專(zhuān)利名稱：以靈芝子實(shí)體為原料提取靈芝三萜與靈芝多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以靈芝子實(shí)體為原料提取靈芝三萜與靈芝多糖的方法。
(二)
背景技術(shù)：
靈芝(G朋ocfenwa /wc/血m )是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材和藥用真菌， 其主要功效成分為靈芝三碎和靈芝多糖。其中靈芝多糖的功能主要在于抗 腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗氧自由基、活血化瘀作用和抗衰老，而靈芝三萜則具 有護(hù)肝排毒、抗氧化、抗菌抗炎、抗fflV病毒、鎮(zhèn)痛、抑制血管緊張素 轉(zhuǎn)化酶、抑制膽固醇合成、P爭(zhēng)低血小板聚集、抑制組胺釋放、抑制肝臟腫 瘤細(xì)胞等作用。
目前， 一般采用有機(jī)溶劑法提取靈芝三萜，通常需要較長(zhǎng)的提取時(shí)間 并消耗大量的提取溶劑，同時(shí)大量有機(jī)溶劑的使用會(huì)給人體和環(huán)境帶來(lái)不 利的影響。傳統(tǒng)的靈芝多糖提取方法主要是采用熱水浸提法、酸浸提法、 堿浸提法提取。酸或堿浸提法雖能提高提取率，但對(duì)設(shè)備要求高且極易破 壞多糖的結(jié)構(gòu)，還存在環(huán)境污染問(wèn)題。另外由于靈芝子實(shí)體由纖維素、半 纖維素和木質(zhì)素等主要成分構(gòu)成，結(jié)構(gòu)緊密，活性多糖有效成分附著在細(xì) 胞壁內(nèi)側(cè)，傳統(tǒng)的熱水浸提法時(shí)間長(zhǎng)、耗能高，活性成分提取物得率低。 中國(guó)專(zhuān)利CN1181271介紹了使用低壓水煮工藝，多糖的藥理活性比常規(guī) 水煮要高，但多糖提取率偏低，且所得提取物中靈芝三萜酸含量也偏低。 中國(guó)專(zhuān)利CN1560072通過(guò)釆用超臨界CO2萃取靈芝三萜酸提取液，提余 物再經(jīng)熱水浸提得靈芝多糖提取液。但該方法所需設(shè)備投入較大、操作難度和生產(chǎn)成本也較高，且靈芝多糖提取率和多糖含量偏低。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供一種應(yīng)用超聲波、酶提等高新技術(shù)優(yōu)化靈芝生 物活性成分(靈芝多糖和靈芝三碎)的提取工藝，提高名貴藥用菌靈芝的 綜合利用率和附加值，降低資源消耗和生產(chǎn)成本，減少提取設(shè)備投入。
本發(fā)明釆用的技術(shù)方案是
一種以靈芝子實(shí)體為原料提取靈芝三萜與靈芝多糖的方法，所述方法 包括(1)取干燥靈芝子實(shí)體粉碎得到干粉，在超聲頻率15 100KHz、 40 90。C條件下以50 100%乙醇(乙醇體積濃度50~100°/。的乙醇水溶液， 100%乙醇即為無(wú)水乙醇)為溶劑提取10min 90min,過(guò)濾，濾液干燥得 到靈芝三萜提取物，濾渣用于靈芝多糖的提取；(2)步驟(1)濾渣在35~ 70°C、 pH3.5 7.0條件下，加入適量水在復(fù)合酶作用下酶解水提0.5h 4h, 滅酶、分離得到上清液，濃縮至體積為上清液體積的1/2 1/6得到濃縮液， 再加入濃縮液體積的2~5倍量的75~100%乙醇進(jìn)行醇沉，分離、干燥得 到靈芝多糖提取物；所述復(fù)合酶為下列兩種以上的混合物① 4800~80000U/g干粉的木瓜蛋白酶、②90 1500U/g干粉的纖維素酶、③ 32 200U/g干粉的果膠酶。所用酶均可采用市購(gòu)商品酶，通常纖維素酶 單位酶活為 10000U/g~20000U/g , 木瓜蛋白酶單位酶活為 700000U/g~800000U/g,果膠酶單位酶活為15000 U/g~25000U/g，復(fù)合酶 用量約為靈芝干粉質(zhì)量的0.1 20%。
步驟(1 )中50~100%乙醇用量為5~50mL/g干粉。
步驟(2)中酶解水提時(shí)水用量為10 100mL/g干粉。
步驟(2 )中以1 .Omol/L NaOH或1 .Omol/L HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值。優(yōu)選的，步驟(2 )中復(fù)合酶為9600~80000U/g干粉的木瓜蛋白酶和 180~1500U/g干粉的纖維素酶的混合物。
優(yōu)選的，步驟(2)中復(fù)合酶為4800 12800U/g干粉的木瓜蛋白酶、 卯 240U/g干粉的纖維素酶和32-200 U/g干粉的果力交酶的混合物。
具體的，所述方法如下
(1) 取干燥靈芝子實(shí)體粉碎得到干粉，在超聲頻率15~100KHz、 40~90°C 條件下，加入5~50mL/g干粉的50~100%乙醇為溶劑提取 10min 90min，過(guò)濾，濾液噴霧干燥得到靈芝三碎提取物，濾渣用
于靈芝多糖的提取；
(2) 步驟(1)濾渣在35-70。C、 pH3.5~7.0條件下，加入10~100mL/g
干粉的蒸餾水，在復(fù)合酶作用下酶解0.5h 4h,滅酶，離心取上清
液濃縮至體積為上清液體積的1/6-1/2，濃縮液加入體積為濃縮液體
積3倍的95%乙醇，攪拌、靜置12h 24h,離心取沉淀噴霧干燥得
到靈芝多糖提取物； 本發(fā)明的內(nèi)容涉及一種利用超聲波-醇提、復(fù)合酶-水提集成技術(shù)從靈 芝子實(shí)體中高效提取靈芝三萜與靈芝多糖的方法。其特點(diǎn)是將靈芝子實(shí)
體粉碎，先采取超聲波輔助醇提(超聲波-醇提)提取靈芝三萜后，再以 復(fù)合酶輔助水提醇沉(復(fù)合酶-#)制備靈芝多糖，分別經(jīng)噴霧干燥得 到靈芝三萜提取物和靈芝多糖提取物。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下列特點(diǎn)
(1)同一靈芝子實(shí)體原料分步提取靈芝三萜和靈芝多糖，且先提靈 芝三碎，后提靈芝多糖，避免脂溶性的三萜類(lèi)物質(zhì)揮發(fā)散失，比水提醇沉 法、酸提法、堿提法僅提取靈芝多糖對(duì)靈芝子實(shí)體原料利用率大大提高。(2)采取超聲波輔助醇提靈芝三碎，且采用先提靈芝三萜后提靈芝 多糖的工藝路線，使高附加值的靈芝三萜提取得率大大提高。所用溶劑安 全、無(wú)毒，與超臨界二氧化碳提取靈芝三萜的方法相比，設(shè)備投入大大降 低、操作筒便可行，生產(chǎn)成本大幅度降低，更適宜作保健食品原料。
(3 )經(jīng)超聲波醇提提取靈芝三碎后的靈芝殘?jiān)?，再以?fù)合酶輔助水
提醇沉制備靈芝多糖，被纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等包裹在細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)
的多糖很容易被分離提取出來(lái)，且無(wú)需像傳統(tǒng)的熱水浸提那樣高溫浸提，
提取工藝條件溫和且節(jié)省能耗，多糖提取物得率得以提高。
本發(fā)明方法所用溶劑安全、無(wú)毒，避免了傳統(tǒng)方法中采用氯仿、甲醇
等有機(jī)溶劑對(duì)環(huán)境的污染。與超臨界二氧化碳萃取法相比，具有提取溫度 低、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、成本低、速度快、收效高等特點(diǎn)。采用超聲波 輔助提取靈芝三萜，相對(duì)于傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑法，可使靈芝三萜提取率顯著 提高；采用生物酶法提取靈芝多糖，相對(duì)于傳統(tǒng)的熱水浸提法，可使靈芝 多糖提取率和靈芝多糖含量得到較大提高，避免了高溫?zé)崴峄蛩?、堿 提取對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的影響，且易除去雜質(zhì)、最大限度地保持多糖活性等優(yōu)點(diǎn)。 釆用該工藝綜合提取靈芝中的三萜和多糖類(lèi)活性物質(zhì)，使總活性物質(zhì)得率 比單一提取方法得到大幅提高。 具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍 并不僅限于此
實(shí)施例1:
(1)取50.0g干燥的靈芝子實(shí)體粉(上海中靈生物科技有限公司)裝入超聲萃取斧中，加入50°/。的乙醇2500ml，在溫度為90°C,超聲頻率為 50KHz下超聲10min，過(guò)濾得到靈芝三辟提取液經(jīng)噴霧干燥得到靈芝三萜 提取物1.38g，提取率為2.76%,其中靈芝三辟含量為34.8%。 (2 )向步驟(1 )所得的濾渣中加入500ml的蒸餾水，加入0.6g木瓜蛋 白酶(酶活800000 U/g)和1.2g纖維素酶(酶活15000U/g),用l.Omol/L NaOH和l.Omol/L HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值為7.0。在溫度為35。C下酶解提 取4.0h。
(3) 高溫滅酶酶解完成后升溫至100。C滅酶0.5h。
(4) 醇沉提取液離心后上清液濃縮至原體積的1/6,向濃縮液中加入2 倍體積的100%乙醇，攪拌均勻靜置12h后離心、取沉淀經(jīng)噴霧干燥得到 靈芝粗多糖提取物1.42g,提取率為2.84%，其中多糖含量為34.3%。
實(shí)施例2:
(1)取50.0g干燥的靈芝子實(shí)體粉裝入超聲萃取斧中，加入80%乙醇 500ml,在溫度為60°C,超聲頻率為15KHz下超聲50min,過(guò)濾得到靈芝 三辟提取液經(jīng)噴霧干燥得到靈芝三萜提取物1.41g,提取率為2.82%,其 中靈芝三萜含量為41%。
(2 )向步驟(1)所得的濾渣中加入2500ml的蒸餾水，加入1.2g木瓜 蛋白酶(酶活800000 U/g )和0.6g纖維素酶(酶活15000U/g),用l.Omol/L NaOH和l.Omol/L HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值為5.0。在溫度為50。C下酶解提 取l.Oh。
(3) 高溫滅酶酶解完成后升溫至100。C滅酶0.5h。
(4) 醇沉提取液離心后上清液濃縮至原體積的1/4,向濃縮液中加入5 倍體積的70%乙醇，攪拌均勻靜置12h后離心、取沉淀經(jīng)噴霧干燥得到靈芝粗多沖奮提取物1.58g,提取率為3.16%，其中多糖含量為36.5%。 實(shí)施例3:
(1 )取50.0g干燥的靈芝子實(shí)體粉裝入超聲萃取斧中，加入100%的乙醇 250ml,在溫度為40。C，超聲頻率為lOOKHz下超聲90min,過(guò)濾得到靈 芝三萜提取液經(jīng)噴霧千燥得到靈芝三萜提取物L(fēng)51g，提取率3.02%,其 中靈芝三萜含量為48%。
(2 )向步驟(1 )所得的濾渣中加入5000ml的蒸餾水，加入0.3g木瓜 蛋白酶(酶活800000 U/g) 、 5.0g果膠酶(酶活20000 U/g)和0.3g纖維 素酶(酶活15000U/g),用1.0mol/LNaOH和1.Omol/LHC1調(diào)節(jié)溶液的 pH值為5.0。在溫度為50。C下酶解提取l.Oh。
(3) 高溫滅酶酶解完成后升溫至100。C滅酶0.5h。
(4) 醇沉提取液離心后上清液濃縮至原體積的1/5,向濃縮液中加入3 倍體積的90%乙醇，攪拌均勻靜置12h后離心、取沉淀經(jīng)噴霧干燥得到 靈芝粗多糖提取物1.65g，提取率為3.3%，其中多糖含量為35.0%。
實(shí)施例4:
(1)取50.0g干燥的靈芝子實(shí)體粉裝入超聲萃取斧中，加入90%的乙醇 500ml,在溫度為50°C,超聲頻率為80KHz下超聲30min，過(guò)濾得到靈芝 三萜提取液經(jīng)噴霧干燥得到靈芝三萜提取物1.55g,提取率為3.1%，其中 靈芝三碎含量為51.0%。
(2 )向步驟(1)所得的濾渣中加入2000ml的蒸餾水，加入0.8g木瓜 蛋白酶(酶活800000 U/g) 、 0.8g果月交酶(酶活20000 U/g)和0.8g纖維 素酶(酶活15000U/g),用1.0mol/LNaOH和1.Omol/LHC1調(diào)節(jié)溶液的pH值為4.0。在溫度為40。C下酶解提取2.0h。
(3) 高溫滅酶酶解完成后升溫至100。C滅酶0.5h。
(4) 醇沉提取液離心后上清液濃縮至原體積的1/2,向濃縮液中加入3 倍體積的75%乙醇，攪拌均勻靜置12h后離心、取沉淀經(jīng)噴霧干燥得到 靈芝粗多糖提取物1.72g,提取率為3.44%,其中多糖含量為38.0%。
實(shí)施例5:
(1)取50.0g干燥的靈芝子實(shí)體粉裝入超聲萃取斧中，加入60%的乙醇 1000ml，在溫度為30°C，超聲頻率為70KHz下超聲50min,過(guò)濾得到靈 芝三萜提取液經(jīng)噴霧干燥得到靈芝三萜提取物1.63g，提取率為3.26%, 其中靈芝三萜含量為52.0%。
(2 )向步驟(1 )所得的濾渣中加入3000ml的蒸餾水，加入5.0g木瓜 蛋白酶(酶活800000 U/g )和5.0g纖維素酶(酶活15000U/g),用1.Omol/L NaOH和1.0mol/LHCl調(diào)節(jié)溶液的pH值為5.5。在溫度為60。C下酶解提 取3.0h。
(3) 高溫滅酶酶解完成后升溫至100。C滅酶0.5h。
(4) 醇沉提取液離心后上清液濃縮至原體積的1/3，向濃縮液中加入4 倍體積的85%乙醇，攪拌均勻靜置12h后離心、取沉淀經(jīng)噴霧干燥得到 靈芝粗多糖提取物1.80g,提取率為3.6%,多糖含量為37.0%。
權(quán)利要求
1. 一種以靈芝子實(shí)體為原料提取靈芝三萜與靈芝多糖的方法，所述方法包括(1)取干燥靈芝子實(shí)體粉碎得到干粉，在超聲頻率15～100KHz、40～90℃條件下以50～100％乙醇為溶劑提取10min～90min，過(guò)濾，濾液干燥得到靈芝三萜提取物，濾渣用于靈芝多糖的提?。?2)步驟(1)濾渣在35～70℃、pH3.5～7.0條件下，在復(fù)合酶作用下酶解水提0.5h～4h，滅酶、分離得到上清液濃縮至體積為上清液體積的1/2～1/6得到濃縮液，再加入濃縮液體積2～5倍量的75～100％乙醇進(jìn)行醇沉，分離、干燥得到靈芝多糖提取物；所述復(fù)合酶為下列兩種以上的混合物①4800～80000U/g干粉的木瓜蛋白酶、②90～1500U/g干粉的纖維素酶、③32～200U/g干粉的果膠酶。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1 )中50~100%乙醇用量 為5~50mL/g干粉。
3. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟(2)中酶解水提時(shí)水用量 為10 100mL/g干粉。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中以1.0mol/L NaOH 或1.Omol/LHC1調(diào)節(jié)溶液的pH值。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中復(fù)合酶為 9600 80000U/g干粉的木瓜蛋白酶和180-1500U/g干粉的纖維素酶的混 合物。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中復(fù)合酶為 4800~12800U/g干粉的木瓜蛋白酶、90~240U/g干粉的纖維素酶和32~200 U/g干粉的果膠酶的混合物。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述方法如下(1 )取干燥靈芝子實(shí)體粉碎得到干粉，在超聲頻率15~100KHz、40~90 。C條件下，加入5 50mL/g干粉的50 100%乙醇為溶劑醇提 10min 90min,過(guò)濾，濾液噴霧干燥得到靈芝三辟提耳又物，濾渣用于靈芝多糖的提??； (2 )步驟(1 )濾渣在35 ~ 70。C 、 pH3.5~7.0條件下，加入10~100mL/g 干粉的蒸餾水，在復(fù)合酶作用下酶解水提0.5h 4h,滅酶，離心 取上清液濃縮至體積為上清液體積的1/6 1/2,向濃縮液中加入體 積為濃縮液體積3倍的95%乙醇，攪拌、靜置12h 24h,離心取 沉淀噴霧干燥得到靈芝多糖提^4勿。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用超聲波-醇提、復(fù)合酶-水提集成技術(shù)從靈芝子實(shí)體中高效提取靈芝三萜與靈芝多糖的方法。其特點(diǎn)在于將靈芝子實(shí)體粉碎，先采取超聲波輔助醇提(超聲波-醇提)提取靈芝三萜后，再以復(fù)合酶輔助水提醇沉(復(fù)合酶-水提)制備靈芝多糖，分別經(jīng)噴霧干燥得到靈芝三萜提取物和靈芝多糖提取物。本發(fā)明方法所用溶劑安全、無(wú)毒，避免了傳統(tǒng)方法中采用氯仿、甲醇等有機(jī)溶劑對(duì)環(huán)境的污染。具有萃取溫度低、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、成本低、速度快、收效高等特點(diǎn)。采用該工藝綜合提取靈芝中的三萜和多糖類(lèi)活性物質(zhì)，使總活性物質(zhì)得率比單一提取方法得到顯著提高。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101530436SQ20091009777
公開(kāi)日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2009年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月20日
發(fā)明者付立忠, 吳學(xué)謙, 吳慶其, 李海波, 程俊文, 亮 賀, 魏海龍 申請(qǐng)人:浙江省林業(yè)科學(xué)研究院