外的很多研究人員一直都在尋找選擇性的PTP1B抑制劑， 雖然特異的、有效的和安全的非肽類抑制劑還未發(fā)現(xiàn)，但PTP1B抑制劑的研 究已經(jīng)取得了一定的進展。目前已發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)PTP1B抑制劑為肽類或毒性 較強的物質(zhì)，例如非選擇性的PTP抑制劑釩酸鹽和過釩酸鹽等，無法作為藥 物進行開發(fā)。其它如中國專利申請CN1794989A，所提到的PTP1B抑制劑為 N- (((((1， 3-瘞唑-2-基)氨基)羰基)苯基)磺酰基)苯丙氨酸衍生物及相關(guān)化
合物，需要通過多步化學(xué)合成得到，生產(chǎn)工藝復(fù)雜。從傳統(tǒng)中藥資源中篩選 PTP1B抑制劑是最有希望的方法之一，現(xiàn)已有從中藥等天然植物中分離提取 得到的PTP1B抑制劑，如中國專利申請CN1521157A,在植物紫金牛和小連翹 中分離得到了一系列PTP1B抑制物對苯醌類化合物及其衍生物。還有在中藥 厚樸制劑抑制PTP1B的專利申請(200710055256.2 )。但至今尚未發(fā)現(xiàn)茶葉 中明確結(jié)構(gòu)的茶色素抑制PTP1B的有關(guān)報道。
本發(fā)明人對茶葉，尤其是普洱茶在制藥中的應(yīng)用進行了系統(tǒng)的研究，對 普洱茶及其制劑在制備治療或預(yù)防糖尿病的藥中的應(yīng)用，已于2008年11月
421日申請了中國發(fā)明專利(專利申請?zhí)?00810233620.4 )。在此基礎(chǔ)上， 本發(fā)明人對茶葉中的幾種有效成份，作了更加深入細(xì)致的試驗與研究，取得 多項令人感到振奮的進展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供兒茶素的新用途，即兒茶素在制藥中的新應(yīng)用。 實際上，本發(fā)明涉及兒茶素在制備治療或預(yù)防II型糖尿病的藥中的應(yīng)用。
涉及兒茶素在制備治療或預(yù)防肥胖性糖尿病的藥中的應(yīng)用。 涉及兒茶素在制備治療或預(yù)防肥胖病的藥中的應(yīng)用。 涉及兒茶素在制備抑制蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶的藥中的應(yīng)用。 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)。
兒茶素是我囯傳統(tǒng)食品茶葉中的主要成分，和咖啡因同屬茶葉中的兩大 重要機能性成分。兒茶素是茶葉中提取的一類多羥基酚類化合物，因其分子 中含兒茶酚結(jié)構(gòu)，故將其統(tǒng)稱為兒茶素(Catechins),又稱茶單寧。
天然產(chǎn)生的八大兒茶素為兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、沒食子兒茶素 (GC)、表沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素沒食子酸酯(CG)、表兒茶素沒食 子酸酯(ECG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)和表沒食子兒茶素沒食子 酸酯(EGCG),其 義。H 化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式n。
(式I )
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所述的八大兒茶素都具有相同的母核結(jié)構(gòu)，如式I所示。 (式II )HO* (Y
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本發(fā)明所述的兒茶素是指從綠茶、半發(fā)酵茶(烏龍茶、鐵觀音)、發(fā)酵 茶(紅茶)和普洱茶中提取的具有如式I中所示的黃烷醇類化合物母核結(jié)構(gòu) 的各種兒茶素單體(C、 EC、 GC、 EGC、 CG、 ECG、 GCG、 EGCG,如式II所示)
及這些兒茶素單體的混合物。兒茶素制劑可以是通過以兒茶素為原料或原料 之一所制備到的一種制劑。制劑以兒茶素為主要原料或原料之一，包括兒茶 素顆粒、兒茶素片劑、兒茶素浸膏、兒茶素丸劑、兒茶素口服液或兒茶素針 劑。
本發(fā)明所述的兒茶素的制備方法，釆用以下步驟
1. 茶葉—乙酸乙酯提取物—Sephadex LH-20 (5cmx95cm)分離—95% (V/V)乙醇洗脫，速度控制在2mL/min—收集洗脫液，含ECG、 EGC、 EGCG
混合物爿凍干混合物，得到兒茶素粉末；
2. 茶葉—蒸餾水浸提物—乙酸乙酯萃取，除去有機相—甲醇溶解兒茶素 粗提物—S印hadex LH-20 (5cmx95cm)分離—氯仿甲醇汽油(V:V:V) =1: 2: 1洗脫—收集洗脫液，含C、 EC、 GC、 ECG、 EGC、 EGCG混合物—凍干 混合物，得到兒茶素粉末；
3. 茶葉—氯仿索氏提取—乙醇索氏提取—活性炭脫色(0. 5g活性炭/15g 茶葉乙醇提取液)—減壓濃縮干燥—凍干混合物，得到兒茶素粉末。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將用相應(yīng)的藥理試驗及結(jié)果來說明 兒褐素在制藥領(lǐng)域中的新用途。
6A. PTP1B抑制劑I"的測定原理和反應(yīng)體系
PTP1B是一種磷酸酶，它可以使磷酸化的蛋白質(zhì)去磷酸化。兒茶素體外 靶標(biāo)選用基因工程技術(shù)克隆的人PTP1B催化結(jié)構(gòu)域(APTP1B)。由于APTP1B 具有完整的PTP1B催化部位結(jié)構(gòu)和活性，所以是一種很好的用于體外模擬 PTP1B的實驗?zāi)Ｐ?。在大腸桿菌中表達(dá)PTP1B的催化結(jié)構(gòu)域，經(jīng)純化后以對 硝基苯磷酸二鈉鹽(Z^NPP )為底物，測定PTP1B的活性。纊NPP可以被PTP1B 去磷酸化，變成對硝基苯酚，顏色呈黃色，通過檢測410nm處光吸收值的變 化來間接檢測酶活性的變化情況。
B. 各種物質(zhì)對APTP1B的抑制作用通過測定其半數(shù)抑制濃度(1"0)來 衡量，兒茶素對APTP1B抑制作用(即IC50)的具體測定方法如下
測定IC50的酶活反應(yīng)體系25mMMops pH7. 0; lmg/mlBSA; 0. 1MNaCl; 0. lmMEDTA; lmM DTT; 10mM ,NPP; 5uL不同濃度的兒茶素;5nM APTP1B。 3"C反應(yīng)30min后，加入100ul 0. 2M NaHC03終止反應(yīng)，在410nm處測定酶 反應(yīng)前后的吸光度。
測量組(A-Ao) 樣品抑制率(％) =1— _
對照組(A-Ao)
抑制劑按照1/2梯度稀釋，不同濃度的抑制劑對應(yīng)不同的抑制率，用抑 制率對抑制劑濃度作圖，將各個梯度的吸收值與未加抑制組分的吸收值相 除，得出的數(shù)值為抑制百分?jǐn)?shù)，當(dāng)達(dá)到50%時，所對應(yīng)稀釋倍數(shù)的濃度即為 IC5。。
C. 測定結(jié)果
兒茶素按照25mg/ml (W/V)濃度用蒸餾水溶解，配制成兒茶素溶液，按 2倍梯度進行稀釋，稀釋后每個濃度梯度的樣品加入到PTP1B活性測定的反應(yīng) 體系中，測定每個稀釋濃度對PTP1B的抑制能力，以茶褐素的濃度(mg/ml)作為ICs。的單位，測得ICs。為0. 357tng/ml。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
試驗結(jié)果清楚地表明，兒茶素能有效的抑制PTP1B的活性，其半數(shù)抑制 濃度I"可達(dá)到0. 357mg/ml，可作為與蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B相關(guān)疾病的 食品、藥物或藥物組合成分；并可作為治療n型糖尿病、肥胖癥等一系列和 PTP1B相關(guān)疾病的食品、藥物或藥物組合。而且由于本發(fā)明是從茶葉中提取 得到的天然產(chǎn)物，對人體無毒副作用，服用安全可靠，這一點是現(xiàn)有技術(shù)無 法實現(xiàn)的。
具體實施例方式
實施例1
一一兒茶素粉劑的制備 加IO倍的90 95。C蒸餾水(W/V)浸提茶葉20min，過濾后冷卻至室溫， 加等體積乙酸乙酯萃取1~3次，低溫真空濃縮有機相并回收乙酸乙酯，冷
凍干燥濃縮液去除殘留有機溶劑，即得到粗兒茶素制品，用甲醇溶解兒茶素 制品，過SephadexLH-20 (5cmx95cm)，用氯仿甲醇汽油(V:V:V)=1: 2: l的洗脫液洗脫，收集含C、 EC、 GC、 ECG、 EGC、 EGCG混合物的洗脫液， 凍干混合物得到兒茶素粉末。 實施例2
以實施例1所制備的兒茶素粉劑來研究其對人PTP1B催化結(jié)構(gòu)域(A PTP1B)的抑制作用，兒茶素按照25mg/ml (W/V)濃度用蒸餾水溶解，配制成 兒茶素溶液，按2倍梯度進行稀釋，測定每個稀釋濃度對PTP1B的抑制能力， 以兒茶素的濃度(mg/ml )作為ICs。的單位，測得ICs。為0. 357mg/ml。
最后還需要指出，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例。顯然，本發(fā)明 不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明 公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1. 兒茶素在制備治療或預(yù)防II型糖尿病的藥中的應(yīng)用。
2. 兒茶素在制備治療或預(yù)防肥胖性糖尿病的藥中的應(yīng)用。
3. 兒茶素在制備治療或預(yù)防肥胖病的藥中的應(yīng)用。
4. 兒茶素在制備抑制蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶的藥中的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1 4所述的應(yīng)用，其中所述的兒茶素是以綠茶、半發(fā) 酵茶、發(fā)酵茶和普洱茶為原料，通過萃取的方法從茶葉中提取得到的天然產(chǎn) 物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的應(yīng)用，其中所述的兒茶素制劑可以是通過 以兒茶素為原料或原料之一制備得到的一種制劑，包括兒茶素沖劑、兒茶素 粉劑、兒茶素浸膏、兒茶素丸劑、兒茶素口服液或兒茶素膠囊。
全文摘要
本發(fā)明公開了兒茶素在制藥領(lǐng)域中的新用途。本發(fā)明的兒茶素是以綠茶、半發(fā)酵茶、發(fā)酵茶和普洱茶為原料，通過萃取的方法從茶葉中提取得到的天然產(chǎn)物。藥理試驗結(jié)果表明，兒茶素具有顯著地抑制蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶的功能?？捎糜谥委熁蝾A(yù)防II型糖尿病、治療或預(yù)防肥胖性糖尿病、治療或預(yù)防肥胖病。由于是從茶葉中提取的純天然物質(zhì)，具有無毒副作用，服用安全可靠的優(yōu)點。
文檔編號A61K36/185GK101474314SQ20091009407
公開日2009年7月8日 申請日期2009年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月2日
發(fā)明者付學(xué)奇, 季愛兵, 婷 李, 李艷華, 楊柳霞, 沈培平, 王亞軍, 軍 盛, 趙昌能, 郝淑美 申請人:普洱市人民政府茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展辦公室科技服務(wù)中心