專利名稱：一種高純度草烏甲素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從天然的一類植物滇西草烏的塊根中提取高純度草烏甲素的方法。
背景技術(shù)：
草烏甲素(Bulleyaconitione A)又曾稱為滇西嘟拉堿甲或龍頭烏頭堿甲，分子式 C35H4901()N，分子量643.77，為無色棱狀晶體?？扇苡谝颐?、醇、酸水，不溶于水，具有 較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛及明顯的抗炎作用。實驗證明，本品的鎮(zhèn)痛作用是中樞性的，并與腦內(nèi)5-羥色 胺的水平有密切聯(lián)系，起效時間比嗎啡慢(平均37.8min)，但維持時間長(平均9.3h)， 且無成癮性。其抗炎作用不通過腎上腺體系，而與抑制PG水平有關(guān)；本品尚有解熱和局 部麻醉作用。用藥后對患者心電、腦電、肝腎功能及尿常規(guī)檢查與用藥前比較無異常改變。 臨床上本品對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損、肩周炎、四肢扭傷、挫傷等有 較好的療效，還可用于癌痛、帶狀皰疹。治療劑量下本品對心、肝、腎、肺、脾、胃功能 無損害，也無明顯毒副作用。<formula>formula see original document page 3</formula>草烏甲素結(jié)構(gòu)式
《中國原料植物藥》和羅士德等在《化學(xué)學(xué)報》1985, 43(6) :577發(fā)表了 "龍頭烏頭生 物堿成分研究"的文獻(xiàn)中公開了有關(guān)草烏甲素提取采用氨水堿化，苯提取，氯仿萃取，氧 化鋁柱層析，乙醚-苯洗脫的方式分離草烏甲素，該方法所使用藥材為龍頭烏頭，藥材難 大量獲得，使用了苯，為高致癌物質(zhì)，乙醚為易燃易爆有機(jī)溶劑，實際操作過程煩瑣，安 全生產(chǎn)難掌控，獲得的草烏甲素經(jīng)高效液相色譜檢測含量在90%-95%。存在含量偏低，生 產(chǎn)成本高，生產(chǎn)安全風(fēng)險大等問題，工業(yè)化大生產(chǎn)困難。在CN1054976A的專利中公開了 從滇烏堿半合成草烏甲素的方法，實際操作中因反應(yīng)產(chǎn)生的雜質(zhì)難分離純化，分離得到合 格的起始原料滇烏堿困難，導(dǎo)致生產(chǎn)成本高，亦較難工業(yè)化大生產(chǎn)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種從含草烏甲素的一類烏頭屬植物——滇西草烏中，通過采用 新的低毒性有機(jī)溶劑提取分離，獲得高純度草烏甲素的方法，該方法具有生產(chǎn)成本低，操 作簡便，獲得草烏甲素純度高，生產(chǎn)安全等優(yōu)點(diǎn)，可以實現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)。
本發(fā)明所述的滇西草烏為長喙烏頭^wi/似附gewge/ Comber、拳距瓜葉烏頭 v4co"http://"/ii /tems/e"/i"附Hw:c/rc/im/"附W.T.wang、滇西烏頭爿fwi/似附6"〃e"""m Diels.、粗蓬烏頭Ac/uss/coii/e W.T.Wang、玉龍烏頭A s'<i/j/ <m"OT Hand.-Mazz.、展花黃 草烏Av/,iiMw/"i'flw"附va/: /m/e""]pi7"附 W.T.Wang、直緣烏頭y4./ra/mec,"附Diels.的塊根 中的一種或多種的混合體。
本發(fā)明的方法按以下步驟進(jìn)行
① 將滇西草烏的塊根凈選后粉碎成粗粉，用酸性含1 3個碳原子的脂肪族醇溶液浸
泡24 48小時，滲漉，滲漉總體積與藥材重量比為30 : 1;或用酸性含1 3個碳原子的 脂肪族醇溶液浸泡6~12小時，每次用6 8倍量藥材重量的提取溶劑回流提取，共提取3 4次，其中所用的酸為硫酸或鹽酸中的任意一種；酸性含1 3個碳原子的脂肪族醇溶液中 含酸的體積比為0.0% 1.0%，含1 3個碳原子的脂肪族醇的含量為50% 100%;滲漉速 度為3 5ml/min. kg。
② 將步驟①制得的酸性1 3個碳原子的脂肪族醇滲漉液或提取液80 90'C減壓濃縮 至無醇，冷卻至室溫，使相對密度為1.00 1.30， pH為1.0 4.0，靜置10 20小時，過 濾，得到酸水提取液。
③ 將步驟②制得的酸水提取液用堿化劑調(diào)節(jié)p朋.0 8. 0，每次用酸水液與萃取溶劑體 積比為1 : 1 1 : 5的乙酸乙酯或三氯甲垸萃取，共萃取3 4次。濃縮萃取溶劑，得到萃 取膏。其中堿化劑可以為氨水、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣中的任意一種的水溶液。
④ 將步驟③得到的萃取膏用柱層析用硅膠或中性氧化鋁為填料，溶劑汽油-丙酮-二乙
胺(4 : i: o. 1 15 : i: o. i)系統(tǒng)或石油醚(60 90°c)-丙酮-二乙胺(4 : i : o. 1 15 : i: o. i)系統(tǒng)或環(huán)己烷-丙酮-二乙胺(4:i: o. 1 15 : i : o. i)系統(tǒng)為洗脫，薄層層析 時檢査收集液中草烏甲素純度，合并含草烏甲素的收集液，濃縮溶劑。
⑤ 將步驟④所得的濃縮物用質(zhì)量體積比(g/ml)為i : 5 1 : 20的甲醇或乙醇溶解，
過濾，室溫結(jié)晶；過濾，用甲醇或乙醇反復(fù)洗滌結(jié)晶，即得終產(chǎn)品。
本發(fā)明的方法工藝簡單，生產(chǎn)成本低，操作簡便，產(chǎn)品純度高。制得的草烏甲素經(jīng)高
效液相色譜分析含量98%以上。以下是本發(fā)明中草烏甲素的含量測定和薄層層析方法。
一、 本發(fā)明中草烏甲素的含量測定
1、 儀器與試藥試劑
Shmimadzu LC-10高效液相色譜儀包括Shmimadzu LC-10AVP泵，F(xiàn)CV-10ALVP+DGU-12A 組合成在線脫氣裝置，SIL-10ADVP自動進(jìn)樣器，SPD-MIOAVP 二級管陣列檢測器，CTO-10ASVP 柱溫箱，CLASS-VP工作站。色譜柱Luna C18 250X4. 6mm。
乙腈、磷酸為色譜級、HPLC用水是重蒸蒸餾水；鹽酸、三乙胺為分析級。 草烏甲素對照品；批號100530-200501;中國藥品生物制品檢定所提供； 草烏甲素，批號20090107， 20090123， 20090202，昆明制藥集團(tuán)股份有限公司。
2、 色譜條件
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八垸基硅垸鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.2%三乙胺 水溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.1士0.1) (35:65)為流動相；檢測波長為260nm。理論板 數(shù)按草烏甲素峰計算應(yīng)不低于3000。
3、 測定法
取本品約20mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻， 精密量取5ml，置50ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取20u 1注入液相色 譜儀，記錄色譜圖；另取草烏甲素對照品約20mg，同法測定，按外標(biāo)法以峰面積計算， 即得。
二、 本發(fā)明中草烏甲素的薄層層析方法
取柱層析收集液，作為供試品溶液。另取草烏甲素對照品，加甲醇制成每lml含10 iig的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(附錄VI B)試驗，吸取上述兩種溶液各IO y 1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60-90°C)-丙酮-二乙胺系統(tǒng)(4 : 1 : 0. 1) 為展開劑，展開，取出，晾干，噴以改良碘化鉍鉀試液，檢視。


圖1是本發(fā)明的高純度草烏甲素高效液相HPLC色譜圖。
具體實施例方式
下面的實施例可以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不是對本發(fā)明的限制。
實施例1:取lkg滇西草烏的塊根凈選后粉碎成粗粉，用O. 5%鹽酸75%甲醇水溶液作為提取溶劑， 浸泡12小時，回流提取3次，每次3小時，提取溶劑用量與藥材體積重量比為6 : 1。 80 'C減壓濃縮至無醇，冷卻至室溫，使相對密度為約1. 10， pH為2. 0-3. 0，靜置12小時， 過濾，得到酸水提取液。將制得的酸水提取液用氨水調(diào)節(jié)pH7.0土0.5，每次用酸水液與萃 取溶劑體積比為1 : 3的乙酸乙酯萃取，萃取3次。濃縮回收萃取溶劑，得到乙酸乙酯萃
取膏。得到的萃取膏用重量比為i: io柱層析用硅膠為填料，溶劑汽油-丙酮-二乙胺系統(tǒng) (12 : i: o. i)系統(tǒng)洗脫，薄層層析時時檢査收集液中草烏甲素純度，合并含草烏甲素一
個斑點(diǎn)的收集液，濃縮溶劑。將所得的濃縮物用質(zhì)量體積比(g/ml)為1 : 10的甲醇溶解， 過濾；室溫結(jié)晶，過濾，用甲醇反復(fù)洗滌結(jié)晶，得草烏甲素2.0g，提取回收率為53M。
HPLC分析上述草烏甲素的含量為98. 3%。
實施例2:
取lkg滇西草烏的塊根凈選后粉碎成粗粉，用0. 7%鹽酸95%乙醇水溶液作為提取溶劑， 浸泡24 48小時，滲漉，滲漉速度為5ml/min.kg，滲漉總體積與藥材重量比為30 : 1。 將滲漉液8(TC減壓濃縮至無醇，冷卻至室溫，使相對密度為I.IO， pH為1.0 3.0，靜置 18小時，過濾，得到酸水提取液。將制得的酸水提取液用lmol/L的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié) pH7.0土0.5，每次用酸水液與萃取溶劑體積比為1 : 5的氯仿萃取，萃取4次。濃縮回收 萃取溶劑，得到氯仿萃取膏。得到的萃取膏用重量比為1 : 50柱層析用氧化鋁為填料，環(huán)
己烷-丙酮-二乙胺系統(tǒng)(io : i : o. i)系統(tǒng)洗脫，薄層層析時時檢查收集液中草烏甲素純
度，合并含草烏甲素一個斑點(diǎn)的收集液，濃縮溶劑。將所得的濃縮物用質(zhì)量體積比(g/ml) 為l : 15的乙醇溶解，過濾；室溫結(jié)晶，過濾，用乙醇反復(fù)洗滌結(jié)晶，即得草烏甲素2.3g, 提取回收率為57%。
HPLC分析上述草烏甲素的含量為99. 8%。
實施例3:
取lkg滇西草烏的塊根凈選后粉碎成粗粉，用1.0%鹽酸75%異丙醇水溶液作為提取溶 齊IJ，浸泡24 48小時，滲漉，滲漉速度為3ml/min. kg，滲漉總體積與藥材重量比為30 : 1。將滲漉液9(TC減壓濃縮至無醇，冷卻至室溫，使相對密度為1.15， pH為1.5 3.0， 靜置20小時，過濾，得到酸水提取液。將制得的酸水提取液用lmol/L的氫氧化鉀水溶液 調(diào)節(jié)pH8.0土0.5，每次用酸水液與萃取溶劑體積比為1 : 4的氯仿萃取，萃取4次。濃縮 回收萃取溶劑，得到乙酸乙酯萃取膏。得到的萃取膏用重量比為1 : 30柱層析用硅膠為填料，石油醚(60 90°c)-丙酮-二乙胺系統(tǒng)(8 : i : o. i)系統(tǒng)洗脫，薄層層析時時檢查 收集液中草烏甲素純度，合并含草烏甲素一個斑點(diǎn)的收集液，濃縮溶劑。將所得的濃縮物
用質(zhì)量體積比(g/ml)為1:20的乙醇溶解，過濾；室溫結(jié)晶，過濾，用乙醇反復(fù)洗滌結(jié) 晶，即得草烏甲素2.5g,提取回收率為62y。。
HPLC分析上述草烏甲素的含量為98. 2%。
實施例4:
取lkg滇西草烏的塊根凈選后粉碎成粗粉，用0. 5%硫酸75%乙醇水溶液作為提取溶劑， 浸泡12小時，回流提取3次，每次3小時，提取溶劑用量與藥材體積重量比為8:1。 80 。C減壓濃縮至無醇，冷卻至室溫，使相對密度為1.20， pH為2.0 3.0，靜置15小時，過 濾，得到酸水提取液。將制得的酸水提取液用澄清的氫氧化鈣水溶液調(diào)節(jié)pH6.0士0.5，每 次用酸水液與萃取溶劑體積比為1 : 3的乙酸乙酯萃取，萃取3次。得到的萃取膏用重量
比為i : 20柱層析用硅膠為填料，溶劑汽油-丙酮-二乙胺系統(tǒng)(14 : l : o. l)系統(tǒng)洗脫，
薄層層析時時檢查收集液中草烏甲素純度，合并含草烏甲素一個斑點(diǎn)的收集液，濃縮溶劑。
將所得的濃縮物用質(zhì)量體積比(g/ml)為l : 12的乙醇溶解，過濾；室溫結(jié)晶，過濾，用 乙醇反復(fù)洗滌結(jié)晶，即得草烏甲素1.8g，提取回收率為45%。
HPLC分析上述草烏甲素的含量為99. 1%。
實施例5:
取lkg滇西草烏的塊根凈選后粉碎成粗粉，用75%甲醇水溶液作為提取溶劑，浸泡12 小時，回流提取3次，每次3小時，提取溶劑用量與藥材體積重量比為6 : 1。 8(TC減壓濃 縮至無醇，冷卻至室溫，使相對密度為1.20， pH為2.0-3.0，靜置10小時，過濾，得到 酸濃縮水提取液，用鹽酸調(diào)pH2-3，室溫靜置12小時后，過濾，得酸水提取液。將制得的 酸水提取液用氨水調(diào)節(jié)pH7.0，每次用酸水液與萃取溶劑體積比為1 : 3的乙酸乙酯萃取， 萃取4次。濃縮回收萃取溶劑，得到乙酸乙酯萃取膏。得到的萃取膏用重量比為1 : 40柱
層析用硅膠為填料，溶劑汽油-丙酮-二乙胺系統(tǒng)(12 : l : o. i)系統(tǒng)洗脫，薄層層析時時
檢査收集液中草烏甲素純度，合并含草烏甲素一個斑點(diǎn)的收集液，濃縮溶劑。將所得的濃
縮物用質(zhì)量體積比(g/ml)為1 :5的甲醇溶解，過濾；室溫結(jié)晶，過濾，用甲醇反復(fù)洗 滌結(jié)晶，即得草烏甲素2.0g，提取回收率為53y。。
HPLC分析上述草烏甲素的含量為98. 3%。
實施例6:取lkg滇西草烏的塊根凈選后粉碎成粗粉，用甲醇作為提取溶劑，浸泡12小時，回 流提取3次，每次3小時，提取溶劑用量與藥材體積重量比為6:1。 8(TC減壓濃縮至無醇， 冷卻至室溫，加鹽酸水溶液，使相對密度為1.30， pH為2.0 3.0，靜置10小時，過濾， 得到酸濃縮水提取液，室溫靜置12小時后，過濾，得酸水提取液。將制得的酸水提取液 用氨水調(diào)節(jié)pH7.0土0.5，每次用酸水液與萃取溶劑體積比為1 : 3的乙酸乙酯萃取，萃取 4次。濃縮回收萃取溶劑，得到乙酸乙酯萃取膏。得到的萃取膏用重量比為1 : 40柱層析
用中性氧化鋁為填料，溶劑汽油-丙酮-二乙胺系統(tǒng)(12 : i: o. i)系統(tǒng)洗脫，薄層層析時
時檢查收集液中草烏甲素純度，合并含草烏甲素一個斑點(diǎn)的收集液，濃縮溶劑。將所得的
濃縮物用質(zhì)量體積比(g/ml)為1 :9的甲醇溶解，過濾；室溫結(jié)晶，過濾，用甲醇反復(fù) 洗滌結(jié)晶，即得草烏甲素2.0§,提取回收率為53%。 HPLC分析上述草烏甲素的含量為98. 5%。
權(quán)利要求
1、一種高純度草烏甲素的制備方法，其特征在于操作步驟包括①將滇西草烏的塊根凈選后粉碎成粗粉，用酸性含1～3個碳原子的脂肪族醇溶液浸泡24～48小時，滲漉，滲漉總體積與藥材重量比為30∶1；或用酸性含1～3個碳原子的脂肪族醇溶液浸泡6～12小時，每次用6～8倍量藥材重量的提取溶劑回流提取，共提取3～4次，其中所用的酸為硫酸或鹽酸中的任意一種；酸性含1～3個碳原子的脂肪族醇溶液中含酸的體積比為0.0％～1.0％，含1～3個碳原子的脂肪族醇的含量為50％～100％；滲漉速度為3～5ml/min.kg；②將步驟①制得的酸性1～3個碳原子的脂肪族醇滲漉液或提取液80～90℃減壓濃縮至無醇，冷卻至室溫，使相對密度為1.00～1.30，pH為1.0～4.0，靜置10～20小時，過濾，得到酸水提取液；③將步驟②制得的酸水提取液用堿化劑調(diào)節(jié)pH6.0～8.0，每次用酸水液與萃取溶劑體積比為1∶1～1∶5的乙酸乙酯或三氯甲烷萃取，共萃取3～4次，濃縮萃取溶劑，得到萃取膏；④將步驟③得到的萃取膏用柱層析用硅膠或中性氧化鋁為填料，用溶劑汽油∶丙酮∶二乙胺＝4∶1∶0.1～15∶1∶0.1、或用60～90℃的石油醚∶丙酮∶二乙胺＝4∶1∶0.1～15∶1∶0.1、或用環(huán)己烷∶丙酮∶二乙胺＝4∶1∶0.1～15∶1∶0.1洗脫，薄層層析時時檢查收集液中草烏甲素純度，合并含草烏甲素的收集液，濃縮溶劑；⑤將步驟④所得的濃縮物用質(zhì)量體積比為1∶5～1∶20的甲醇或乙醇溶解，過濾，室溫結(jié)晶；過濾，用甲醇或乙醇反復(fù)洗滌結(jié)晶，即得終產(chǎn)品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的草烏甲素的制備方法，其特征在于步驟①中選用的脂肪族醇為甲醇或乙醇。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的草烏甲素的制備方法，其特征在于其中堿化劑為氨水、 氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化f丐中的任意一種的水溶液。
全文摘要
本發(fā)明是一種高純度草烏甲素的制備方法。制備方法包括下列步驟，將滇西草烏根粉碎，用酸性醇溶劑或者醇水溶劑滲漉、超聲或者熱回流提取。將提取液80～90℃減壓濃縮至無醇，冷卻至室溫，使相對密度為1.00～1.30，靜置10～20小時，過濾，用堿化劑調(diào)節(jié)pH6.0～8.0，用乙酸乙酯或三氯甲烷萃取。濃縮乙酸乙酯或三氯甲烷液，所得膏用柱層析用硅膠或中性氧化鋁為填料，溶劑汽油-丙酮-二乙胺、石油醚-丙酮-二乙胺或者環(huán)己烷-丙酮-二乙胺中的任意一種為洗脫，薄層層析時時檢查收集液中草烏甲素，合并含草烏甲素的收集液，濃縮溶劑，甲醇或乙醇溶解，過濾，室溫結(jié)晶，過濾，用甲醇或乙醇反復(fù)洗滌結(jié)晶，即得終產(chǎn)品。本發(fā)明所得產(chǎn)品純度高，生產(chǎn)成本低，所使用有機(jī)溶劑毒性低。
文檔編號A61P25/00GK101555227SQ20091009447
公開日2009年10月14日 申請日期2009年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月19日
發(fā)明者偉 張, 澤 朱, 黃照昌, 龔云麒 申請人:昆明制藥集團(tuán)股份有限公司