專利名稱：桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物在制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物，具體涉及桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物組分 和在制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物中的新用途，以及以該化合物為活性成分的用于制備抑 制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物組合物。
背景技術(shù)：
近年來，國內(nèi)外大量流行病學(xué)研究表明高尿酸血癥/痛風(fēng)的患病率正逐年升高，高尿酸血 癥不僅誘發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、尿石癥、尿酸性腎病，而且血尿酸水平升高與脂質(zhì)代謝異常、肥 胖等疾病密切相關(guān)，高尿酸血癥/痛風(fēng)已成為威脅人類健康的重要疾病。尿酸排泄減少和/或生 成增加是原發(fā)性高尿酸血癥的主要病因。嘌呤代謝過程中關(guān)鍵酶的缺陷所導(dǎo)致的嘌呤利用障 礙和/或嘌呤氧化酶的活性增強(qiáng)是尿酸生成增加的主要原因，腎近端小管對(duì)尿酸的重吸收增加 和/或分泌減少是尿酸排泄減少的主要原因。尿酸排出減少或生成增加，可導(dǎo)致血液中尿液濃 度增高，直接或間接引起相關(guān)疾病。尿酸的排泄是一復(fù)雜過程，尿酸隨血液循環(huán)流入腎小球
時(shí)，游離型的尿酸將全部濾過，在近端腎小管約99%尿酸鹽被重吸收。
研究表明尿酸排泄過程受多種基因和表達(dá)產(chǎn)物共同調(diào)控，是一個(gè)復(fù)雜過程。由于尿酸帶 負(fù)電荷，不能自由通過細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層，因此腎小管對(duì)尿酸的排泄依賴于離子通道。有學(xué)者 發(fā)現(xiàn)，有一些尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了近曲腎小管對(duì)尿酸鹽的重吸收和主動(dòng)分泌。而且有研究 發(fā)現(xiàn)，通過腎皮質(zhì)細(xì)胞膜的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)有兩種方式:一種是通過電中性的陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體與一系列 有機(jī)和無機(jī)陰離子的交換來轉(zhuǎn)運(yùn)尿酸鹽；另一種是通過產(chǎn)電的尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體，它是一種單向 轉(zhuǎn)運(yùn)體。近年來,已從分子水平證實(shí)4種蛋白質(zhì)參與了尿酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)電的尿酸鹽單向轉(zhuǎn)運(yùn) 體(UAT);有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(OAT)家族的兩種蛋白OATl(Ichida K, Hosoyamada M, Kimura H， etal. Urate transport via human PAH trans porter hOATl and its gene structure [ J ]. Kid ney Int, 2003, 63: 143-155)和OAT3(Cha SH, Sekine T, Fukushima J I, et al. Identification and characterization of human organic anion transporter 3 exp ressing predominantly in the kidney[ J ]. Mol Pharmacol, 2001, 59: 1277-1286)參與了尿酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)；與OAT4有部分同源性的蛋白質(zhì),命 名為人尿酸鹽陰離子交換器(URAT1),已證實(shí)它主要參與尿酸的重吸收(Enomoto A, KimuraH， Chairoungdua A, et al. Molecular identification of a renal urate anion exchanger that regulates blood urate levels[ J ]. Nature, 2002, 417: 4472452.)。
桑枝(Ramulus mori)是桑科植物桑(Morus alba L.)的一年生干燥嫩枝，作為民間常用中草 藥，中國藥典記載桑枝具有祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)、行水之功效，適用于風(fēng)寒濕痹、四肢拘攣、腳
氣浮腫之病癥。其所含化學(xué)成分種類較多，主要有多糖、黃酮類化合物、香豆素類化合物、生物堿，此外還含有揮發(fā)油、氨基酸、有機(jī)酸及各種維生素等。另有報(bào)道桑枝中含有二苯乙 烯類化合物桑皮苷。雖然桑枝有較好的臨床基礎(chǔ)，但一直沒有找到適當(dāng)?shù)某煞诌M(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物的新用途，具體的說是提供桑枝黃 酮和二苯乙烯類提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和在制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物中的應(yīng)用，以及以該 化合物為活性成分的用于制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物組合物。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案之一桑枝通過水醇法，大孔吸附樹脂柱洗脫得到的桑枝黃酮和 二苯乙烯類提取物，以Quercetin-3-0-p-D-mannopyranoside為對(duì)照品經(jīng)紫外分光光度法和 HPLC法分別測得黃酮類化合物重量比含量為30X-70。/。；以桑皮苷為對(duì)照品經(jīng)紫外分光光度 法和HPLC法分別測得二苯乙烯類化合物重量比含量為30 % -70°/o。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案之一提供桑枝黃酮和一苯乙烯類提取物在制備抑制尿酸重吸收 轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物中的新用途，以及以該化合物為活性成分和藥學(xué)上可接受的載體的用于制備抑制 尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物組合物。包括了以本發(fā)明所述的桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物，配以
常用的藥用輔料(如賦形劑、助溶劑、控釋劑)，制成各種劑型包括口服液、注射劑、膠囊
劑、片劑、顆粒劑、微囊劑，用于制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物。
上文所述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑如 水等，填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮； 濕潤劑如廿油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面活性劑 如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、聚乙一 醇等。另外還可以組合物屮加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明化合物可以組合物的形式通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用于需 要這種治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、顆粒劑、膠囊劑等， 制成液體制劑如水或油懸浮劑或其它液體制劑如糖漿、酏劑等；用于腸胃外給藥時(shí)，可將其 制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。優(yōu)選的形式是片劑、膠囊劑、栓劑、鼻噴霧劑和注 射劑，特別優(yōu)選在腸道的特定部位釋放的制劑。
本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使活性成分 與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。
本發(fā)明化合物的使用量可根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療疾病的類型和嚴(yán)重 程度等變化，確定其日劑量，可以一次或多次施用。
本發(fā)明所得桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物的組分可作為臨床制劑原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，亦可 作為制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
4本發(fā)明利用高尿酸血癥動(dòng)物模型在基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平上科學(xué)地評(píng)價(jià)并確定了 桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物對(duì)尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子的抑制調(diào)節(jié)作用。
本發(fā)明所涉及的桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物對(duì)模型動(dòng)物表達(dá)異常增高的尿酸重吸收轉(zhuǎn) 運(yùn)子具有確切的抑制作用；而對(duì)正常動(dòng)物的正常水平的尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子表達(dá)無顯著抑制作 用，具有很好的安全性。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是，提供了對(duì)尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子具有確切抑制作用的桑枝黃酮和二苯乙烯 類提取物，用于制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物，可用于治療與尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子異常高表 達(dá)相關(guān)的疾病。與針對(duì)痛風(fēng)或高尿酸血癥的發(fā)明比較，本發(fā)明提供的桑枝黃酮和二苯乙烯類 提取物新用途具有三個(gè)明顯的進(jìn)步和優(yōu)點(diǎn)1、藥效成分明確(分別為黃酮類化合物重量比含 量30%-70%和二苯乙烯類化合物重量比含量為30%-70%); 2、作用靶點(diǎn)明確(尿酸重吸收轉(zhuǎn) 運(yùn)子)3、調(diào)節(jié)作用明確(抑制調(diào)節(jié))。
為更好的理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面用桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物的提取分離、藥理實(shí) 驗(yàn)及結(jié)果來說明其在制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物中的應(yīng)用。


圖1為ER對(duì)小鼠高尿酸血癥血清尿酸水平的影響結(jié)果圖2為ER對(duì)小鼠肝臟尿酸水平的影響結(jié)果圖3為ER對(duì)小鼠高尿酸血癥肝臟XOD的影響結(jié)果圖4為肝臟XOD蛋白水平結(jié)果圖5為腎臟URAT1蛋白水平結(jié)果圖6為肝臟XOD mRNA水平結(jié)果圖7為腎臟URAT1 mRNA水平結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:
桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物的制備
(1) 取干燥桑枝，熱回流三次，每次加7倍60%乙醇，每次2小時(shí)，合并提取液，濾過，
濾液經(jīng)減壓濃縮至每ml藥液含有0.5g藥材，放冷，過濾，棄去藥渣。
(2) 取濾液，按流速為14BV/h上已預(yù)處理好的HPD-600型大孔吸附樹脂柱，以2~6倍 量柱床體積的蒸餾水洗脫，流速為l-4BV/h，棄去水洗脫液，再以2—6倍量柱床體積的60% 乙醇按l一BV/h的速度洗脫，收集洗脫液，回收乙醇并濃縮至稠膏，減壓干燥，得干浸膏。
(3) 以桑皮苷為對(duì)照品，按照藥典法測定桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物中二苯乙烯類化合 物重量比含量30%-70%。(4)以Quercetin-3-O-p-D-mannopyranoside為對(duì)照品，按照藥典法測定桑枝黃酮和二苯乙 烯類提取物中黃酮類化合物重量比含量為30%-70%。 實(shí)施例2:
桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物對(duì)尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子的抑制調(diào)節(jié)作用
氧嗪酸鉀鹽是一種尿酸酶抑制劑，可誘導(dǎo)抑制尿酸分解，增加體內(nèi)血清尿酸水平，造成 高尿酸血癥動(dòng)物模型，國際上普遍用其評(píng)價(jià)藥物的抗高尿酸血癥和痛風(fēng)作用。本發(fā)明亦采用 高尿酸血癥模型動(dòng)物驗(yàn)證藥物的降尿酸療效，療效可靠，效果顯著。
具體實(shí)施例方式
1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，體重24士2g，雄性。
2. 藥物配制桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物(ER)、別嘌呤醇分散于生理鹽水中，用于灌胃 給藥，給藥劑量分別為低劑量300mg/kg、高劑量為600 mg/kg， Apu=5 mg/kg。
3. 實(shí)驗(yàn)材料HPD—600型大孔吸附樹脂，Trizol Reagment(Invigen)，氯仿，異丙醇，無水 乙醇，DEPC， M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，PCR試劑盒，RIPA裂解液，尿酸試劑盒，肌酐試劑盒。
4. 實(shí)驗(yàn)儀器高速冷凍離心機(jī)，高速勻漿機(jī)，Bio-radio-rad垂直電泳槽，MBI-PCR儀、水平 電泳槽等.
5. 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ透吣蛩嵫Y模型
6. 模型的建立動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境l周后，灌胃給予氧嗪酸鉀鹽250 mg/kg;對(duì)照給予等體積生 理鹽水，造模周期7天。
7. 給藥造模期間同時(shí)給藥，在給予氧嗪酸鉀鹽造模/生理鹽水對(duì)照lh后，分組灌胃給予桑
枝黃酮和二苯乙烯類提取物(ER)兩個(gè)劑量300 mg/kg、600 mg/kg，別嘌呤醇(Apu)5 mg/kg，
對(duì)照組給予生理鹽水。
8. 小鼠處死及組織的保存小鼠灌胃給予桑皮苷/生理鹽水后lh處死，取血、尿液，冰臺(tái)上 分離肝臟、腎臟組織，組織經(jīng)液氮冷凍后保存于-8(TC，待測。
9. 蛋白質(zhì)印跡法(Western-blotting):提取小鼠肝臟、腎臟組織刷狀緣膜蛋白，提取蛋白經(jīng)12 %的SDS-PAGE膠電泳分離后，PVDF轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉1小時(shí)后加入mURATl抗體(根 據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫mURATl蛋白序列制備，使用濃度為1:4000)4。C孵育過夜，二抗(1:4000) 室溫?fù)u床孵育l小時(shí)，HRP-ECL發(fā)光，暗室曝光顯影。膠片掃描后對(duì)圖片灰度分析。
11.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR):鼠組織(肝臟或腎臟)O.lg加入lml的Trizol Reagent (Invitrogen)，按照試劑盒的要求提取RNA， RNA逆轉(zhuǎn)錄到cDNA模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù) 庫mURATl基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行mURATl目的基因擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后 UV成像，對(duì)圖片進(jìn)行灰度分析。12.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
(1) ER對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響，結(jié)果見圖l。
+++P < 0.001, ++P < 0.01, +P < 0.05與空白組比較；***P < 0週,"P < 0.01, *P < 0.05與模型
組比較
(2) ER對(duì)小鼠肝臟尿酸水平的影響，結(jié)果見圖2。 +++P < 0.001, ++P < 0.01, +P < 0.05與空白組比較；***P < 0.001,**P < 0.01， *P < 0.05與模型
組比較
(3) ER對(duì)小鼠高尿酸血癥肝臟XOD的影響，結(jié)果見圖3。
+++P < 0.001, ++P < 0.01, +P < 0.05與空白組比較；***P < 0.001，**P < 0.01, *P < 0.05與模型
組比較
(4) 蛋白質(zhì)印跡法Western-blotting
a. 肝臟XOD蛋白水平，結(jié)果見圖4。
b. 腎臟URAT1蛋白水平，結(jié)果見圖5。
+++P < 0.001, ++P < 0.01, +P < 0.05與空白組比較；***P < 0.001,**P < 0.01, *P < 0.05與模型
組比較
(5) 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)
a. 肝臟XOD mRNA水平，結(jié)果見圖6。
b. 腎臟URAT1 mRNA水平，結(jié)果見圖7。
+++P < 0.001, ++P < 0.01， +P < 0.05與空白組比較；***P < 0.001,**P < 0.01, *P < 0.05與模型
組比較
結(jié)果桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物可顯著降低高尿酸血癥模型下動(dòng)物血清尿酸水平、 肝臟尿酸水平，而對(duì)正常動(dòng)物血清尿酸水平和肝臟尿酸水平無顯著影響，表明桑枝黃酮和二 苯乙烯類提取物可安全有效地治療和預(yù)防高尿酸血癥和痛風(fēng)。桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物
能顯著抑制模型小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶(XOD)的活性及其mRNA和蛋白表達(dá)、腎臟mURATl mRNA和蛋白表達(dá)，表明桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物的降尿酸作用與其抑制XOD活性和 抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子mURATl mRNA和蛋白表達(dá)有關(guān)，以降低高尿酸血癥動(dòng)物尿酸合成和 增加排泄，達(dá)到降尿酸作用。表明桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物可用來制備抑制尿酸重吸收 轉(zhuǎn)運(yùn)子mURATl藥物。
權(quán)利要求
1. 桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物在制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物在制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物 中的應(yīng)用，其特征在于，所述的桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物中黃酮類化合物重量比含量 為30%-70%， 二苯乙烯類化合物重量比含量30%-70%。
3. 用于制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物組合物，其中含有制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物有 效量的權(quán)利要求1或2所述的桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物和藥學(xué)上可接受的載體；用 該組合物作為藥效成分來制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物制劑，可單獨(dú)或與制藥可接受的 賦形劑等結(jié)合，按照常規(guī)方法制成口服液、膠囊劑、片劑、顆粒劑、靶向制劑等劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開了桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物的組分和新用途。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物對(duì)高尿酸血癥模型動(dòng)物表達(dá)異常增高的尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子具有確切的抑制作用，而對(duì)正常動(dòng)物正常水平的尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子表達(dá)無顯著抑制作用，具有很好的安全性。利用桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物配以相關(guān)藥用輔料，用常規(guī)的制劑方法可制成抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子的藥物，以及以該化合物為活性成分的用于制成抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子的藥物組合物，可用于治療與尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子異常高表達(dá)相關(guān)的疾病。
文檔編號(hào)A61P19/06GK101502563SQ200910095840
公開日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2009年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月12日
發(fā)明者孔令東, 憲 張, 星 王, 王彩萍, 胡季強(qiáng), 胡林水, 珺 鄭, 黃正標(biāo) 申請(qǐng)人:浙江康恩貝制藥股份有限公司;南京大學(xué)