專利名稱：姚虻纖維蛋白原水解酶tabfiblysin及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
-
本發(fā)明提供一種姚虻纖維蛋白原水解酶tabfiblysin及其基因和應(yīng)用，屬于 生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血栓性疾病是一類嚴重影響人類健康的疾病，尤其是心腦血管血栓栓塞性疾 病，已成為我國人口死亡的首要原因。及時給予抗栓藥物，可大大提高病人的存 活率，減輕臟器損害的程度和范圍?？顾ㄋ幬镏饕ㄈ芩ㄋ?、抗凝藥和抗血小 板藥?，F(xiàn)有的抗凝藥和抗血小板藥存在著出血、血小板減少及停藥后反彈等副作 用。因此，人們正在積極尋找著各種生物來源的高效、特異、低毒的新型抗栓藥 物。
虻科昆蟲俗稱牛虻(horsefly),隸屬于節(jié)肢動物門雙翅目短角亞目虻科， 是重要的醫(yī)學和獸醫(yī)學昆蟲。其成蟲是一種中藥材，俗稱虻蟲，具有活血化瘀， 破積痛經(jīng)的功效。其藥用歷史悠久，能為開發(fā)現(xiàn)代新藥提供靶標和啟示。與此同 時，傳統(tǒng)中藥藥物成分的復雜性及其炮制方法的局限性造成藥物活性成分不能更 好的發(fā)揮作用，因而從這些傳統(tǒng)藥物中尋找特定的活性單體化合物是中藥現(xiàn)代化 的重要內(nèi)容之一。
經(jīng)文獻檢索，未見與本發(fā)明相同的公開報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，提供一種姚虻纖維蛋白原水解酶及其 基因和應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案為
姚虻蛋白酶tabfiblysin是我們首次從姚虻唾液腺中分離得到的一種活性 蛋白質(zhì)，分子量27145.5道爾頓。其全序列一級結(jié)構(gòu)為 MTSIPVSSFLLAALVLQYATSMVNYCRLPCRGDNYHVGCGEPAYAQECGQSPRTRELL KEH脂EILSKINDVRDHVAKGSWGLPVAA脂KVVVWDAELAGLAKRHTKGCVGETHACRNTERFWLPGQLNFKYSGDKLPRIKELIDDAVKKGHLQKHNITREIIGNYRENGPNGDVKEL ALAISDRVTAVGCGLTTWQDGAKARALLTCNFSSQNTRGRPVYKIGNSPGEKCIEKDETY 認LCPATEPIDPNKSN
姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin基因的克隆包括姚虻唾液腺總RNA提取， mRNA純化，mRNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫構(gòu)建，設(shè)計引物，利用PCR方法篩選編碼基 因?；驕y序結(jié)果表明編碼唾液腺蛋白酶tabfiblysin基因由870個核苷酸組 成，自5'端至3'端序列為
atgacttccataccggtgtccagctttttacttgcggccttagtactacaatacgccact 60 agcgacgcagttaactactgtagattgccttgtcgaggggataatt已ccatgtgggctgt 120 ggtgagccagcgtatgcccaggaatgtgggcaaagtccaagaactcgcgagtt3ttg3ag 180 gagcatagaaatgag已ttttgtcgaagatc3acgatgtgcgagaccatgtggcca^ggga 240 tcatggggactaccagtggcagcccgaatgaaagttgttgtatgggatgcgga^ctcgct 300 ggtttagccsaacgacatacaaagggatgcgttggagagacacatgcgtgtcgaaacaca 360 gaacgtttctggttgccaggtcaactaaacttcaaatactccggcgacaagctaccccgc 420 attaaggaacttattgatgatgctgtcaa^aaaggccacttgcagaagcataatattacg 480 agagaaattatagggaactatagggagaatggacctaatgggg已tgtcaagga^cttgcc 540 ttggccatatctgatcgagtcaccgccgttggctgcggactaactacttggcagg已tgga 600 gcaaaggctcgcgcacttcttacgtgtaacttctcctcgcagaacactcggggtcgacct 660 gtctacaaaatcggca^tagtcctggcgaaaagtgcatcgaga^ggatga^acgtataa^ 720 aacttgtgccctgctactgaacctatcgaccctaataagtctaactagcgtcatgtatct 780 atgtatata^ataaaattgaagtgtctgtctgtaiatataaaaca^ctgtcacttattgag 840
870
本發(fā)明的姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin具有顯著的水解纖維蛋白原和抑 制血小板聚集的作用，能作為制備治療血栓性疾病藥物的被應(yīng)用。


圖l為本發(fā)明的分子篩分離圖。圖中箭頭所示為活性峰。
圖2為本發(fā)明姚虻的水解纖維蛋白原作用結(jié)果圖。圖3為本發(fā)明抑制血小板聚集作用的結(jié)果圖。
具體實施例方式
實施例一姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin基因的克隆
一、姚虻唾液腺總RNA提取
A. 活體解剖姚虻，挑取唾液腺立即放入液氮中，迅速取一定量(0. 5-2mg) 唾液腺組織，加入已預冷的Trizol提取緩沖液(美國Invitrogen 公司產(chǎn)品)，置于冰上勻漿15分鐘。
B. 加入Trizol 1/5體積的氯仿，劇烈混勻約15秒，室溫放置5分鐘， 4°C， 12000rpm離心10分鐘，取上清。
C. 上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4°C， 12000rpm離心10分
鐘，沉淀用75。/。乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為姚虻唾液腺總RNA。
二、 姚虻唾液腺mRNA的純化 姚虻唾液腺mRNA分離純化采用美國PROMEGA公司的PolyATtrac^ mRNA Isolation Systems試劑盒。
A. 取姚虻唾液腺總RNA 500yg溶于500ylDEPC水中，65。C水浴10分鐘， 加人3iil的Oligo(dT)探針和13u 1 20XSSC溶液，混勻，放置室溫 冷卻，稱為A液。
B. 磁珠(SA-PMP)的洗滌將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清， 加0. 5X SSC300ul，至磁力架吸附30秒，最后加100u10. 5XSSC懸 浮，稱之為B液。
C. 將A液加入B液中，室溫放置10分鐘， 磁力架吸附30秒，棄上清，用O. 1 XSSC洗滌4次，最后棄上清，力BlOOulDEPC水懸浮，至磁力架上吸附30 秒，將上清移至新的試管，再加入150ulDEPC水重懸，至磁力架吸附30 秒，移上清至上述試管，即為純化的姚虻唾液腺mRNA。
D. 加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5. 2，等體積異丙醇，于-70°C放置30分鐘， 4°C， 12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀溶解于10ii1 DEPC水中。
三、 姚虻唾液腺cDNA文庫構(gòu)建采用CLONTECH公司CreatorSMART cDNA Library Construction Kit質(zhì)粒c腿文庫構(gòu)建試劑盒。
A. cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)
1. 在無菌PCR管加入1 u 1姚虻唾液腺mRNA、 1 u 1 SMART IV引物、1 u 1 CDS III/3' PCR引物，力B 2ul去離子水使總體積達到5iil 。
2. 混勻并短暫離心，72°C保溫2分鐘。3. 將離心管在冰上孵育2分鐘。
4. 在離心管中加入以下試劑2.0ul 5X第一鏈緩沖、l.Oul 20mMDTT、 l.Oul 10mM dNTP混合物、l.Oul PowerScript逆轉(zhuǎn)錄酶。
5. 混合離心管中試劑并短暫離心，在42'C保溫1小時。
6. 將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。
7. 從離心管取2ixl所合成的cDNA第一鏈備用。
B. 采用長末端聚合酶鏈式反應(yīng)(LD- PCR)方法擴增第二鏈
1、 95。C預熱PCR儀。
2、 將2ul cDNA第一鏈(mRNA反轉(zhuǎn)錄)、80u 1去離子水、10ul 10X Advantage 2 PCR緩沖、2ul 50XdNTP混合物、2^1 5， PCR引物、 2ul CDS III/3' PCR引物以及2ul大腸桿菌聚合酶離心管進行反 應(yīng)。
3、 在PCR儀中按以下程序擴增95°C， 20秒鐘；22個循環(huán)95°C， 5秒 鐘，68°C, 6分鐘。
4、 循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進行抽提。
C. 大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞的制備
1. 挑取單個DH5a菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 。C 培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例l:100再接種于50ml LB培養(yǎng)液中， 37"C振蕩2小時。當ODe。。值達到0. 35時，收獲細菌培養(yǎng)物。冰浴 10min，于4。C以5000rpm離心10min，以回收細胞。
2. 每ml初始培養(yǎng)液加600ul預冷的0. lmol/LCaCl2-MgCl2溶液重懸。
3. 于4。C以5000rpm離心10min，以回收細胞。
4. 每ml初始培養(yǎng)液加60ul預冷的0. lmol/L CaCl2重懸細胞沉淀， 分裝后備用。
D. 酶切、連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
1. 在微量離心管中加入l lU Takara pMD19-T載體、4ul無指盤臭蛙 cDNA雙鏈溶液，全量為5 ul。
2. 加入5 ul (等量)的連接酶緩沖混合物。
3. 16'C反應(yīng)2小時。
4. 全量(10 ul)加入至100p1 DH5a感受態(tài)細胞中，冰浴30分鐘。
5. 42'C加熱90秒鐘后，再在冰中放置l分鐘。
6. 加入37'C溫浴過的LB培養(yǎng)基900 u 1， 37'C緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘。
7. 取200 u 1涂布于含有X-Gal、 IPTG、 A即的LB培養(yǎng)基上37。C培養(yǎng)16 小時，形成單菌落。
78.每個LB平皿用5ml LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30%甘油凍存。構(gòu)建 的cDNA大約含l X 106個單獨克隆。 四、姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin基因序列測定和結(jié)果
根據(jù)分離純化所得姚虻蛋白酶tabfiblysin的內(nèi)肽氨基酸序列和雙翅目昆蟲
密碼子的偏嗜性，我們設(shè)計了一條簡并引物NT3-F21，與構(gòu)建姚虻唾液腺cDNA文
庫時所使用的接頭引物CDSIII配對，正反向引物序列為
NT3-F21:5， _Tac tcc gg(g/c) gac aa(a/g) ct(g/a) cc(c/g) cgc-3，；
CDSIII-primer: 5， _att cta gag gcc gag gcg gcc atg-3，
以NT3-F21和3'PCR為引物，在我們己經(jīng)構(gòu)建好的姚虻唾液腺cDNA文庫中篩選插
入了編碼tabfiblysin的cDNA序列的克隆。
根據(jù)測得的成熟蛋白的核苷酸序列設(shè)計反向引物和所構(gòu)建的cDNA文庫克隆 的5'端保守序列為正向引物，正反向引物序列分別為 5， primer: 5， _aag cag tgg tat caa cgc aga gt-3， NT3-R21: 5， -(c/g)gg ( t/c)ag (c/t)tt gtc (g/c)cc gga gta-3，
以我們所構(gòu)建的姚虻唾液腺cDNA為模板，進行PCR。所獲陽性單克隆核苷酸 序列測定。測序結(jié)果表明編碼tabfiblysin的cDNA序列由871個核苷酸組成，自
5'端至3'端序列為
atgacttccataccggtgtccagctttttacttgcggccttagtactacaatacgcc MTSIPVSSFLLAALVL(3YA actagcgacgcagttaactactgtagattgccttgtcgaggggataattsccatgtgggc
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實施例二制備姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin:
一、 姚虻唾液腺的解剖，勻漿與處理
姚虻解剖的方法如下用小剪刀將蟲體沿背中線剪開，放入4'C含0. 15MNaCl pH7.2的0.01M磷酸鹽緩沖液中浸泡，挑取唾液腺，放入含上述緩沖液的燒杯中 存于-20°C，解剖完畢后10000rpm離心10min，上清繼續(xù)存放于-20°C，沉淀用玻 璃勻漿器在冰上充分勻漿后10000rpm/min離心10min，合并兩次離心上清，凍干 并取部分樣品水溶后用S印hadex G-25脫鹽，凍干。
二、 分離純化的每一個步驟都用水解纖維蛋白原檢測方法進行活性跟蹤。
第一步，S印hadexG-75凝膠過濾姚虻唾液腺勻漿液凍干粉溶解于O. 05M Tris-HCl+O. 1M NaCl， pH7. 2的緩沖液，上樣于S印hadex -75( Pharmacia 產(chǎn)品)凝膠過濾柱(lOOOmra長，26mm直徑)，用同樣緩沖液洗脫，收集活性成分。
第二步，F(xiàn)PLC Resource S離子交換層析S印hadex G-75凝膠過濾得到 的活性成分峰，凍干溶解于水，于0.05M Tris-HCl pH 8.3緩沖液透析12 hr; 上樣于Resource S柱，用一個O-O. 5M NaCl的線性梯度進行洗脫，純化得到纖維 蛋白原水解酶。該步操作在AKTA Purifier FPLC系統(tǒng)中進行。
實施例三姚虻唾液腺蛋白酶的藥理實驗
一、纖維蛋白原水解活性檢測
取10uL濃度為2mg/mL的纖維蛋白原(溶于含有150mM NaCl的50mM Tris-HCl， pH7. 4緩沖液)與樣品于37。C保溫24hr后，進行12% SDS-PAGE還原電泳分析。
二、 血小板聚集抑制實驗
富血漿小板聚集(PRP)抑制實驗健康人血小板用血漿稀釋至2. 5X 108個 /mL。取富血漿血小板300 uL，加入適量樣品保溫5min后，添加ADP誘導聚 集，記錄5 min血小板聚集情況。 聚集抑制率(I)的計算 I=B/AX100%
八=激動劑所能達到的最大聚集(本文為透光率，％); 8=樣品作用后加入激動劑所能達到的最大聚集。
三、 出血活性檢測
將樣品溶解到生理鹽水中，對小白鼠進行皮下注射，24小時后，剝離小鼠 皮膚，觀察內(nèi)皮出血斑的大小。以生理鹽水做對照。
姚虻唾液腺蛋白酶的藥理實驗表明姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin具有顯
著的水解纖維蛋白原和抑制血小板聚集的作用。姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin 能作為制備治療血栓性疾病藥物的被應(yīng)用。
10姚虻纖維蛋白原水解酶tabfiblysin及其基因和應(yīng)用.ST25 SEQUENCE LISTING
<110〉中國科學院昆明動物研究所
<120〉姚虻纖維蛋白原水解酶tabfiblysin及其基因和應(yīng)用
<130〉 1
<160> 2
<170> Patentln version 3. 3
<210〉 1
<211〉 872
<212〉 靈
<213〉 Talmcus yao Macquart
<400> 1
atgacttccataccggtgtccagctttttacttgcggcctatacgccact60
agcgacgcagttaactactgtagattgccttgtcgaggggat aat t ac c atgtgggctgt120
ggtgagccagcgtatgcccaggaatgtgggcaaagtccaagaactcgcgagttattgaag180
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<210> 2 <211> 255 <212> PRT
<213> Tabacus yao Macquart <400〉 2
Met Thr Ser lie Pro Val Ser Ser Phe Leu Leu Ala Ala Leu Val Leu 15 10 15
Gin Tyr Ala Thr Ser Asp Ala Val Asn Tyr Cys Arg Leu Pro Cys Arg 20 25 30
Gly Asp Asn Tyr His Val Gly Cys Gly Glu Pro Ala Tyr Ala Gin Glu 35 40 45
Cys Gly Gin Ser Pro Arg Thr Arg Glu Leu Leu Lys Glu His Arg Asn 50 55 60姚虻纖維蛋白原水解酶tabf iblysin及其基因和應(yīng)用.ST25
Glu lie Leu Ser Lys lie Asn Asp Val Arg Asp His Val Ala Lys Gly
65
70
75
80
Ser Trp Gly Leu Pro Val Ala Ala Arg Met Lys Val Val Val Trp Asp 85 90 95
Ala Glu Leu Ala Gly Leu Ala Lys Arg His Thr Lys Gly Cys Val Gly 100 105 110
Glu Thr His Ala Cys Arg Asn Thr Glu Arg Phe Trp Leu Pro Gly Gin 115 120 125
Leu Asn Phe Lys Tyr Ser Gly Asp Lys Leu Pro Arg lie Lys Glu l>eu 130 135 140
lie Asp Asp Ala Val Lys Lys Gly His Leu Gin Lys His Asn lie Thr
145
150
155
160
Arg Glu lie lie Gly Asn Tyr Arg Glu Asn Gly Pro Asn Gly Asp Val 165 170 175
Lys Glu Leu Ala Leu Ala lie Ser Asp Arg Val Thr Ala Val Gly Cys 180 185 190
Gly Leu Thr Thr Trp Gin Asp Gly Ala Lys Ala Arg Ala Leu Leu Thr 195 200 205
Cys Asn Phe Ser Ser Gin Asn Thr Arg Gly Arg Pro Val Tyr Lys lie 210 215 220
Gly Asn Ser Pro Gly Glu Lys Cys lie Glu Lys Asp Glu Thr Tyr Lys
225
230
235
240
Asn Leu Cys Pro Ala Thr Glu Pro lie Asp Pro Asn Lys Ser Asn 245 250 25權(quán)利要求
1、姚虻蛋白酶tabfiblysin，其特征在于姚虻蛋白酶tabfiblysin是從姚虻唾液腺中分離得到的一種活性蛋白質(zhì)，分子量27145.5道爾頓，其全序列一級結(jié)構(gòu)為MTSIPVSSFLLAALVLQYATSDAVNYCRLPCRGDNYHVGCGEPAYAQECGQSPRTRELLKEHRNEILSKINDVRDHVAKGSWGLPVAARMKVVVWDAELAGLAKRHTKGCVGETHACRNTERFWLPGQLNFKYSGDKLPRIKELIDDAVKKGHLQKHNITREIIGNYRENGPNGDVKELALAISDRVTAVGCGLTTWQDGAKARALLTCNFSSQNTRGRPVYKIGNSPGEKCIEKDETYKNLCPATEPIDPNKSN
2、姚虻蛋白酶tabfiblysin基因，其特征在于該基因由871個核苷酸組成，自 5'端至3'端序列為atgacttccataccggtgtccagctttttacttgcggccttagtactacaatacgccact agcgacgcagttaactactgtagattgccttgtcgaggggataattaccatgtgggctgt ggtgagccagcgtatgcccaggaatgtgggcaaagtccaagaactcgcgagttattgaag gagcatagaaatgagattttgtcgaagatcaacgatgtgcgagaccatgtggccaaggga tcatggggactaccagtggcagcccgaatgaaagttgttgtatgggatgcggaactcgct ggtttagccaaacgacatacaaagggatgcgttggagagacacatgcgtgtcgaaacaca gaacgtttctggttgccaggtcaactaaacttcaaatactccggcgacaagctaccccgc attaaggaacttattgatgatgctgtcaaaaaaggccacttgcagaagcataatattacg agagaaattatagggaactatagggagaatggacctaatggggatgtcaaggaacttgcc ttggccatatctgatcgagtcaccgccgttggctgcggactaactacttggcaggatgga gcaaaggctcgcgcacttcttacgtgtaacttctcctcgcagaacactcggggtcgacct gtctacaaaatcggcaatagtcctggcgaaaagtgcatcgagaaggatgaaacgtataaa aacttgtgccctgctactgaacctatcgaccctaataagtctaactagcgtcatgtatct atgtatataaataaaattgaagtgtctgtctgtaatataaaacaactgtcacttattgag
3、姚虻蛋白酶tabfiblysin的應(yīng)用，其特征在于姚虻蛋白酶tabfiblysin 能水解纖維蛋白原和抑制血小板聚集，且無出血活性，能作為制備治療血栓性疾 病藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin及其基因和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的姚虻蛋白酶tabfiblysin是從姚虻唾液腺中分離得到的一種活性蛋白質(zhì)，分子量27145.5道爾頓，其全序列由255個氨基酸組成；姚虻蛋白酶tabfiblysin基因由871個核苷酸組成。本發(fā)明的姚虻唾液腺蛋白酶tabfiblysin具有顯著的水解纖維蛋白原和抑制血小板聚集的作用，能作為制備治療血栓性疾病藥物的應(yīng)用。
文檔編號A61K38/48GK101608176SQ20091009468
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月2日
發(fā)明者仞 賴, 馬冬瑩 申請人:中國科學院昆明動物研究所