專利名稱：一個木質(zhì)素二氫黃酮醇在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一個木質(zhì)素二氫黃酮
醇衍生物即式(I)化合物，(±)~2-[2,3-二氫-2-(3,5-二甲氧基-一羥基苯基)-3-羥甲基—1，4苯并二氧六環(huán)—5]—2，3—二氫—3,5,7—三羥基~4 7—1-苯并吡喃~4—酮 或其可藥用鹽用于制備抑制單純皰疹病毒藥物或用于制備抗流感病毒藥物的
用途。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒直徑約為120-150微米，含有DNA的核位于中間，向外 依次由包膜、體被、衣殼三種同心結(jié)構(gòu)組成，衣殼表面為162個殼微粒組成 的3 : 3 : 2軸對稱的20面體，在低溫下可生存數(shù)月，濕熱50。C及干燥90。C 30 分鐘滅活。單純皰疹病毒可分為I型和II型二種，I型皰疹病毒(HSV-1) 主要感染腰以上部位的皮膚粘膜和器官，HSV-1主要通過呼吸道、皮膚和粘 膜密切接觸傳播，99%的口唇粘膜、鼻前庭、眼結(jié)膜、咽喉部的炎癥及皰疹， 口和口周圍發(fā)生的皰疹都是由I型皰疹病毒感染引起的。II型皰疹病毒 (HSV-2)主要存在于女性宮頸、陰道、外陰皮膚及男性的陰莖、尿道等處， 是引起生殖器發(fā)炎和皰疹的罪魁禍?zhǔn)住?br> 口腔潰瘍易反復(fù)發(fā)作，目前尚無特效治療方法，臨床上主要的治療措施 包括局部治療和全身治療，西醫(yī)治療以局部用碘甘油及維生素B1、 B2和維 生素C口服， 一般療效不甚明顯。嚴(yán)重、頑固的口腔潰瘍則需內(nèi)服激素類藥 品、抗菌素類藥品等，使用此類藥物又存在較大的毒副作用和易使病人產(chǎn)生 耐藥性和菌群失調(diào)的不足之處。中藥外用藥包括錫類散、冰硼散等外用制劑， 但治療效果不十分理想；內(nèi)服藥包括牛黃解毒丸、牛黃上清丸等，但對本病 癥無顯著的針對性。近期出現(xiàn)的不少新的口腔含片類藥物制劑如西瓜霜含片、 華素片和溶菌酶含片等分別在口感、殺菌、抗炎方面有所進(jìn)步，但是有些又 不適于哺乳期婦女、甲狀腺功能亢進(jìn)患者和碘過敏者。因此，應(yīng)用現(xiàn)代病毒 藥理學(xué)技術(shù)、發(fā)掘出治療口腔潰瘍的創(chuàng)新型藥物是迫在眉睫的。
HSV-2病毒經(jīng)性器官接觸后，潛伏約2-20天(平均6天)，HSV-2感染引起的生殖器皰疹臨床表現(xiàn)中可分為原發(fā)和復(fù)發(fā)兩種，患病部位先有燒灼感，
很快在紅斑基礎(chǔ)上發(fā)生3-IO個成群的紅色丘疹，伴有瘙癢，丘疹很快變成小 水皰，3-5天后變?yōu)槟摪挘茲⒑笮纬纱笃拿訝€和潰瘍，自覺疼痛，最后 結(jié)痂愈合。整個病程可持續(xù)20天左右。男性好發(fā)于龜頭、冠狀溝、尿道口、 陰莖、陰囊、大腿和臂部等處。女性好發(fā)于陰唇、陰阜、陰蒂、肛周或陰道; 約90%的病人，病毒可同時侵犯子宮頸，出現(xiàn)陰道分泌物增多或下腹痛，并 可并發(fā)宮頸炎和子宮炎。大多數(shù)男女病人雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)腫大。后期炎癥 波及尿道、膀胱時，可出現(xiàn)排尿困難、尿痛、尿頻、嚴(yán)重者可發(fā)生尿潴留等 現(xiàn)象。此外，還可能有其它癥狀同時出現(xiàn)，如發(fā)熱、全身不適、頭痛、頸項(xiàng) 強(qiáng)直、腦膜炎和骶部神經(jīng)系統(tǒng)功能不全。
生殖器皰疹病毒與生殖器惡性腫瘤關(guān)系密切，引起生殖器皰疹的II型皰 疹病毒可能是宮頸癌的潛在致癌因子。研究發(fā)現(xiàn)，患過生殖器皰疹的婦女比 未患過者得宮頸癌的危險(xiǎn)性大5-10倍，并且，在宮頸癌組織、剝脫細(xì)胞或癌 前期細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 II型皰疹病毒特異抗原，從而表明II型皰疹病毒在宮頸癌 的發(fā)生過程中起了重要作用。另外，從陰莖癌病人的活檢材料中也觀察到單 純皰疹病毒樣顆粒。此外，近年來人們也注意到孕婦感染II型皰疹的嚴(yán)重性 對妊娠的患者或無癥狀排毒來說，最嚴(yán)重的是傳染給新生兒，孕婦患生殖器 皰疹可導(dǎo)致胎兒畸形、流產(chǎn)、死產(chǎn)。
對HSV-2感染引起的病毒性疾病目前尚無特效治療方法，臨床上主要 的治療措施為采用阿昔洛韋等抗病毒藥物。此外，人白細(xì)胞干擾素也可抑制 病毒繁殖，減少生殖器皰疹的復(fù)發(fā)率。然而使用此類激素類藥品、抗菌素類 藥品藥物存在較大的毒副作用和易使病人產(chǎn)生耐藥性和菌群失調(diào)的不足之 處。
中醫(yī)將II型單純性皰疹感染疾病稱為"陰瘡"，其病性早期屬熱證、實(shí) 證，為濕熱、毒火阻滯肝脈；后期則伴有肝腎不足。中藥外用藥包括外用1% 氯鋅油，紫草油等方法，但治療效果不十分理想；常用方藥為清毒神圣湯加 減、牛黃解毒丸、六味地黃丸加減和龍膽瀉肝湯等，但對本病癥無顯著的針 對性。
因此，應(yīng)用現(xiàn)代病毒藥理學(xué)技術(shù)、利用現(xiàn)代藥物化學(xué)手段，尋找創(chuàng)新性 的先導(dǎo)化合物骨架，開發(fā)出既能夠避開核苷類抗病毒藥物的副作用又能夠有 效抑制病毒的新型治療II型單純皰疹病毒感染暨防治生殖器皰疹藥物是十分 必要的。此外，流感病毒具有高度傳染性，所以極易發(fā)生流行，甚至是世界范圍
的大流行。我國也是流感多發(fā)地，自1957年以來的3次世界性大流行都起源 于我國。流感病毒屬正粘液病毒科，流感病毒屬，包括甲、乙、丙三型，甲 型抗原變異性最強(qiáng)，感染人類和其他動物，引起中、重度疾病，侵襲所有年 齡組人群，常引起世界性大流行。由于流感病毒疫苗應(yīng)用上的一些限制，以 及該疫苗對臨床流感患者無效等因素，抗病毒藥物治療在流感的控制中仍然 起著十分重要的作用?？共《舅幬锔鶕?jù)它們針對病毒復(fù)制的不同環(huán)節(jié)可分為 離子通道M2阻滯劑、神經(jīng)氨酸酶抑制劑、流感病毒受體阻斷劑和抗流感病 毒反義寡核苷酸等。目前進(jìn)入臨床應(yīng)用的主要為離子通道M2阻滯劑和神經(jīng) 氨酸酶抑制劑。離子通道M2阻滯劑主要有兩種金剛烷胺和金剛乙胺。他 們均可產(chǎn)生顯著的胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)副反應(yīng)，如神經(jīng)質(zhì)、焦慮、注意力 不集中、頭痛、惡心和嘔吐等。這些副作用一般較輕，多在用藥后幾小時內(nèi) 出現(xiàn)，停藥后大多可迅速消失。由于離子通道M2阻滯劑對B型流感病毒缺 乏活性，易產(chǎn)生耐藥性，并且耐受性差，故它們沒有被廣泛應(yīng)用。神經(jīng)氨酸 酶抑制劑目前進(jìn)入臨床應(yīng)用的神經(jīng)氨酸酶抑制劑有扎那米韋和奧司他韋， 但至今為止尚未發(fā)現(xiàn)治療流感病毒感染疾病的特效藥物。
同理，從天然藥物模板中尋找并優(yōu)化新型抗流感先導(dǎo)化合物也是十分迫 切的任務(wù)。以陽性藥物利巴韋林(病毒唑)為對照，測試化合物對狗腎傳代 細(xì)胞(MDCK)感染流感病毒IVA (甲型流感病毒)的保護(hù)作用是篩選抑制 流感病毒藥物先導(dǎo)化合物的一個明確而必要的手段。
黃酮木脂素化合物屬于雜木質(zhì)素類，是由一分子苯丙素和一分子黃酮結(jié) 合而成的一類含有C6-C3-C6-C3-C6結(jié)構(gòu)單元的天然產(chǎn)物。其代表性化合物 當(dāng)屬存在于菊科植物水飛薊的種子中的木質(zhì)素二氫黃酮醇水飛薊賓。水飛薊 已在臨床上廣泛應(yīng)用，在市場上其商品名為LegalonTM利肝隆或FlaVObk>nTM。 三十多年的臨床實(shí)驗(yàn)證明該藥具有確切的療效和低毒性(參閱FloraK.等人， Am. J. Gastroenterol, 1998， 93， 139—143; Sailer R.等人，Drugs, 2001,61(14), 2035-2063)。因此，以水飛薊賓為代表的黃酮木脂素類化合物引起了越來越 多的關(guān)注，如發(fā)明人于2006年制備并報(bào)道的一系列水飛薊賓類衍生物也具有 顯著的抗氧化活性(楊雷香、趙昱等，"Synthesis and Antioxidant Properties Evaluation of Novel Silybin Analogues", Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2006, 21(4), 399—404)。
水飛薊賓類化合物具有以上所述之確切的多種療效，然而其于抗病毒方面包括抑制單純皰疹病毒、抑制流感病毒的新用途尚未得到有效開發(fā)，故此
我們制備了與水飛薊賓結(jié)構(gòu)有所差異的新的衍生物，也即在黃酮母體B環(huán)引 入駢合位置不同的二氧六環(huán)取代基，由此便形成了一些新穎結(jié)構(gòu)的木質(zhì)素二 氫黃酮醇類化合物。針對前述水飛薊賓衍生物可能的抗病毒應(yīng)用，我們測試 了其抑制I型單純皰疹病毒HSV-1、II型單純皰疹病毒HSV-2以及抑制流感 病毒IVA (FM-1株)復(fù)制的藥理活性，以期最終獲取能夠有效抑制上述病 毒感染之自主知識產(chǎn)權(quán)的化學(xué)實(shí)體。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中合成得到的木 質(zhì)素二氫黃酮醇類化合物即(土)-2-[2,3-二氫-2-(3,5-二甲氧基~4~羥基苯 基)-3-羥甲基-1，4苯并二氧六環(huán)-5]-2，3-二氫-3,5,7-三羥基~4^-1-苯并吡喃 "4-酮對HSV-1、 HSV-2以及FM-1病毒株均具有確切的抑制活性，可以作 為廣譜抗病毒藥物先導(dǎo)化合物繼續(xù)開發(fā)，從而完成本發(fā)明。
本發(fā)明的目的在于提供一個具有式(I)結(jié)構(gòu)的木質(zhì)素二氫黃酮醇類化合 物即(±)~2-[2,3-二氫-2~(3，5-二甲氧基-4^羥基苯基)-3-羥甲基-1，4苯并二氧 六環(huán)-5]—2，3-二氫—3,5，7-三羥基4//—1—苯并吡喃~4—酮或其可藥用鹽在制備 防治由單純皰疹病毒HSV-1引發(fā)的病毒感染和/或口腔潰瘍藥物的用途。
本發(fā)明的再一個目的是提供了一種用于防治由單純皰疹病毒HSV-1引 發(fā)的病毒感染和/或口腔潰瘍的藥物或藥物組合物，其含有治療有效量的作為 活性成分的式(I)化合物或其可藥用鹽和可藥用輔料。根據(jù)本發(fā)明，該藥物 組合物中可加入各種藥學(xué)上可接受的藥用賦形劑，添加劑及載體。
本發(fā)明的又一個目的是提供了式(I)化合物用于制備防治由II型單純 皰疹病毒HSV-2引發(fā)的生殖器皰疹病毒感染藥物的用途。
本發(fā)明的另一個目的是提供了一種用于防治由II型單純皰疹病毒

發(fā)明內(nèi)容
式(I)HSV-2引發(fā)的生殖器皰疹的藥物或藥物組合物，其含有治療有效量的作為活 性成分的式(I)化合物或其可藥用鹽和可藥用輔料。根據(jù)本發(fā)明，該藥物組 合物中可加入各種藥學(xué)上可接受的藥用賦形劑，添加劑及載體。
本發(fā)明的再一個目的是提供了式(I)化合物用于制備防治由流感病毒 IVA引發(fā)的病毒性感冒藥物的用途。
本發(fā)明的另一個目的是提供了一種用于防治由流感病毒IVA引發(fā)的病 毒性感冒藥物或藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的式(I)化 合物或其可藥用鹽和可藥用輔料。根據(jù)本發(fā)明，該藥物組合物中可加入各種 藥學(xué)上可接受的藥用賦形劑，添加劑及載體。
本發(fā)明的又一個目的是提供了一種通過化學(xué)合成方法制備式(I)化合物 的方法。該方法的合成工藝路線特征是以化合物2，4,6-三甲氧甲氧基苯乙 酮(1)和1，2-二甲氧甲氧基苯甲醛(2)為起始原料，在有機(jī)溶劑和堿水溶 液中縮合得到査耳酮(3)，在堿性過氧化氫的作用下環(huán)氧化得到環(huán)氧査耳酮 (4)，(4)在酸性有機(jī)溶劑中環(huán)合得到二氫黃酮醇(±)"2-(2,3—二羥基苯基)2,3— 二氫-3,5,7-三羥基~4/7-1-苯并吡喃4-酮(5);在催化劑銀鹽催化下，(5) 與3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂醇(6)進(jìn)行自由基偶聯(lián)反應(yīng)生成化合物 (±)-2-[2,3-二氫-2-(3,5-二甲氧基-4"羥基苯基)-3-羥甲基-1,4苯并二氧六環(huán) -5]-2,3-二氫-3,5,7-三羥基-4i/-l-苯并吡喃4-酮，具體流程如下所示
OH 、其中，OMOM是指甲氧甲氧基。
本發(fā)明的特點(diǎn)是，經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)證明全合成得到的木質(zhì)素二氫黃酮醇類
化合物即式(I)化合物(士卜2-[2，3-二氫-2-(3,5-二甲氧基~4-羥基苯基)-3-羥 甲基_1，4 苯并二氧六環(huán)-5]—2,3—二氫一3,5，7-三羥基一4//—1—苯并吡喃~4—酮 對I型單純皰疹病毒HSV-1、 II型單純皰疹病毒HSV-2以及流感病毒IVA (FM-1株)復(fù)制均有確切抑制作用，說明該化合物有望發(fā)展為廣譜抗病毒 藥物先導(dǎo)化合物及藥物。
本發(fā)明有益之處在于將天然產(chǎn)物水飛薊賓的結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到具有抑制 HSV-1病毒、HSV-2病毒和流感FM-1病毒株活性的式(I)化合物，即 (±)~2-[2,3-二氫-2-(3,5-二甲氧基"4-羥基苯基)-3-羥甲基-1,4苯并二氧六環(huán) -5]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基~4//-1-苯并吡喃4-酮，對于開發(fā)廣譜抑制病毒創(chuàng) 新型藥物提供了新的物質(zhì)基礎(chǔ)。該化合物可由簡單原料經(jīng)幾步合成改造而得， 原料來源方便易得，制備步驟簡便，成本低，產(chǎn)率較高，利于產(chǎn)業(yè)化。因此， 本發(fā)明具有潛在的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明中制備得到的木質(zhì)素二氫黃酮醇類化合物即式(I)化合物或其可 藥用鹽用制藥領(lǐng)域中的常規(guī)方法，結(jié)合中、西藥制藥中常規(guī)的可藥用輔料， 可以制成各種藥物組合物，如注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、 滴丸劑、外用搽劑，或控釋或緩釋劑型或納米制劑。這些藥物組合物可以用 于防治由單純皰疹病毒HSV-1引發(fā)的病毒感染和/或口腔潰瘍。
本發(fā)明的式(I)化合物或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的治療單純皰疹 病毒感染、口腔潰瘍的常用藥物聯(lián)合或交叉使用，制備得到具有治療單純皰 疹病毒感染、口腔潰瘍的藥物組合物或復(fù)方制劑?？山M合的藥劑例子包括阿 昔絡(luò)韋(ACV)、萬乃洛韋(VCV)、泛昔絡(luò)韋(FCV)、噴昔洛韋(PCV)、 阿糖腺苷(ara-T)、溴乙烯去氧鳥苷(BVDU)、膦甲酸(PFA)、更昔絡(luò) 韋(GCV)等。此外，其還可以與神經(jīng)痛鎮(zhèn)痛藥物以及解熱鎮(zhèn)痛藥物合并用 藥。
本發(fā)明的式(I)化合物或其可藥用鹽還可以與現(xiàn)已上市的治療單純皰疹 病毒HSV-2感染的常用藥物聯(lián)合或交叉使用，制備得到具有治療生殖器皰疹 的組合物或復(fù)方制劑。本發(fā)明的式(I)化合物或其可藥用鹽可以與藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié) 合，制備得到具有預(yù)防和治療流感病毒引起的病癥之藥物及藥物組合物。
本發(fā)明的式(I)化合物或其可藥用鹽還可以與己上市的流感病毒抑制劑 或其他治療流感相關(guān)病癥的治療藥物及其原料藥如金剛烷胺、金剛乙胺和/ 或神經(jīng)氨酸酶抑制劑如扎那米韋和奧司他韋等聯(lián)合使用或交叉使用，制備得 到具有防治流感病毒感染的藥物組合物或復(fù)方制劑。
上述各類藥物組合物或者復(fù)方制劑可以采用片劑、膠囊劑、注射劑、氣 霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑等劑型藥物，包括采用現(xiàn)已公認(rèn)的藥劑學(xué)常識經(jīng) 由常規(guī)制備而得的各種緩釋、控釋劑型或納米制劑。
下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例給出了式(I)化合物的制備 和純化方法及其相關(guān)結(jié)構(gòu)鑒定的數(shù)據(jù)。必須說明，實(shí)施例中所述的制備方法 以及分離純化方法是用于對本發(fā)明的說明而不是對本發(fā)明的限制。
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，本發(fā)明還通過實(shí)施例的方式說明式(I)
化合物對單純皰疹病毒HSV-1、 HSV-2和流感病毒IVA (FM-1株)抑制作 用的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同樣必須說明，本發(fā)明的這些藥理相關(guān)實(shí)施例仍是用于 說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的簡單 改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1:式(I)化合物(士>~2-[2，3-二氫-2H:3，5-二甲氧基^MS基苯基)-3-羥甲基-l,4 苯并二氧六環(huán)-5]-2,3-二氫-3,5,7-三羥基"4W-1-苯并吡喃~4-酮 的制備
U起始物A-2，4,6-三甲氧甲氧基苯乙酮(1)的制備
將2.6克的氫化鈉的40毫升DMF溶液冰水浴冷卻，于氮?dú)獗Ｗo(hù)狀態(tài)下 滴加5.6克2,4,6-三羥基苯乙酮的60毫升苯和7.0毫升DMF的混合溶液，冰 浴冷卻下滴加9.0毫升氯甲醚溶液，室溫下攪拌24小時。傾入100毫升10 %氫氧化鈉水溶液中，乙醚提取3次，每次50毫升，飽和碳酸氫鈉洗滌，無 水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，40克200~300目硅膠柱層析，石油醚/醋酸乙 酯4: l洗脫，得到7.0克起始物A (2，4,6-三甲氧甲氧基苯乙酮)。黃色油狀 物。Rf (石油醚/醋酸乙酯=3 : 1): 0.30;核磁共振氫譜(400MHz，氘代氯 仿)S2.52(單峰，3H,CH3), 3.50 (單峰，9H，OCH3), 5.17 (單峰，6H,OCH20)， 6.52 (單峰，2H， H-3,5)。1.2起始物B — l,2-二甲氧甲氧基苯甲醛(2)的制備-
2，3-二羥基苯甲醛4.8克溶于30毫升丙酮，攪拌10分鐘后加入碳酸鉀 17.5克，再滴加氯甲醚(MOMC1) 6毫升，加熱回流l小時，過濾，濾液濃 縮得到黃色油狀物7.0克，直接用于下一步反應(yīng)。 1.3中間體査耳酮(3)的制備
2.8克氫氧化鉀溶入30毫升甲醇中，攪拌狀態(tài)下滴加1.4克起始物A和 1.3克起始物B的混合甲醇溶液10毫升，室溫下攪拌8小時，減壓蒸除溶劑， 向殘留物中加入20毫升水，醋酸乙酯提取(3次，每次20毫升)，合并有機(jī) 層，減壓蒸除溶劑后，殘余物經(jīng)30克200 300目硅膠柱層析，石油醚/醋酸 乙酯3 : 1洗脫，得到1.76克中間體査耳酮。黃色油狀物；Rf (石油醚/醋酸 乙酯=2: 1): 0.38; UV (甲醇)？onax: 209，300nm。用于下一步反應(yīng)。 1.4環(huán)氧查耳酮(4)的制備
1.4克中間體查耳酮溶于25毫升甲醇中，加入1.6毫升2N氫氧化鉀水溶 液，再加入1.6毫升30%雙氧水溶液，室溫?cái)嚢?小時。加入25毫升水，減 壓濃縮，用醋酸乙酯提取(3次，每次20毫升)，合并有機(jī)層，無水硫酸鈉 干燥，過濾，減壓蒸除溶劑后，殘余物經(jīng)20克200 300目硅膠柱層析，石 油醚/醋酸乙酯3 : 1洗脫，得到1.1克中間體環(huán)氧查耳酮。黃色油狀物；Rf (石油醚/醋酸乙酯=2 : 1): 0.33; UV (甲醇)？onax: 210,285nm。用于下 一步反應(yīng)。
1.5 二氫黃酮醇(±)-2~(2,3-二羥基苯基)2，3-二氫-3，5，7-三羥基^^-l-苯并吡 喃^—酮(5)的制備
1.0克中間體環(huán)氧查耳酮溶解于15毫升甲醇中，攪拌狀態(tài)下加至溶解有 1.5毫升濃鹽酸的IO毫升甲醇溶液中，升溫60。C反應(yīng)半小時，撤去加熱，冷 卻后減壓蒸除溶劑，向殘余物中加入50毫升水，用醋酸乙酯提取(3次，每 次20毫升)，合并有機(jī)層，飽和食鹽水洗2次，無水硫酸鈉干燥，過濾，減 壓蒸除溶劑后，殘余物經(jīng)20克200-300目硅膠柱層析，石油醚/乙酸乙酯3 :1洗脫,得到97毫克(±)-2-(2,3-二羥基苯基)2,3-二氫-3,5,7-三羥基"4/M-苯并吡喃4-酮。黃色油狀物。Rf (石油醚/醋酸乙酯=2 : 1): 0.29;直接用
于下一步反應(yīng)。
1.6式(I)化合物的制備
向干燥的反應(yīng)瓶中投入碳酸銀0.22克，加入20毫升無水苯和5毫升無 水丙酮，室溫下滴加90毫克(±)-2-(2,3-二羥基苯基)2,3-二氫-3,5,7-三羥基~4//-1-苯并吡喃~4-酮的無水苯溶液5毫升和89毫克3，5-二甲氧基-4-羥基肉 桂醇(6)的無水丙酮溶液3毫升，在55T時保溫反應(yīng)20小時。冷至室溫后 靜置，濾去不溶物，母液減壓濃縮，得黃色油狀物，經(jīng)20克200 300目硅 膠柱層析，氯仿/甲醇10: l洗脫，得到26毫克式(I)化合物。
Rf (氯仿/甲醇/醋酸乙酯/丙酮/乙酸=11 : 0.5 : 1 : 1 : 0.1): 0.24;核磁
共振氫譜& NMR (400 MHz,気代丙酮)S: 3.92 (多重峰，1H, H-23a), 4.22 (多重峰，1H， H—23b)， 4.78 (多重峰，1H， H-IO), 4.95 (雙峰,J =11.2 Hz， 1H， H-3), 5.51 (多重峰，1H, H-ll)， 5.65 (雙峰，J =11.2 Hz, 1H, H-2), 5.84 (雙峰，J =1.2 Hz， 1H， H—6), 5.88 (雙峰，J =1.2 Hz, 1H, H—8)， 6.78~6.93 (多重峰，3H， H—14， 18, 22)， 7.05 (雙峰，J =8.0 Hz, 1H， H—15)， 7.11 (雙峰，J =8.0 Hz， 1H， H—13), 10.07 (寬單峰，1H, OH-20), 10.41 (寬單峰，1H, OH—7), 12.33 (單峰，1H: 5-OH);電噴霧質(zhì)譜ESI-MS: 511 (M—l)+。
由于銀鹽催化下的偶合反應(yīng)產(chǎn)物以反式構(gòu)型為主，故本發(fā)明得到的優(yōu)勢 產(chǎn)物也為二氧六環(huán)11位與12位互為反式構(gòu)型的消旋體產(chǎn)物。
實(shí)施例2:采用MTT法測定式(I)化合物對Vero細(xì)胞的細(xì)胞毒性，以及用 微量細(xì)胞病變抑制(CPE)法研究其對HSV-1的抑制作用試驗(yàn) 2.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br> 以HSV-1感染的Vero細(xì)胞為模型，篩選抗HSV藥物，其中樣品來自 實(shí)施例l的式(I)化合物樣品。 2.2材料
2.2.1病毒和細(xì)胞
2.2丄1病毒HSV-1由浙江大學(xué)藥學(xué)院中藥與天然藥物研究室提供； 2.2丄2細(xì)胞Vero細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。 2.3試劑
2.3.1 RPMI 1640培養(yǎng)基Gibco公司產(chǎn)品；
2.3.2 L-谷胺酰氮AMRESCO產(chǎn)品，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司 分裝；
2.3.3 MTT: AMRESCO產(chǎn)品，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司分裝； 2.3.4胎牛血清Gibco公司產(chǎn)品；
2.3.5青霉素鈉江西東風(fēng)藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品； 2.3.6硫酸鏈霉素華北制藥股份有限公司產(chǎn)品；2.3.7陽性對照藥阿昔洛韋(ACV)，湖北科益藥業(yè)股份有限公司，0.25g/
支。 2.4儀器
2.4.1 C02培養(yǎng)箱美國Shellab公司產(chǎn)品；
2.4.2 XD-2倒置顯微鏡重慶光電儀器有限公司產(chǎn)品； 2.4.3生物安全柜美國LABCONCO公司產(chǎn)品；
2.4.4 Synergy HT酶標(biāo)儀美國BIO-TEK公司產(chǎn)品；
2.4.5 LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)
P
B口 o
2.5細(xì)胞培養(yǎng)和病毒傳代
將Vero細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活小牛血清，100U/毫升青霉素和100微克 /毫升的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37。C， 5%二氧化碳，100%相對濕度的培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將HSV-1加入長有的Vero的細(xì)胞瓶中，置37。C， 5%二氧化 碳，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清，置低溫下保存。 2.6實(shí)驗(yàn)方法
2.6.1采用MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]法測定式(I) 化合物對Vem細(xì)胞生長的抑制作用
(1) 測試藥物實(shí)施例1制備得到的式(I)化合物；阿昔洛韋(ACV)為 陽性對照藥物。
(2) 取對數(shù)生長期的Vero細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成1X10V毫升，接 種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100微升，在37t:， 5%二氧化碳，100%相對 濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后加入用培養(yǎng)基稀釋的式(I)化合物，濃度分 別為100微克/毫升，20微克/毫升和10微克/毫升，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培 養(yǎng)72小時后，每孔加入MTT試劑10微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄去培養(yǎng)基， 每孔加入二甲亞砜200微升，用振蕩器振蕩20分鐘，在570nm波長下用酶 標(biāo)儀測定OD值。以只加培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔為對照孔。抑制率(％)二 (對照孔 OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對照孔OD值X100。/。。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。根據(jù)不同濃 度下對細(xì)胞生長的抑制率，計(jì)算對細(xì)胞生長的半數(shù)中毒濃度(TD50)。
2.6.2用微量細(xì)胞病變抑制法測定樣品對病毒生長抑制作用
取對數(shù)生長期的Vero細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成lxl0S/毫升，接種 于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37°C， 5%二氧化碳，100%相對濕度培養(yǎng)24小時，加入 lOOTCIDso的病毒100微升，傾出病毒，分別加入不同濃度的式(I)化合物，同時設(shè)正常細(xì)胞對照和病毒感染對照，37°C， 5%二氧化碳，100%相對濕度 培養(yǎng)48小時后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變。以五級標(biāo)準(zhǔn)作為判斷細(xì)胞病變
的標(biāo)準(zhǔn)， 一細(xì)胞無變化，分值為8分；+: 25%以下細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值 為6分；+ + : 25% 50%細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值為4分；+ + + : 50% 75 %細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值為2分；+ + + + : 75%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值為o分。
2.6.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
式(I)化合物在100微克/毫升濃度下抑制HSV-1復(fù)制的百分抑制率為 25%，而陽性對照藥物阿昔絡(luò)韋在100微克/毫升濃度下抑制HSV-1復(fù)制的 百分抑制率為100%。 2.6.4 結(jié)論
上述試驗(yàn)結(jié)果說明，式(I)化合物對I型單純皰疹病毒有一定的抑制作 用，雖然其抑制強(qiáng)度低于陽性對照藥阿昔洛韋，但其為源自天然產(chǎn)物的非核 苷類化合物，屬于該類化合物中具有明顯效果的HSV-1抑制劑，從而可以 期望其進(jìn)一步開發(fā)成為抑制HSV-1病毒和防治口腔潰瘍的藥物，或可與已上 市治療HSV-1病毒感染藥物聯(lián)合使用。
實(shí)施例3:微量細(xì)胞病變抑制(CPE)法研究式(I)化合物對HSV-2的抑制 作用
3.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br> 以HSV-2感染的Vero細(xì)胞為模型，篩選抗HSV藥物，其中樣品來自 實(shí)施例1中制得的式(I)化合物樣品。 3.2材料
3.2.1病毒和細(xì)胞
3.2丄1病毒HSV-2由浙江大學(xué)藥學(xué)院中藥與天然藥物研究室提供； 3.2丄2細(xì)胞Vero細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。 3.2.2試劑
3.2.2.1 RPMI 1640培養(yǎng)基Gibco公司產(chǎn)品；
3.2.2.2 L-谷胺酰氨AMRESCO產(chǎn)品，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司 分裝；
3.2.2.3 MTT: AMRESCO產(chǎn)品，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司分裝； 3.2.2.4胎牛血清Gibco公司產(chǎn)品；3.2.2.5青霉素鈉江西東風(fēng)藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品； 3.2.2.6硫酸鏈霉素華北制藥股份有限公司產(chǎn)品；
3.2.2.7陽性對照藥阿昔洛韋(ACV)，湖北科益藥業(yè)股份有限公司，0.25g/ 支。
3.2.3儀器
3.2.3.1 C02培養(yǎng)箱美國Shellab公司產(chǎn)品；
3.2.3.2 XD-2倒置顯微鏡重慶光電儀器有限公司產(chǎn)品； 3.2.3.3生物安全柜美國LABCONCO公司產(chǎn)品；
3.2.3.4 Synergy HT酶標(biāo)儀美國BIO-TEK公司產(chǎn)品；
3.2.3.5 LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠
口
廣pm o 3.3方法
3.3.1病毒毒力測定:在長成單層的細(xì)胞中加入IO倍連續(xù)倍比稀釋的病毒液， 從10"到10'9等共9個濃度，在37。C， 5%二氧化碳，100%相對濕度條件下 培養(yǎng)48小時，然后用MTT法比色，測定病毒的毒力，以TCIDso表示。 3.3.2樣品毒性測定用培養(yǎng)基將藥物連續(xù)稀釋成4個濃度(100微克/毫升， 10微克/毫升，l微克/毫升)，分別加入細(xì)胞已長成單層的96孔培養(yǎng)板中， 每孔200微升，置于37'C， 5%二氧化碳，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 培養(yǎng)72小時后用MTT法測定樣品對細(xì)胞的毒性，計(jì)算半數(shù)中毒濃度(TD50)。 3.3.3細(xì)胞病變抑制法測定樣品對病毒生長抑制作用細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板， 37°C， 5%二氧化碳，100%相對濕度培養(yǎng)24小時，加入2X100TCID5o的病 毒100微升，吸附2小時，傾出病毒，分別加入最大濃度為無毒濃度的不同 濃度樣品，每濃度3孔，同時設(shè)正常細(xì)胞對照和病毒感染對照，37°C， 5%二 氧化碳，100%相對濕度培養(yǎng)72小時后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變。以五 級標(biāo)準(zhǔn)作為判斷細(xì)胞病變的標(biāo)準(zhǔn)， 一細(xì)胞無變化，分值為8分；+: 25% 以下細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值為6分；+ + : 25% 50%細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值為
4分；+ + + : 50% 75%細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值為2分；+ + + + : 75%以
上細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值為o分。
3.4結(jié)果
式(I)化合物在100微克/毫升濃度下抑制HSV-2復(fù)制的百分抑制率為 35%，而陽性對照藥物阿昔絡(luò)韋在100微克/毫升濃度下抑制HSV-2復(fù)制的 百分抑制率為100%。3.5結(jié)論
上述試驗(yàn)結(jié)果說明，式(i)化合物對n型單純皰疹病毒有一定的抑制作
用，雖然其抑制強(qiáng)度低于陽性對照藥阿昔洛韋，但其為源自天然產(chǎn)物的非核
苷類化合物，屬于該類化合物中具有明顯效果的HSV-2抑制劑，從而可以 期望其進(jìn)一步開發(fā)成為防治生殖器皰疹的藥物，或與已上市治療HSV-2病毒 感染藥物聯(lián)合使用。
實(shí)施例4:微量細(xì)胞病變抑制(CPE)法研究實(shí)施例1制備得到的式(I)化
合物之抗流感病毒作用
4.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br> 以甲型流感病毒(IVA)感染的Vero細(xì)胞為模型，篩選抗流感病毒藥物， 其中樣品來自實(shí)施例1式(I)化合物樣品。 4.2材料
4.2.1病毒和細(xì)胞
4.2丄1病毒甲型流感病毒(IVA)由浙江大學(xué)藥學(xué)院中藥與天然藥物研究 室提供；病毒按照常規(guī)接種于9一11日齡的雞胚尿囊腔中，35°C培養(yǎng)72小時， 4。C冰箱過夜，收集尿囊液。進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)，測得病毒效價(jià)l 1280。 4.2丄2細(xì)胞狗腎細(xì)胞MDCK細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。 4.2.2試劑
4.2.2.1 RPMI 1640培養(yǎng)基Gibco公司產(chǎn)品；
4.2.2.2 L-谷胺酰氨AMRESCO產(chǎn)品，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司 分裝；
4.2.2.3 MTT: AMRESCO產(chǎn)品，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司分裝； 4.2.2.4胎牛血清Gibco公司產(chǎn)品；
4.2.2.5青霉素石家莊制藥集團(tuán)有限公司產(chǎn)品； 4.2.2.6鏈霉素石家莊制藥集團(tuán)有限公司產(chǎn)品；
4.2.2.7陽性對照藥利巴韋林(RBV)，揚(yáng)州中寶制藥有限公司，0.1克/毫 升。
4.2.3儀器
4.2.3.1 C02培養(yǎng)箱美國Shellab公司產(chǎn)品；
4.2.3.2 XD-2倒置顯微鏡重慶光電儀器有限公司產(chǎn)品； 4.2.3.3生物安全柜美國LABCONCO公司產(chǎn)品；4.2.3.4 Synergy HT酶標(biāo)儀美國BIO-TEK公司產(chǎn)品；
4.2.3.5 LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠
口
廣叩o
4.3方法
4.3.1病毒毒力測定
4.3丄1取對數(shù)生長期的細(xì)胞一瓶，消化后加入1640培養(yǎng)液，接種于96孔細(xì)
胞培養(yǎng)板，每孔100微升，37°C,培養(yǎng)24小時；
4.3丄2次日取出96孔板，棄去培養(yǎng)液后，用Hank's液洗兩次；
4.3丄3將病毒從低溫冰箱中取出，分別加入10倍連續(xù)倍比稀釋的病毒液，
從10"到10—9等共9個濃度，在37"， 5%二氧化碳，100%相對濕^^條件下
培養(yǎng)48小時，然后觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，測定病毒的毒力，結(jié)果記錄
為"++++"為100%病變；"+++"為75%病變；"++"為50%病變；"+ "
為25%病變，"-"為陰性結(jié)果。 4.3.2樣品毒性測定
4.3.2.1取對數(shù)生長期的細(xì)胞一瓶，消化后加入1640培養(yǎng)液，接種于96孔細(xì)
胞培養(yǎng)板，每孔100微升，37°C，培養(yǎng)24小時；
4.3.2.2次日取出96孔板，棄去培養(yǎng)液后，用Hank's液洗兩次；
4.3.2.3用無血清1640培養(yǎng)基將已配好的藥物連續(xù)稀釋成4個濃度(IOOO微
克/毫升，100微克/毫升，10微克/毫升，1微克/毫升)，分別加入細(xì)胞已
長成單層的96孔培養(yǎng)板中，每孔100微升，置于37"C， 5%二氧化碳，100
%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)72小時；
4.3.2.4在570nm波長下用酶標(biāo)儀比色，計(jì)算每個濃度下的抑制率，計(jì)算樣
品對細(xì)胞的半數(shù)中毒濃度(TD5{))。
4.3.3細(xì)胞病變抑制法測定樣品對病毒生長抑制作用
4.3.3.1取對數(shù)生長期的細(xì)胞一瓶，消化后加入1640培養(yǎng)液，接種于96孔細(xì)
胞培養(yǎng)板，每孔100微升，37°C，培養(yǎng)24小時；
4.3.3.2次日取出96孔板，棄去培養(yǎng)液后，用Hank's液洗兩次；
4.3.3.3傾出96孔板中培養(yǎng)液，加入1640稀釋后濃度為100 TCID5o病毒液
100微升，37°C， 5%0)2下吸附2小時。
4.3.3.4加入式(I)化合物最大無毒濃度(TD^1600微克/毫升)藥液作連續(xù) 2倍稀釋的6個濃度，每濃度3孑L， 37°C、 5。/。C02下培養(yǎng)3天。加入利巴韋林 (病毒唑)最大無毒濃度(TD。)藥液作連續(xù)2倍稀釋的6個濃度，37°C、5%(302下培養(yǎng)3天。分別設(shè)立實(shí)驗(yàn)藥和陽性藥、細(xì)胞對照和病毒對照組。3 天后顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，記錄病變程度(CPE)。按Reed-Muench法分 別計(jì)算式(I)化合物和利巴韋林的抗病毒效果。
4.4試驗(yàn)結(jié)果按照CPE法測出的式(I)化合物的半數(shù)有效濃度IC5Q= 218 微克/毫升；治療指數(shù)TI-TD5o/IC5(T 7.3;而陽性對照的利巴韋林的半數(shù)有 效濃度5.0微克/毫升；治療指數(shù)TP 253.0。 4.5結(jié)論
上述試驗(yàn)結(jié)果說明，式(I)化合物對甲型流感病毒有一定的抑制作用， 可以進(jìn)一步開發(fā)成為防治甲型流感的藥物，或與已上市治療甲型流感病毒感 染藥物聯(lián)合使用。
在上述說明書闡述本發(fā)明時，同時提供了實(shí)施例和藥理實(shí)施例的目的是 舉例說明本發(fā)明的實(shí)際操作過程和本發(fā)明的意義。在進(jìn)入本發(fā)明權(quán)利要求和 其等同物范圍內(nèi)時，本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用包括所有一般變化、配合，或改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種式(I)所示結(jié)構(gòu)之化合物(±)-2-[2，3-二氫-2-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯基)-3-羥甲基-1，4苯并二氧六環(huán)-5]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯并吡喃-4-酮或其可藥用鹽用于制備治療由I型單純皰疹病毒HSV-1引發(fā)的病毒感染和/或口腔潰瘍的藥物的用途； id="icf0001" file="A2009100962910002C1.tif" wi="52" he="54" top= "60" left = "72" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>式(I)其中，式(I)化合物11、12位的立體構(gòu)型互為反式，也即二者同時是R或同時是S構(gòu)型。
2. 式(I)所示結(jié)構(gòu)之化合物(±)—2-[2,3_二氫-2《3,5—二甲氧基~4—羥基苯 基)-3-羥甲基-1,4苯并二氧六環(huán)-5]-2,3-二氫-3，5,7-三羥基^^-1-苯并吡喃 -4-酮或其可藥用鹽用于制備治療由II型單純皰疹病毒HSV-2引發(fā)的生殖器 皰疹的藥物的用途。
3. 式(I)所示結(jié)構(gòu)之化合物(±)~2-[2,3-二氫-2-(3，5—二甲氧基4-羥基苯 基)-3-羥甲基-1，4苯并二氧六環(huán)-5]-2，3-二氫-3,5,7-三羥基~4//-1-苯并吡喃 4—酮或其可藥用鹽用于制備防治由流感病毒IVA引發(fā)的病毒性感冒的藥物的用途。
4. 一種用于防治由I型單純皰疹病毒HSV-1引發(fā)的病毒感染和/或口腔潰瘍 的藥物或藥物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的(±)~2-[2,3-二氫 -2-(3，5-二甲氧基~4-羥基苯基)-3-羥甲基-1,4苯并二氧六環(huán)-5]-2,3-二氫 -3,5，7-三羥基-4^-1-苯并吡喃~4-酮或其可藥用鹽和可藥用輔料。
5. —種用于防治由II型單純皰疹病毒HSV-2引發(fā)的生殖器皰疹的藥物或藥 物組合物，其含有治療有效量的作為活性成分的(±)"2-[2，3-二氫-2-(3,5-二甲 氧基_4-羥基苯基)-3-羥甲基-1,4苯并二氧六環(huán)-5]-2,3-二氫-3,5,7-三羥基 477-1-苯并吡喃"4-酮或其可藥用鹽和可藥用輔料。
6. —種用于防治由流感病毒IVA引發(fā)的病毒性感冒的藥物或藥物組合物， 其含有治療有效量的作為活性成分的(±)~2-[2,3-二氫-2-(3,5-二甲氧基+羥 基苯基)-3—羥甲基-1，4苯并二氧六環(huán)-5]—2，3—二氫—3,5,7—三羥基4H—l—苯并 吡喃~4-酮或其可藥用鹽和可藥用輔料。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4 6任一項(xiàng)中所述的藥物或藥物組合物，其劑型是注射劑、 片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑，或控釋或緩釋劑 型或納米制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個木質(zhì)素二氫黃酮醇在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用，具體而言，本發(fā)明涉及式(I)化合物，即(±)-2-[2，3-二氫-2-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯基)-3-羥甲基-1，4苯并二氧六環(huán)-5]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯并吡喃-4-酮，或其可藥用鹽用于制備抑制單純皰疹病毒和/或流感病毒藥物的用途。體外藥理實(shí)驗(yàn)顯示式(I)化合物不僅能顯著抑制單純皰疹病毒HSV-1、HSV-2的生長，還可以有效抑制流感病毒IVA。從而可以預(yù)期將其開發(fā)成為防治I型/II型單純皰疹病毒感染藥物，或防治由IVA病毒感染引起的病毒性流感藥物。
文檔編號A61P31/16GK101548970SQ20091009629
公開日2009年10月7日 申請日期2009年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日
發(fā)明者馮玉冰, 巫秀美, 李校堃, 李海波, 佳 瞿, 昱 趙, 郝小江, 黃可新 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院;李校堃