專利名稱：抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程抗體，涉及一種抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體及 其在預(yù)防性被動(dòng)免疫和慢性乙型病毒性肝炎潛在的治療藥物開發(fā)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種世界性疾病。發(fā)展中國家發(fā)病率 很高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界無癥狀乙肝病毒攜帶者(HBsAg攜帶者)超過3億,我國約占9300萬。 乙肝病毒攜帶者中1/3會(huì)轉(zhuǎn)為慢性肝炎，10%的慢性肝炎患者會(huì)發(fā)展為肝硬化，10%的肝硬 化患者會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為肝癌。因而乙型病毒性肝炎是一種流行極廣，危害極重而且沒有有效 治療方案的傳染病。雖然主動(dòng)的疫苗接種可以有效地預(yù)防乙肝，但是絕大部分的人群并沒有 接受疫苗接種，因而這些人群仍然暴露于乙肝病毒感染的高度危險(xiǎn)之下。中和性的乙肝病毒 免疫球蛋白可以有效預(yù)防母親為乙肝患者的新生兒、意外暴露于乙肝病毒的成年人免受乙肝 病毒的感染，有效預(yù)防肝硬化或肝癌患者肝移植后乙肝的復(fù)發(fā)，有效控制爆發(fā)性肝炎患者體 內(nèi)乙肝病毒的大量繁殖和擴(kuò)散；而且由于抗體可以介導(dǎo)抗體依賴的、細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作 用(ADCC)和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(CDC)，所以對(duì)于慢性肝炎患者以及乙肝病毒攜帶 者具有潛在的治療作用。然而，目前臨床上用到的乙肝病毒免疫球蛋白都是從接受乙肝疫苗 接種的正常人血清中分離出來的，屬于血液制品，因而具有傳播某些血液傳播感染性疾病的 潛在危險(xiǎn)，如艾滋病，丙肝，所以它的應(yīng)用價(jià)值受到了很大的限制。而通過抗體庫技術(shù)獲得 的重組中和性乙肝病毒抗體就可以克服這一缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的、具有中和活性的、 人源性單鏈抗體，能用來預(yù)防、控制和治愈乙肝病毒的感染。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗 體，該單鏈抗體的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1 。
作為本發(fā)明的抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體的改進(jìn)抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO: 2。
作為本發(fā)明的抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體的進(jìn)一步改進(jìn)該抗體的 輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO: 3。
本發(fā)明還提供了上述抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體在制備預(yù)防性被動(dòng) 免疫藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了上述抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體在制備治療慢性乙 型病毒性肝炎藥物中的應(yīng)用。
噬菌體抗體庫技術(shù)無需經(jīng)過雜交瘤，可以從接受乙肝疫苗接種后具有高滴度保護(hù)性乙肝 抗體的正常人外周血中分離淋巴細(xì)胞，進(jìn)而擴(kuò)增出全部抗體基因并建成噬菌體展示抗體庫， 從中篩選出高親和力的抗乙肝病毒a決定簇的中和抗體。研究表明，乙肝表面抗原中的a決 定簇介導(dǎo)乙肝病毒與肝細(xì)胞表面的受體結(jié)合并感染，所以抗a決定簇的抗體具有中和活性。
本發(fā)明采用噬菌體表面展示技術(shù)，從3位接受乙肝疫苗接種后具有高滴度保護(hù)性抗體的 正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞提取mRNA并從中擴(kuò)增出人的全套抗體可變區(qū)基因，然后裝配成單 鏈抗體基因片段，克隆到噬粒載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建成一個(gè)3xl09的人源性單鏈抗體庫。 然后用乙肝病毒表面抗原a決定簇的重組蛋白進(jìn)行篩選得到其特異性的高親和力中和性抗 體。該抗體可在大腸桿菌中可溶性表達(dá)，該抗體編碼243個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID NO: 1所 述。本發(fā)明的抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體由729個(gè)核苷酸組成，其序列 如SEQ ID NO: 4所述。
本發(fā)明的抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體的重鏈可變區(qū)基因編碼120個(gè) 氨基酸，序列如SEQIDNO:2所述。該抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體重鏈 可變區(qū)由360個(gè)核苷酸組成，其序列如SEQIDNO:5所述。本發(fā)明的抗乙肝病毒表面抗原a 決定簇的人源性單鏈抗體重鏈可變區(qū)由IGHV4-4， IGHD6-19和IGHJ4基因重排后形成的具 有單一開放讀框的功能性可變區(qū)基因。其中CDR3(互補(bǔ)決定區(qū)3)的核苷酸序列為GTTGGG CCC CAG TGG CTG GTA CCC AGG,氨基酸序列為VGPQWLVPR，由 IGHD6-19和本發(fā)明的乙肝表面抗原a決定簇的特異性人源性單鏈抗體特有的序列組成。
本發(fā)明的抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)基因編碼108個(gè) 氨基酸，序列如SEQIDNO:3所述。該抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體輕鏈 可變區(qū)由324個(gè)核苷酸組成，其序列如SEQIDNO:6所述。該乙肝病毒表面抗原a決定簇特異性人源性單鏈抗體輕鏈可變區(qū)由IGKV4-69和IGKJ2基因片段重排后形成的具有單一開放 讀框的功能性可變區(qū)基因。其中CDR3的核苷酸序列為CAC CAG TAT GGT AGC TCA CCT CGA,氨基酸序列為HQYGSSPR。
本發(fā)明的乙肝病毒表面抗原a決定簇特異性人源性單鏈抗體可在噬菌體表面呈現(xiàn)表達(dá)， 也可以在大腸桿菌中可溶性表達(dá)。經(jīng)蛋白電泳和Western blot證實(shí)，IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)的可溶 性單鏈抗體分子量約為30kD。該抗體與HEK293細(xì)胞表達(dá)的重組乙肝病毒表面抗原a決定簇 蛋白的親和力為Kd=2nM，這為研究乙肝病毒中和性全抗體奠定了基礎(chǔ)。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
圖1是本發(fā)明的乙肝病毒表面抗原a決定簇特異性人源性單鏈抗體與重組乙肝病毒表面 抗原a決定簇的親和力測定效果圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、
(一) 淋巴細(xì)胞的分離
收集3位接受乙肝疫苗接種的具有高滴度保護(hù)性抗體的正常人的外周血共100ml,加入 等體積的淋巴細(xì)胞分離液離心分層，2500g, 10min。小心吸取中層淋巴細(xì)胞，離心，2500g, 10min。棄上清，用lmlTrizol/5ml外周血裂解淋巴細(xì)胞，至溶液徹底透明為止；得淋巴細(xì)胞 裂解液。
(二) RNA的提取
將淋巴細(xì)胞裂解液于室溫孵育5min，加入0.2ml氯仿/ml Trizol, votex振蕩15s,室溫靜 置3min， 12000g, 5min。取上層清亮水相，加入0.5ml異丙醇/ml Trizol，顛倒混勻，于一20 。C沉淀30—60min， 12000g離心10min。保留沉淀，70%的乙醇洗滌一遍，空氣中晾干，DEPC 水溶解沉淀RNA。
(三) mRNA的純化(Qiagen試劑盒)
將上述DEPC水溶解的RNA按試劑盒說明書進(jìn)行純化，得mRNA 。
(四) 反轉(zhuǎn)錄將mRNA于7(TC保溫10min,使其打開二級(jí)結(jié)構(gòu)，然后迅速置于冰上，按說明書(Promega 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒)依次加入各試劑，用隨機(jī)六聚體引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。室溫靜置10min使 引物延伸，然后42'C 60min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后95°C 5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，冰浴5min，將反 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于一20'C保存。
(五)全套可變區(qū)基因擴(kuò)增
將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分成3份作為模板進(jìn)行第一輪PCR，將VH、 VL、 VK的3'端引物分別 混合后與5'端各引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上述VH、VL、VK如Sblattero, D.， and A. Bradbury. 1998. A definitive set of oligonucleotide primers for amplifying human V regions, Immunotechnology. 3:271—278中所述。
反應(yīng)條件為94。C 5min熱啟動(dòng)，94。C lmin變性，55°C lmin退火，72。C lmin延伸，共35 個(gè)循環(huán)。最后進(jìn)一步延伸7min。反應(yīng)體系為100|al。將第一輪PCR的VH混合，VL和VK 以l: 2混合，分別作電泳純化回收，100倍稀釋后作為第二輪PCR反應(yīng)的模板進(jìn)行第二輪 PCR反應(yīng)，以引入更長的保護(hù)序列及重疊延伸序列，條件為94°C 5min熱啟動(dòng)，94°C lmin 變性，55°C lmin退火，72°C lmin延伸,共25循環(huán)。反應(yīng)體系為IOOW。分別得加端的VH基 因片斷、VL基因片斷和VK基因片斷。
第一輪引物的保護(hù)序列，linker的序列如下
輕鏈上游引物保護(hù)序列AGCAAGCGGCGCTTGGGCCCAGCCGGCC (第二輪PCR的退火 序列)；
輕鏈下游引物保護(hù)序歹lJ: ACCTCCAGACCCTCCGCCACC (第二輪PCR的退火序列)； 重鏈上游引物保護(hù)序列GGCTCTGGGGGAGGAGGTTCA (第二輪PCR的退火序列)； 重鏈下游引物保護(hù)序列GATTGGTTTGCCCTAGCGGCCGC (第二輪PCR的退火序列)； linker: GGTGGCGGAGGGTCTGGAGGTGGAGGCTCTGGGGGAGGAGGTTCA;
第二輪引物的序列如下 第二輪輕鏈上游引物
CC
第二輪輕鏈下游引物 延伸序列)第二輪重鏈上游引物
伸序列)
第二輪重鏈下游引物 CGC
(六) 單鏈抗體(scFv)片斷的隨機(jī)拼接及擴(kuò)增
將上述加端的VH、 VL和VK基因片斷分別用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離、回收， 然后按VH:VK:VL:Linker=3:2:l:3的比例混合進(jìn)行重疊延伸以裝配scFv片斷，條件為94°C lmin變性，55°C lmin退火，72°C lmin延伸，共10個(gè)循環(huán)。將重疊延伸產(chǎn)物進(jìn)行1:100稀 釋，以此作模板，以單鏈抗體擴(kuò)增的上游和下游引物擴(kuò)增scFv片斷，PCR反應(yīng)條件是94'C 5min熱啟動(dòng)，94°C lmin變性，55°C lmin退火，72°C lmin延伸，25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物即為 單鏈抗體基因片斷，用1.5%的瓊脂糖凝膠回收。
單鏈抗體擴(kuò)增上游引物TCAGGTATCCACTGCAGACTGATTACGGTC 單鏈抗體擴(kuò)增下游引物CTAGACTCTGCTACAGCTCAGCTACGTGGA
(七) 單鏈抗體與噬粒載體的連接及單鏈抗體庫的構(gòu)建
1. 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備
從M9平板上挑取TG1單克隆搖菌過夜，1:100轉(zhuǎn)接于500mlLB,振搖2.5h， OD麵的值 在0.5—0.6之間，離心收菌，3000rpm, 10min。用等體積的冰冷lmM的HEPES洗滌兩遍， 3000rpm， 10min，用1/10體積的冰冷10%甘油洗漆兩遍，4000rpm， 10min，用與沉淀等體積 的冰冷10%甘油重懸沉淀，每管50ul于一8(TC保存，得到可凍存的感受態(tài)細(xì)菌。
2. 單鏈抗體庫的制備
將上述(六)所得的純化的單鏈抗體基因片段用Sfil/Notl酶切，并與經(jīng)相同酶切開的 噬粒載體PCANTAB5E連接。將連接產(chǎn)物于70°C孵育10min滅活T4 DNA連接酶，然后電 轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂布于含1%葡萄糖和100mg/L氨芐的2YT平板上，30 'C培養(yǎng)過夜，抗體庫庫容量為3X109。用含15X甘油的2YT將細(xì)菌克隆刮下來后凍存到一 80°C;得單鏈抗體庫。3.抗體庫的噬菌體表面呈現(xiàn)
接種3X101Q的細(xì)菌抗體庫于500ml 2YTGA(2YT+l。/。葡萄糖+ amp)中，37。C振搖至 OD600=0.5。取100ml用輔助性噬菌體M13K07以20: 1的比例于37。C靜置水浴30min進(jìn)行 感染。然后3300g， 10min室溫離心，棄上清，將細(xì)菌沉淀再分別轉(zhuǎn)接到30'C預(yù)熱的1000ml 2YTGAK(2YT+P/。葡萄糖+amp+kan)中，30。C振搖過夜(應(yīng)達(dá)到12小時(shí))。次日，離心10min (4'C )，收上清。在上清中加入1/5體積的PEG/NaCl (20%的PEG6000, 2.5M的NaCl)，混勻， 4匸靜置1小時(shí)以上沉淀噬菌體。然后10000rpm于4'C離心15min,收集噬菌體沉淀并重懸 于5mlPBS中。10000rpm再次離心15min，取上清(沉淀為殘留的細(xì)菌碎片及PEG),放于 4'C備篩庫用。同時(shí)取lpl倍比稀釋進(jìn)行滴度分析。
(八) 噬菌體抗體庫滴度測定
從M9培養(yǎng)基上挑取TG1單克隆于5ml 2YT，振搖過夜。取0.5ml過夜菌接種于50ml 2YT (100ml三角燒瓶)中，37i:振搖至OD600=0.2。將噬菌體抗體庫(步驟(七)、3所得)做 十倍倍比稀釋，從各個(gè)稀釋度各取10 y 1加入到200 u 1 OD600=0.2的TG1中，混勻，37"C水 浴30min。將這200P1細(xì)菌和噬菌體的混合液涂布到含氨芐的2TY瓊脂平板上。倒置放于 37°C，第二天根據(jù)克隆數(shù)計(jì)算噬菌體庫的滴度。
(九) 輔助性噬菌體M13K07的制備
從M9培養(yǎng)基上挑取TG1單克隆接種于5ml 2YT，振搖過夜。取0.5ml過夜菌接種于50ml 2YT (100ml三角燒瓶)中，37。C振搖至OD600=0.2。將M13K07十倍倍比稀釋，從各個(gè)稀 釋度各取10 u 1加入到200 u 1 OD600=0.2的TG1中，混勻，37。C水浴30min。將這200 u 1 細(xì)菌和噬菌體的混合液加入到3ml不燙手的上層瓊脂膠中，稍微晃一下，立即倒入37'C預(yù)熱 的用2TY配制的瓊脂平板上。倒置放于37°C，第二天可出現(xiàn)噬斑。挑取單個(gè)噬斑接種于3 一4ml OD600=0.5的TG1中(制備方法同前，即前一晚從M9上挑克隆，搖菌過夜，第二天 1: 100轉(zhuǎn)接于50ml 2YT中，振搖約2—2.5小時(shí))，37。C振搖2小時(shí)。將這3—4ml感染了 M13K07的TG1接種于500ml2YT中，37'C振搖1小時(shí)。加入卡那(50—70u g/ml),繼續(xù)于 37。C振搖8—16小時(shí)，10000rpm，離心15min，收上清。上清中加入1/5體積的PEG/NaCl (20% 的PEG6000, 2.5M的NaCl),混勻，4。C靜置1小時(shí)以上，10000rpm,離心15min。用20ml含 15X甘油的PBS重懸噬菌體，10000rpm,離心15—20min,收集上清(沉淀為細(xì)菌碎片及PEG)。 噬菌體溶液經(jīng)0.45um濾膜過濾消毒后分裝，凍存于一8(TC，同時(shí)用噬斑的方法測其滴度。(十)乙肝表面抗原a決定簇的表達(dá)純化
乙肝表面抗原a決定簇由53個(gè)氨基酸組成，我們將3個(gè)a決定簇的基因片段首尾相接， 經(jīng)Nhel/Xbal克隆入哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pCDNA3.1， N端由PDGF的信號(hào)肽引導(dǎo)進(jìn)行分 泌表達(dá)，C端有6個(gè)His標(biāo)簽用于蛋白純化。制備3個(gè)首尾相接的a決定簇蛋白的目的在于 分子量大一些的蛋白利于表達(dá)、純化以及篩庫和鑒定時(shí)的抗原包被。構(gòu)建好的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染 入可懸浮、無血清培養(yǎng)的HEK293F細(xì)胞(Invitrogen公司)進(jìn)行蛋白表達(dá)，然后用鎳柱進(jìn)行 親和純化。
三個(gè)首尾相接的a決定簇蛋白的基因序列如下-
TTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTCTAGA
三個(gè)首尾相接的a決定簇蛋白的氨基酸序列如下:
GTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWASR。
(十一)特異性抗體的篩選
用5ml 50pg/ml的上述抗原(即a決定簇蛋白，第一輪)包被25cm2培養(yǎng)瓶，4'C過夜(包 被液為500mM的碳酸氫鈉緩沖液，pH9.6)，第二輪以后包被的抗原濃度降低到10(ag/ml (包 被方法同上)。PBST洗滌后加入5ml含1X10"噬菌體(步驟(七)、3所得)的5%MPBS, 脫色搖床上輕晃30min后室溫水平放置90min以上進(jìn)行抗原抗體的結(jié)合。然后用PBS和PBST 各洗20遍，最后將生長至對(duì)數(shù)生長期的10ml TG1加入培養(yǎng)瓶并于30'C水浴30min讓結(jié)合于 抗原的噬菌體感染TG1。被感染的TG1經(jīng)離心后涂布于10cm 2YTGA平板上，30。C過夜。 再用輔助性噬菌體超感染的方法從被感染并擴(kuò)增了的TG1制備噬菌體，進(jìn)行第二輪篩選。如此反復(fù)進(jìn)行"吸附一洗脫一感染一繁殖"的篩選過程共4輪。 (十二)單克隆噬菌體抗體抗原結(jié)合活性的鑒定
1. 單克隆噬菌體抗體的制備
從最后一輪篩選的平板上挑取單克隆于裝有30(^1 2YTGA的96孔深孔培養(yǎng)板中，37 'C振搖過夜，次日1: 100轉(zhuǎn)接于新的300|il 2YTGA中，37°。振搖2.5小時(shí)，用M13K07 以20: 1的比例進(jìn)行超感染，3500轉(zhuǎn)，離心10min,用300W 2YTGAK重懸細(xì)菌沉淀，30 。C振搖過夜。次日11000轉(zhuǎn)離心15min，取上清進(jìn)行phage ELISA鑒定。
2. Phage ELISA鑒定抗原抗體結(jié)合活性
用乙肝表面抗原a決定簇重組蛋白于4。C過夜包被ELISA板，每孔50nl，濃度為l|ig/ml。 次日用含5%脫脂奶粉的PBS加滿孔室溫封閉2小時(shí)，PBST洗滌2遍，用10(^1含5%脫脂 奶粉的PBS (MPBS)與等體積的含噬菌體的單克隆上清于室溫預(yù)孵育30分鐘后加入ELISA 板與抗原進(jìn)一步孵育1小時(shí)。用PBST洗板6次然后加入HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體的抗體 稀釋度為1:5000。室溫孵育1小時(shí)，PBST洗板6次后加TMB顯色。
(十三)可溶性單鏈抗體的表達(dá)
陽性噬菌體需要感染HB2151才能進(jìn)行可溶性表達(dá)。陽性克隆的噬菌體作10或100倍 倍比稀釋后過0.45的濾膜，取稀釋好的10M1陽性噬菌體去感染200 u 1對(duì)數(shù)生長期的HB2151 。 方法如下生長于M9培養(yǎng)基上的HB2151單克隆于5ml 2YTG中，次日1: 100轉(zhuǎn)接于50ml 2YTG， 37。C振搖至OD600=0.5。加入10^1經(jīng)濾過的、倍比稀釋過的噬菌體，混勻，37。C水 浴30min。鋪涂有奈定酮酸和氨芐的2YTG瓊脂板，37'C過夜。挑單克隆于5ml 2YTGA (含 1%葡萄糖)中，37。C搖過夜。次日1: 100轉(zhuǎn)接于50ml含0.1X葡萄糖的2YTGA中，37°C 振搖至OD600=0.9，加入IPTG至終濃度為lmM， 3(TC振搖過夜，取上清進(jìn)行聚丙烯酰氨凝 膠電泳分析表達(dá)情況，用ELISA鑒定可溶性表達(dá)的單鏈抗體的抗原結(jié)合活性。
(十四)可溶性單鏈抗體的純化
由于單鏈抗體是與6個(gè)組氨酸的標(biāo)簽融合表達(dá)的，所以可溶性表達(dá)上清可以用鎳柱進(jìn)行 親和純化，具體步驟為用PBS平衡親和柱，樣品上柱，50mM的咪唑洗脫非特異的結(jié)合蛋 白，500mM的咪唑洗脫下結(jié)合于鎳柱上的單鏈抗體，用分子篩去除咪唑，緩沖液置換為PBS。
(十五)可溶性單鏈抗體的親和力鑒定用0.1pg/ml和0.05pg/ml兩種不同濃度的a決定簇重組蛋白包被ELISA板，然后加入從 lpM到lpM十倍倍比稀釋的純化過的單鏈抗體孵育1小時(shí)，然后加入抗V5-HRP抗體(單 鏈抗體與V5標(biāo)簽融合表達(dá))孵育1小時(shí)，最后用TMB顯示。根據(jù)ELISA讀數(shù)繪制親和力 曲線，然后求出OD50時(shí)0.1pg/ml和0.05ng/mla決定簇對(duì)應(yīng)的抗體濃度，分別記為[Ab](對(duì) 應(yīng)于0.1pg/ml的a決定簇)和[Ab]'(對(duì)應(yīng)于0.05(ig/ml的a決定簇)，然后用公式Kd=2[Ab]， 一[Ab]計(jì)算單鏈抗體的親和力。
選擇上述親和力最高的單鏈抗體作為本發(fā)明的抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單 鏈抗體，經(jīng)測序，該抗體編碼243個(gè)氨基酸，該單鏈抗體的氨基酸序列為SEQIDNO:l，該 抗體由729個(gè)核苷酸組成，其序列如SEQ ID NO: 4所述。本發(fā)明的抗乙肝病毒表面抗原a決 定簇的人源性單鏈抗體的重鏈可變區(qū)基因編碼120個(gè)氨基酸，序列如SEQIDN0:2所述。該 抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體重鏈可變區(qū)由360個(gè)核苷酸組成，其序列如 SEQ ID NO: 5所述。本發(fā)明的抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體的輕鏈可變區(qū) 基因編碼108個(gè)氨基酸，序列如SEQIDNO:3所述。該抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源 性單鏈抗體輕鏈可變區(qū)由324個(gè)核苷酸組成，其序列如SEQ ID NO: 6所述。
實(shí)施例2、
本發(fā)明的單鏈抗體按照上述方法進(jìn)行親和力鑒定，結(jié)果如圖1。根據(jù)圖1，我們得出以 下結(jié)論本發(fā)明中的單鏈抗體與乙肝表面抗原a決定簇的親和力高達(dá)Kd-2nM，具有潛在的 中和乙肝病毒的功能。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不 限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo) 出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表
SEQ ID NO: 1
Glu lie Val Leu Thr Gin Ger Pro Gly Thr Leu Ger Leu Ger Pro 1 5 10 15
Gly Glu Gly Gla Thr Leu Ger Cys Arg Gla Ger Gin Ger Val Arg 20 25 30
Arg Asn Leu lie Gla Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Gla Pro 35 40 45
Arg Leu Leu lie His Gly Gla Ger lie Arg Gla Thr Gly lie Pro 50 55 60
Asp Lys Phe Ger Gly Ger Gly Ger Gly Thr Arg Phe lie Leu Gla 65 70 75
lie Ger Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Gla Val Phe Tyr Cys His 80 85 90
Gin Tyr Gly Ger Ger Pro Arg Thr Phe Gly .Gln Gly Thr Lys Leu 95 100 105
Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ger Gly Gly Gly Gly Ger Gly Gly 110 115 120
Gly Gly Ger Glu Val Gin Leu Val Glu Ger Gly Pro Gly Leu Val 125 130 135
Lys Pro Ger Glu Thr Leu Ger Leu Thr Cys Thr Val Ger Gly Gly 140 145 150
Ger lie Ger Ger Tyr Tyr Trp Ger Trp lie Arg Gin Pro Gla Gly 155 160 165Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly Glu lie Asn His Ger Gly Ger Thr 170 175 180
Asn Tyr Asn Pro Ger Leu Lys Ger Arg Val Thr lie Ger Val Asp 185 190 195
Thr Ger Lys Asn Gin Phe Ger Leu Lys Leu Thr Ger Val Thr Gla 200 205 210
Gla Asp Thr Gla Leu Tyr Phe Cys Gla Arg Val Gly Pro Gin Trp 215 220 225
Leu Val Pro Arg lie Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 230 235 240 Val Ger Ger 243
SEQ ID NO: 2
Glu Val Gin Leu Val Glu Ger Gly ProGly Leu Val Lys Pro Ger 1 5 10 15
Glu Thr Leu Ger Leu Thr Cys Thr Val Ger Gly Gly Ger lie Ger 20 25 30
Ger Tyr Tyr Trp Ger Trp lie Arg Gin Pro Gla Gly Lys Gly Leu 35 40 45
Glu Trp lie Gly Glu lie Asn His Ger Gly Ger Thr Asn Tyr Asn 50 55 60
Phe Ger Leu Lys Ger Arg Val Thr lie Ger Val Asp Thr Ger Lys 65 70 75
Asn Gin Phe Ger Leu Lys Leu Thr Ger Val Thr Gla Gla Asp Thr80 85 90
Gla Leu Tyr Phe Cys Gla Arg Val Gly Pro Gin Trp Leu Val Pro 95 100 105
Arg lie Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ger Ger 110 115 120
SEQ ID NO: 3
Glu lie Val Leu Thr Gin Ger Pro Gly Thr Leu Ger Leu Ger Pro 1 5 10 15
Gly Glu Gly Gla Thr Leu Ger Cys Arg Gla Ger Gin Ger Val Arg 20 25 30
Arg Asn Leu lie GU Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Gla Pro 35 40 45
Arg Leu Leu lie His Gly Gla Ger lie Arg Gla Thr Gly lie Pro 50 55 60
Asp Lys Phe Ger Gly Ger Gly Ger Gly Thr Asp Phe lie Leu Gla 65 70 75
lie Ger Arg Leu Glu Phe Glu Asp Phe Gla Val Phe Tyr Cys His 80 85 90
Gin Tyr Gly Ger Ger Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu 95 100 105 Thr Val Leu 10861 121 181 241 301 361 421 481
說明書第13/14頁
601 661
721 GTCTCCTCA SEQ ID NO: 5
121 181
301
SE(3 ID NO: 6301 CAGGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
權(quán)利要求
1、一種抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體，其特征在于該單鏈抗體的氨基酸序列為SEQ ID NO1。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體，其特征在 于該抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO: 2。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體，其特征在 于該抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO: 3。
4、 如權(quán)利要求1所述的抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體在制備預(yù)防性 被動(dòng)免疫藥物中的應(yīng)用。
5、 如權(quán)利要求1所述的抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體在制備治療慢 性乙型病毒性肝炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體，其氨基酸序列為SEQ ID NO1。該抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO2，該抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO3。該抗乙肝病毒表面抗原a決定簇的人源性單鏈抗體可用于制備預(yù)防性被動(dòng)免疫藥物或者制備治療慢性乙型病毒性肝炎藥物。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101658671SQ20091010062
公開日2010年3月3日 申請日期2009年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月13日
發(fā)明者劉向昕, 森 韓, 韓月恒 申請人:杭州屹源生物技術(shù)有限公司