專利名稱：：紫蘇葉油的鑒別方法和測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及紫蘇葉油的指紋圖譜鑒別方法及紫蘇葉油中紫蘇烯和紫蘇醛的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
：紫蘇葉油是藿香正氣口服液中主要成分之一，具有解表散寒，行氣和胃的功效。紫蘇葉油為唇形科植物紫蘇Pm7/a#W^^w(L.)Britt.的干燥葉(或帶嫩枝葉)經(jīng)水蒸氣蒸餾提取的揮發(fā)油。為淺黃色或黃色的澄清液體，有紫蘇的特異香氣，味微辛辣。露置空氣中或貯存日久，色漸變深，質(zhì)漸濃稠。在乙醇、乙醚或石油醚中易溶，在水中幾乎不溶。它含有紫蘇醛、紫蘇烯、檸檬烯、石竹烯等主要成分，經(jīng)篩選檸檬烯、石竹烯非紫蘇特征成分，紫蘇葉油中最大組分為紫蘇醛(Perillaldehyde)，同時(shí)也是主要藥效成分，它的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為-分子式C1QH140;分子量149.99。在藥理上，紫蘇葉油與紫蘇醛都具有明顯的抗皮膚真菌作用，紫蘇醛與檸檬醛對(duì)皮膚絲狀真菌生長(zhǎng)有協(xié)同抑制作用[5]。紫蘇醛和植物甾醇協(xié)同作用可使小鼠睡眠時(shí)間延長(zhǎng)而顯示鎮(zhèn)靜作用問。紫蘇烯(Perillene)化學(xué)結(jié)構(gòu)式為6<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>分子式為C1()H140;分子量為150.08。目前關(guān)于它的藥理研究報(bào)道很少。目前全國(guó)有數(shù)十家生產(chǎn)廠家(主要是化工廠或香料廠)提供紫蘇葉油，但一直沒有統(tǒng)一的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)由于紫蘇資源豐富，紫蘇屬植物的分類一直混亂，所得揮發(fā)油的成分差異大，因此紫蘇葉油質(zhì)量差次不齊[2]。為此，我們經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究確定了反映紫蘇葉油質(zhì)量的具體指標(biāo)，并建立了這些質(zhì)量指標(biāo)的檢測(cè)方法，從而完成了本發(fā)明。發(fā)明目的本發(fā)明目的是提供紫蘇葉油的鑒別方法，其特征在于供試品指紋圖譜與對(duì)照紫蘇葉油指紋圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)模擬相似度計(jì)算軟件計(jì)算，相似度不得小于O.90。本發(fā)明另外一個(gè)目的是提供紫蘇葉油中紫蘇烯和紫蘇醛的測(cè)定方法。紫蘇葉油的指紋圖譜鑒別方法，步驟為-(a)色譜條件色譜柱為彈性石英毛細(xì)管柱，固定相為二苯基-二甲基聚硅氧垸、苯基-甲基聚硅氧烷、腈丙苯基-二甲基硅氧烷、腈丙甲基-苯甲基聚硅氧烷或聚乙二醇；程序升溫的初始溫度5080。C，保持815分鐘，以每分鐘5KTC的速率升溫至100120。C，保持2040分鐘，再以每分鐘103(TC的速率升溫至22027(TC，保持38分鐘；檢測(cè)器250300。C，氣化溫度240270。C;分流比(1040):1;檢測(cè)器為氫火焰檢測(cè)器或質(zhì)荷比范圍為101000質(zhì)譜檢測(cè)器；(b)參照物溶液的制備取紫蘇醛對(duì)照品適量，精密稱定，加入l:l體積比的無水乙醇-正己烷溶液制成每lml含1.00mg的溶液，即得；(c)對(duì)照紫蘇葉油溶液的制備取對(duì)照紫蘇葉油約30mg，精密稱定，置2ml進(jìn)樣瓶中，精密加入l:l體積比的無水乙醇-正己垸溶液lml，搖勻，即得；(d)供試品溶液的制備取紫蘇葉油約30mg，精密稱取，置2ml進(jìn)樣瓶中，精密加入1:l體積比的無水乙醇-正己烷溶液lml,搖勻，即得；(e)測(cè)定法精密吸取對(duì)照紫蘇葉油溶液、供試品溶液和參照物溶液各1Pl，注入氣相色譜儀，測(cè)定；供試品指紋圖譜與對(duì)照紫蘇葉油指紋圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)模擬相似度計(jì)算軟件計(jì)算，相似度不得小于0.90。優(yōu)選紫蘇葉油的指紋圖譜鑒別方法，其中(a)色譜條件彈性石英毛細(xì)管柱用交聯(lián)5%苯基甲基聚硅氧垸作為固定相；程序升溫初始溫度6(TC，保持10分鐘，以每分鐘8"C的速率升溫至115'C，保持30分鐘，再以每分鐘15'C的速率升溫至23(TC，保持5分鐘；檢測(cè)器25(TC，氣化溫度250'C;分流比30:1;(b)參照物溶液的制備取紫蘇醛對(duì)照品適量，精密稱定，加入l:l體積比的無水乙醇-正己垸溶液制成每lml含1.00mg的溶液，即得；(C)對(duì)照紫蘇葉油溶液的制備取對(duì)照紫蘇葉油約30mg，精密稱定，置2ml進(jìn)樣瓶中，精密加入l:l體積比的無水乙醇-正己垸溶液lml，搖勻，即得；(d)供試品溶液的制備取紫蘇葉油約30mg，精密稱取，置2ml進(jìn)樣瓶中，精密加入1:l體積比的無水乙醇-正己垸溶液lml，搖勻，即得；(e)測(cè)定法精密吸取對(duì)照紫蘇葉油溶液、供試品溶液和參照物溶液各1u1，注入氣相色譜儀，測(cè)定；供試品指紋圖譜與對(duì)照紫蘇葉油指紋圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)模擬相似度計(jì)算軟件計(jì)算，相似度不得小于0.90。本發(fā)明紫蘇葉油中紫蘇烯和紫蘇醛的測(cè)定方法，步驟為(a)色譜條件色譜柱為彈性石英毛細(xì)管柱，固定相為二苯基-二甲基聚硅氧烷、苯基-甲基聚硅氧烷、腈丙苯基-二甲基硅氧烷、腈丙甲基-苯甲基聚硅氧烷、聚乙二醇；程序升溫的初始溫度508(TC，保持815分鐘，以每分鐘515。C的速率升溫至100150°C，保持14分鐘，再以每分鐘240""C的速率升溫至220270'C，保持16分鐘；檢測(cè)器250300°C，氣化溫度240270。C;分流比(1050)1;檢測(cè)器可以為氫火焰檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器(質(zhì)荷比范圍為101000);(b)對(duì)照品溶液的制備取紫蘇醛、紫蘇烯對(duì)照品適量，精密測(cè)定，加l:l體積比的無水乙醇-正己垸溶液制成每lml分別含紫蘇醛1.OOmg、紫蘇烯1.OOmg溶液，即得；(C)被測(cè)定的供試品溶液的制備取被測(cè)定的紫蘇葉油約20mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加1:l體積比的無水乙醇-正己烷溶液至刻度，搖勻，即得；(d)測(cè)定方法分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1u1，注入氣相色譜儀，測(cè)定，即得；被測(cè)品中紫蘇烯不得少于20%;含紫蘇醛不得少于25%。.優(yōu)選，紫蘇葉油中紫蘇烯和紫蘇醛的測(cè)定方法，其中(a)色譜條件彈性石英毛細(xì)管柱，交聯(lián)5%苯基甲基聚硅氧垸為固定相；程序升溫初始溫度6(TC，保持10分鐘，以每分鐘8-C的速率升溫至115°C，保持2分鐘，再以每分鐘3(TC的速率升溫至230°C，保持4分鐘;檢測(cè)器25(TC,氣化溫度25(TC;分流比15:1;理論板數(shù)以紫蘇醛峰計(jì)算應(yīng)不低于50000;(b)對(duì)照品溶液的制備取紫蘇醛、紫蘇烯對(duì)照品適量，精密測(cè)定，加l:l體積比的無水乙醇-正己垸溶液制成每lml分別含紫蘇醛1.OOmg、紫蘇烯1.OOmg溶液，即得；(c)被測(cè)定的供試品溶液的制備取被測(cè)定的紫蘇葉油約20mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加1:l體積比的無水乙醇-正己垸溶液至刻度，搖勻，即得；(d)測(cè)定方法分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1P1，注入氣相色譜儀，測(cè)定，即得；被測(cè)品中紫蘇烯不得少于20%;含紫蘇醛不得少于25%。10我們收集了全國(guó)多個(gè)產(chǎn)地的紫蘇葉，采取傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法提取其中的紫蘇葉油，進(jìn)行了多個(gè)方面的對(duì)比試驗(yàn)。重慶產(chǎn)紫蘇葉提取的紫蘇葉油質(zhì)量更穩(wěn)定，在此基礎(chǔ)上起草了紫蘇葉油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。收集20批紫蘇葉藥材，其中10批為重慶本地產(chǎn)紫蘇葉，10批購(gòu)于各地藥材市場(chǎng)，藥材來源見表l。表1紫蘇葉藥材產(chǎn)地來源M^將收集的藥材采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，備用。經(jīng)多批自提紫蘇葉油的觀察品嘗試驗(yàn)，該品為淺黃色或黃色的澄清液體，有紫蘇的特異香氣，味微辛辣。經(jīng)常溫穩(wěn)定性考察12月及冷處貯存24月考察，該品顏色加深，漸變棕色，質(zhì)漸濃稠。該品與乙醇、乙醚或石油醚的相溶性試驗(yàn)取紫蘇葉油lml，加入5ml95。/。乙醇中，紫蘇葉油能完全溶解。取紫蘇葉油lml，加入5ml乙醚中，紫蘇葉油能完全溶解。取紫蘇葉油lml，加入5ml石油醚中，紫蘇葉油能完全溶解。該品在乙醇、乙醚或石油醚中易溶。一、紫蘇烯和紫蘇醛指標(biāo)及其測(cè)定方法Zsy-1Zsy-2Zsy-3Zsy-4Zsy-5Zsy-6Zsy-7Zsy-8Zsy-9Zsy—10Zsy-11Zsy-12Zsy-13Zsy-14Zsy-15Zsy-16Zsy-17Zsy-18Zsy-19Zsy—20-lmll-lm一l-lmll-lmll-lmll-111一一la一一llal￡一一lalIB13Ipsl13IJBI1lts!luntilfal13江蘇北州南西東江川川龍I黑江河l女湖江山浙四四在藥理上，紫蘇葉油與紫蘇醛都具有明顯的抗皮膚真菌作用，紫蘇醛與檸檬醛對(duì)皮膚絲狀真菌生長(zhǎng)有協(xié)同抑制作用[5]。紫蘇醛和植物甾醇協(xié)同作用可使小鼠睡眠時(shí)間延長(zhǎng)而顯示鎮(zhèn)靜作用[61。紫蘇醛為紫蘇的有效成分，我們對(duì)采集的各地的20批藥材提取的紫蘇葉油進(jìn)行了紫蘇醛含量測(cè)定，結(jié)果見表5。表5藥材中紫蘇醛含量測(cè)定批次紫蘇醛含量％批次紫蘇醛含量％Zsy-136.7Zsy-11----Zsy-230.2Zsy-121.34Zsy-337.0Zsy-13Zsy-432.1Zsy-14Zsy-525.0Zsy_1538.8Zsy-633.2Zsy-1635.7Zsy-727.3Zsy-1718.6Zsy-826.1Zsy-1822.3Zsy-933.5Zsy-1938.5Zsy-lO29.4Zsy-2030.2從以上結(jié)果可以看出，各地產(chǎn)紫蘇葉中紫蘇醛含量差異較大。為了更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證產(chǎn)品的品質(zhì)，我廠限定紫蘇葉產(chǎn)地為重慶產(chǎn)紫蘇葉，并對(duì)紫蘇葉提取的紫蘇葉油進(jìn)行了指紋圖譜研究。.1、儀器、試藥和樣品Agilent6890N氣相色譜儀(氫火焰離子化檢測(cè)器，F(xiàn)ID，Agilent氣相色譜工作站)；國(guó)家藥典委員會(huì)"中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004版"軟件；無水乙醇、正己烷均為分析純；紫蘇醛對(duì)照品為自制。2、供試品溶液制備稱取紫蘇葉油約30mg，精密稱定，置2ml進(jìn)樣瓶中，精密加入無水乙醇-正己烷(1:1)溶液lml，搖勻，即得。3、參照物的選擇和參照物溶液制備3.1、參照物的選擇紫蘇葉油中最大組分為紫蘇醛，同時(shí)也是主要藥效成分，在色譜圖中具有最大峰高和峰面積，性質(zhì)穩(wěn)定且易于辨認(rèn)，所以我們選擇紫蘇醛作參照物。3.2、參照物溶液的制備取紫蘇醛對(duì)照品適量，精密稱定，加入無水乙醇-正己垸(1:1)溶液制成每lml含1.OOmg的溶液，即得。4、色譜條件的選擇4.1、色譜柱的選擇鑒于紫蘇葉油的成分較復(fù)雜，為使各成分之間有較好的分離度，同時(shí)使其色譜行為有好的重現(xiàn)性，我們選有了HP-5、DM-17、HP-INNOWAX3種不同極性的商品化毛細(xì)色譜柱做試驗(yàn)。通過觀察其對(duì)紫蘇葉油的分離情況，比較相關(guān)指標(biāo)，我們發(fā)現(xiàn)三種色譜柱對(duì)樣品的分離度均較好，但HP-5對(duì)紫蘇葉油中主要藥效成分，同時(shí)也是最大組分紫蘇醛色譜峰的峰形對(duì)稱性最好。所以我們選擇HP-5作色譜柱。4.2、升溫程序的選擇為了得到好的分離度，我們?cè)囉昧巳缦律郎爻绦颌俪跏紲囟?(TC，保持10分鐘；以每分鐘8'C升溫速率升至115°C,保持10分鐘；再以每分鐘2-C升溫速率升至14(TC，后以1(TC每分鐘升溫速率升至23(TC，保持5分鐘。②初始溫度70'C，保持10分鐘；以每分鐘sx:升溫速率升至ll(TC，保持5分鐘；再以每分鐘rC升溫速率升至130'C，后以每分鐘1(TC升溫速率升至23(TC，保持5分鐘。③初始溫度6(TC，保持10分鐘；以每分鐘8。C升溫速率升至115°C，保持30分鐘；后以每分鐘15'C升溫速率升至23(TC，保持5分鐘。通過比較三種程序升溫條件，條件③能得到的分離效果好，出峰時(shí)間短。我們選擇條件③作為本方法的程序升溫條件。我們初步擬定色譜條件為彈性石英毛細(xì)管柱(柱長(zhǎng)30m，內(nèi)徑0.32mm,膜厚度0.25um)HP-5(交聯(lián)5%苯基甲基聚硅氧烷為固定相)；程序升溫初始溫度6(TC，保持10分鐘，以每分鐘8'C的速率升溫至115X:，保持30分鐘，再以每分鐘15'C的速率升溫至23(TC,保持5分鐘；檢測(cè)器250。C，氣化溫度25(TC;分流比30:1。4.3、方法學(xué)考察4.3.1、精密度試驗(yàn)4.3.1.1、指標(biāo)峰的確認(rèn)精密稱取紫蘇葉油(批號(hào)zsy880701)約30mg，按照"供試品溶液制備"項(xiàng)操作，按擬定色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。同時(shí)測(cè)定參照物溶液，確定內(nèi)參比峰。分析色譜圖，我們按照單峰面積大于1%總面積的色譜峰作為指標(biāo)峰的原則3，共確認(rèn)了6個(gè)指標(biāo)峰,見圖1和圖2。4.3.1.2、精密度測(cè)定精密稱取紫蘇葉油(批號(hào)zsy880701)約30mg，按照"供試品溶液制備"項(xiàng)操作，按擬定色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖。計(jì)算各指標(biāo)峰與內(nèi)參比峰(s)的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果表明，各指標(biāo)峰與內(nèi)參比峰(s)的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積基本一致，RSD均小于1.5096，符合指紋圖譜要求，見表6、表7。表6各指標(biāo)色譜峰相對(duì)保留時(shí)間~~SS指標(biāo)色譜峰峰號(hào)14<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>4.3.2、重現(xiàn)性試驗(yàn)精密移取紫蘇葉油(批號(hào)zsy880701)約30mg，按照"供試品溶液制備"項(xiàng)操作，制備5份，按擬定色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以"精密度試驗(yàn)"項(xiàng)下選定的指標(biāo)峰為觀測(cè)峰，計(jì)算各指標(biāo)峰與內(nèi)參比峰(S)的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果表明，各色譜峰與內(nèi)參比峰(3)的相對(duì)保齒時(shí)間和相對(duì)峰面積基本一致，RSD均小于1.50%,符合指紋圖譜要求，見表8、表9。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表9各指標(biāo)色譜峰相對(duì)峰面積<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>10.36420.363530,361440.362650.3643RSD，N=50.29%4.3.3、穩(wěn)定性考察精密移取紫蘇葉油(批號(hào)zsy880701)約30mg，按照"供試品溶液制備"項(xiàng)操作，分別于O，2，4,6，8小時(shí)進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以"精密度試驗(yàn)"項(xiàng)下選定的指標(biāo)峰為觀測(cè)峰，各指標(biāo)峰與內(nèi)參比峰(3)的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積基本一致，RSD均小于1.50%，符合指紋圖譜要求，見表IO、表ll。表IO各指標(biāo)色譜峰相對(duì)保留時(shí)間間隔時(shí)間/h指標(biāo)色譜峰峰號(hào)12S(3)45600.48130.708711.04591.31571.629620.4820.709211.04591.31561.629540.48180.708811.04571.31521.628960.48170.708811.04561.3151.628680.48130.708711.04591.31571.6296RSD,N=50.06%0.09%0.08%0.07%0.07%表ll各指標(biāo)色譜峰相對(duì)峰面積間隔時(shí)間/h-指標(biāo)色譜峰峰號(hào)123(s)45600.36850.864310.03610.26760.243220.36560.872110.03580.26210.240840.36520.861210.03520.26310.24360.36470.866610.03640.2690.242180.36120.862110.03570.26540.2446RSD,N=50.64%0.45%1.12%0.98%0.52%4.4、紫蘇葉油GC指紋圖譜的建立4.4.1、樣品測(cè)定以10批紫蘇葉藥材所提紫蘇葉油為研究對(duì)象，進(jìn)行GC指紋圖譜研究。將10批藥材提取所得紫蘇葉油按"供試品溶液制備"項(xiàng)操作,分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。0.862210.03580.26620.24520.871410.03520.26340.2470.865210.03460.26290.24320.864810.03510.26870.24160.868610.03460.2660.24590.37%1.27%0.79%0.7W4.4.2、紫蘇葉油GC指紋圖譜的建立及質(zhì)量評(píng)價(jià)將IO批樣品色譜圖導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)"中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004版"軟件中建立共有模式。選取"時(shí)間窗"寬度為O.lmin，經(jīng)校準(zhǔn)后，軟件即生成"對(duì)照?qǐng)D譜"。參與共有模式建立的10批樣品色譜圖、對(duì)照色譜圖，見圖3和圖4。4.4.3、共有特征峰的確認(rèn)根據(jù)參與建立共有模式的10批樣品色譜圖，標(biāo)定了共有指紋特征峰10個(gè)，典型色譜圖及共有特征峰標(biāo)定見圖5,IO批樣品色譜圖共有指紋特征峰匹配結(jié)果見附表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>4.4.4、IO批樣品的指紋圖譜測(cè)定將對(duì)照?qǐng)D譜與IO批樣品色譜圖全譜導(dǎo)入"中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004B版"軟件中，軟件即計(jì)算出樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度數(shù)，見表12。表12IO批樣品的指紋圖譜測(cè)定結(jié)果樣品批號(hào)相似度Zsy-l0.996Zsy-20.996Zsy-30.997Zsy-40.982Zsy-50.989Zsy-60.991Zsy-70.989Zsy-80,989Zsy-90.978ZSY-100.9934.4.5、對(duì)照紫蘇葉油的選擇根據(jù)10批樣品的指紋圖譜測(cè)定結(jié)果，我們選擇相似度最高，色譜"地貌"與對(duì)照色譜最接近，樣品批號(hào)為Zsy080905樣品為對(duì)照紫蘇葉油。對(duì)照紫蘇葉油樣品色譜圖見圖6。5、對(duì)10批大生產(chǎn)提取紫蘇葉油的指紋圖譜測(cè)定為保證藿香正氣口服液用紫蘇葉油質(zhì)量，我們對(duì)生產(chǎn)規(guī)模提取的紫蘇葉油進(jìn)行了指紋圖譜相似度測(cè)定，結(jié)果見表13。表1310批紫蘇葉油指紋圖譜相似度測(cè)定結(jié)果批號(hào)_相似度Zsy8808010.987Zsy8808020.970Zsy8808030.983Zsy8808040.956Zsy8808050.932Zsy8808060.91419Zsy880807Zsy880901Zsy880902Zsy8809020.9610.9230.9520.920根據(jù)結(jié)果，考慮到大生產(chǎn)影響因素較多，同時(shí)考慮到藥材質(zhì)量的波動(dòng)性，參考國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的"中藥注射劑色譜指紋圖譜實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)指南(試行)"中優(yōu)質(zhì)藥材的定義(質(zhì)量一般藥材和偽品藥材的相似度劃分界限，將相似度在0.90以上的藥材，判定為優(yōu)質(zhì)藥材；相似度在0.80-0.90之間的藥材判定為質(zhì)量一般藥材；相似度低于0.80的藥材判定為偽品)，我們規(guī)定紫蘇葉油的相似度不得低于0.90。二、含量測(cè)定指標(biāo)的確定及其測(cè)定方法紫蘇葉油的提取:取紫蘇葉藥材100.0g，加水800ml，按2005版中國(guó)藥典1附錄"揮發(fā)油測(cè)定法"中甲法用揮發(fā)油提取器提取5小時(shí)，分取油狀液體，即得紫蘇葉油。1、含量測(cè)定指標(biāo)的選擇紫蘇葉油由紫蘇葉提取而得，紫蘇醛、紫蘇烯、檸檬烯、石竹烯為其主要成分，經(jīng)篩選檸檬烯、石竹烯非紫蘇特征成分，紫蘇葉油中最大組分為紫蘇醛，同時(shí)也是主要藥效成分，在色譜圖中具有最大峰高和峰面積，性質(zhì)穩(wěn)定且易于辨認(rèn)，所以我們選擇紫蘇醛作含量領(lǐng)!l定指標(biāo)。但是我們通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，含有紫蘇烯和紫蘇醛的紫蘇葉油對(duì)促進(jìn)小腸蠕動(dòng)作用更加顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明紫蘇烯預(yù)防性給藥后對(duì)小鼠耳殼巴豆油致炎有顯著的抑制作用(P〈0.05);紫蘇烯(相當(dāng)于成人劑量1040倍)與藿香正氣液對(duì)小鼠小腸蠕動(dòng)(墨汁推進(jìn)率)有明顯的促進(jìn)作用(P<0.05);并且紫蘇烯還具有抗菌效果。因此，我們也選擇紫蘇烯作含量測(cè)定指標(biāo)。因?yàn)樽鳛楹繙y(cè)定指標(biāo)的紫蘇烯和紫蘇醛都是紫蘇葉油中揮發(fā)性成分，所以我們選擇氣相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定。2、儀器與試藥儀器Agilent6890GC系列氣相色譜儀包括柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器，F(xiàn)ID檢測(cè)器。無水乙醇、正己垸均為分析純；紫蘇醛、紫蘇烯對(duì)照品自制。3、色譜條件的選擇3.l.色譜柱的選擇根據(jù)揮發(fā)油的多組分和沸點(diǎn)不一樣的特性，同時(shí)使其色譜行為有好的重現(xiàn)性，我們選擇了商品化的HP-5毛細(xì)色譜柱做試驗(yàn)。通過分析其對(duì)紫蘇葉油的色譜行為，對(duì)紫蘇醛、紫蘇烯的分離度好，色譜峰對(duì)稱性好，所以我們選擇HP-5作本方法的色譜柱。3.2.升溫程序的選擇為了得到好的分離度，我們?cè)囉昧巳缦律郎爻绦颌俪跏紲囟?0°C，保持5分鐘；以l(TC每分鐘升溫速率升至115°C，保持10分鐘；后以3(TC每分鐘升溫速率升至23(TC，保持5分鐘。②初始溫度8(TC，保持5分鐘；以8'C每分鐘升溫速率升至115t:，保持10分鐘；后以2(TC每分鐘升溫速率升至23(TC，保持5分鐘。③初始溫度8(TC,保持5分鐘；以8。C每分鐘升溫速率升至115i:，保持2分鐘；后以3(TC每分鐘升溫速率升至23(TC，保持4分鐘。通過比較三種程序升溫條件，條件③能得到的分離效果好，出峰時(shí)間短。我們選擇條件③作為本方法的程序升溫條件。我們擬訂色譜條件為采用彈性石英毛細(xì)管柱(柱長(zhǎng)30m，內(nèi)徑0.32mm，膜厚度0.25um)HP-5(交聯(lián)5%苯基甲基聚硅氧垸為固定相)；程序升溫初始溫度8(TC，保持5分鐘，以每分鐘8T:的速率升溫至115。C，保持2分鐘，再以每分鐘30。C的速率升溫至23(TC,保持4分鐘；檢測(cè)器25(TC，氣化溫度250'C;分流比15:1。4方法學(xué)考察4.1色譜條件Agilent6890N氣相色譜儀(氫火焰離子化檢測(cè)器，F(xiàn)ID，Agilent氣相色譜工作站)21用彈性石英毛細(xì)管柱(柱長(zhǎng)30m，內(nèi)徑0.32mm，膜厚度0.25um)HP-5(交聯(lián)5。/。苯基甲基聚硅氧烷為固定相)；程序升溫初始溫度8(TC，保持5分鐘，以每分鐘8'C的速率升溫至115"C，保持2分鐘，再以每分鐘3(TC的速率升溫至23(TC，保持4分鐘；檢測(cè)器25(TC,氣化溫度250。C;分流比15:1。4.2對(duì)照品溶液的制備取紫蘇烯、紫蘇醛對(duì)照品適量，精密稱定，加無水乙醇-正己烷(1:1)溶液4制成每lml含紫蘇烯l.OOmg、紫蘇醛1.OOmg的混合溶液，搖勻，即得。4.3供試品溶液的制備取本品約20mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加無水乙醇-正己垸(1:1)至刻度，搖勻，即得。4.4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)依法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液；另取無水乙醇-正己烷(1:1)溶液作陰性樣品。照擬定色譜條件分別進(jìn)樣分析，結(jié)果表明在此色譜條件下溶液對(duì)樣品無干擾，色譜圖見附圖2。4.5線性關(guān)系考察'4.5.1紫蘇烯線性關(guān)系考察精密稱取紫蘇烯對(duì)照品0.06065g，置25ml量瓶中，加無水乙醇配制成濃度為2.426mg/ml的對(duì)照品溶液。再分別精密吸取0.5、1.0、3.0、5.0、10.0ml于10ml量瓶中，加無水乙醇-正己烷(1:1)溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。照擬定色譜條件，分別進(jìn)樣lnl測(cè)定峰面積。結(jié)果見表14。表14紫蘇烯線性測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>以進(jìn)樣量X(Mg)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖7)。按照最小二乘法原理進(jìn)行回歸，紫蘇烯在0.12132.426Mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=946.910X-3.198(r=0.99997)4.5.2紫蘇醛線性關(guān)系考察精密稱取紫蘇醛對(duì)照品0.25121g，置100ml量瓶中，加無水乙醇配制成濃度為2.5121mg/ml的對(duì)照品溶液。再分別精密吸取5.0、10.0、15.0、20.0、25.0ml于25ml量瓶中，加無水乙醇-正己'烷(1:1)溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。照擬定色譜條件，分別進(jìn)樣1"1測(cè)定峰面積。結(jié)果見表15。表15紫蘇醛線性測(cè)定結(jié)果進(jìn)樣量(Hg)0.502421.004841.507262.009682.5121平均峰面積460.22900.321343.11790,22248.7以進(jìn)樣量X(Pg)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖8)。按照最小二乘法原理進(jìn)行回歸，紫蘇醛在0.502422.512Wg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y二891.494X+4.000(r二O.99998)4.6精密度試驗(yàn)取紫蘇烯、紫蘇醛對(duì)照品適量，加無水乙醇-正己垸(1:1)溶液制成每lml含紫蘇烯0.8382mg、含紫蘇醛1.2783mg的混合溶液，照擬定色譜條件，取1y1注入氣相色譜儀，連續(xù)測(cè)定5次，其紫蘇烯峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.26%;紫蘇醛峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.50%。結(jié)果表明，精密度良好，見表16。表16精密度試驗(yàn)結(jié)果(n二5)測(cè)定次數(shù)12345RSD紫蘇烯峰面792.12790.15789.72786,56788.500.27%積紫蘇醛峰面1143.21140.31150.31148.71136.50.51%積046254.7重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取紫蘇葉油(批號(hào):zsy880701)0.0196，0.0192，0.0205，0.0199,0.0202g，共5份，分別置10ml量瓶中，加無水乙醇-正己烷(1:1)至刻度，搖勻，照擬定色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表17。表17重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(『5)樣品號(hào)i2345RSD紫蘇烯含量a)36.4036.2835.9636.0536.130.49紫蘇醛含量(％)56.5255.9456.7756.4356.050.615份紫蘇烯平均含量為36.16%，RSD=0.49%;紫蘇醛含量56.34%，RSD=0.61%。結(jié)果表明，重復(fù)性良好。4.8穩(wěn)定性試驗(yàn)精密紫蘇葉油(批號(hào)批號(hào)zsy880701)0.0195g，按供試品溶液的制備方法處理，照擬定色譜條件，每隔2小時(shí)測(cè)定一次，各進(jìn)樣lul，共測(cè)定5次，其中紫蘇葉油中紫蘇烯的含量均值為36.48%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.83%;紫蘇醛的含量平均值為56.11%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.49%。結(jié)果表明，紫蘇葉油中紫蘇烯、紫蘇醛的含量在8小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，見表18表18穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n二5)測(cè)定時(shí)間(h)02468RSD紫蘇烯含量％36.4236.8536.7236.1136.320.83紫蘇醛含量％55.9856.0156.4555.7856.320.494.9、加樣回收試驗(yàn)精密稱取紫蘇葉油(批號(hào)zsy880701，紫蘇烯含量為36.16%,紫蘇醛含量為56.34%)0.0098，0.0091，0.0089，0.0093，0.0089，0.0094g，共六份，分別置10ml量瓶中，依次精密加入每lml含紫蘇烯對(duì)照品0.6805mg，含紫蘇醛對(duì)照品1.0832mg溶液5ml，加無水乙醇-正己烷(1:1)溶液至刻度，搖勻，照擬定色譜條件測(cè)定紫蘇烯、紫蘇醛的含量，計(jì)算回收率，測(cè)定結(jié)果見表19、見表20。測(cè)得量樣品含有量回收率-X10(%加入量表19紫蘇葉油加紫蘇烯對(duì)照品的回收試驗(yàn)結(jié)果樣品編號(hào)樣品中紫蘇烯的量(mg)紫蘇烯加入量(mg)紫蘇烯測(cè)得量(mg)回收率(%)13.54373.40256.920599.2423.50753.40256.906199.8933.43523.40256.9052101.9843.68833.40257.088599.9353.47143.40256.9038100.8863.39903.40256.8505101.44以上六份的紫蘇烯平均回收率為100.56%，RSD為1.05%。表20紫蘇葉油加紫蘇醛對(duì)照品的回收試驗(yàn)結(jié)果樣品編號(hào)樣品中紫蘇醛的量(mg)紫蘇醛加入量(mg)紫蘇醛測(cè)得量(mg)回收率(%)15.52135.416010.926599.8025.46505.416010.864799.7035.35235.416010.764099.9245.74675.416011.059898.1055.40865.416010.782999.2365.29605.416010.666599.16以上六份的紫蘇醛平均回收率為99.32%，RSD為0.68%。由以上實(shí)驗(yàn)可知，本法可準(zhǔn)確測(cè)定樣品中紫蘇烯、紫蘇醛含量，其分離度好、靈敏度高，回收率也很好，因而可以作為控制紫蘇葉油質(zhì)量的一個(gè)可靠方法。5、樣品的測(cè)定及限度的制定。按前文擬定項(xiàng)目對(duì)20批紫蘇葉油進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表21。_表2120批紫蘇葉油質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果_批次性狀檢査^|，~~Zsy-l符合規(guī)定^合規(guī)定^^Zsy-2符合規(guī)定符合規(guī)定25.130.225注:----表示未檢出從以上結(jié)果可以看出不同產(chǎn)地紫蘇葉提取的揮發(fā)油成分差異較大，重慶本地產(chǎn)紫蘇葉有效成分紫蘇醛、紫蘇烯含量更穩(wěn)定。為了更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量，確定采用重慶本地產(chǎn)紫蘇葉進(jìn)行批量提取試驗(yàn)，結(jié)果見表22。表22十批大生產(chǎn)紫蘇葉油含量測(cè)定結(jié)果批號(hào)份數(shù)紫蘇烯含(%)平均值(%)紫蘇醛(%)平均值(%)zsy88080126.4226.3826.4025.9426.2126.08zsy88080222.5522.4522.5032.3332.1232.22zsy88080323.5123.0223.2738.4138.1338.27zsy88080421.1021.4321.2737.8237.3537.58zsy88080525.1025.7625.4337.6237.3237.47zsy88080628.6428.1528.4031.3631.2131.28.zsy88080723.5623.7923.6825.4025.3125.35zsy卿901227.9528.0728.0131.2630.8931.0826Zsy-3Zsy-4Zsy-5Zsy-6Zsy-7Zsy-8Zsy-9Zsy-10Zsy-11Zsy-12Zsy-13Zsy-14Zsy-15Zsy-16Zsy-17Zsy-18Zsy-19Zsy-2020.13Q.524.323.130.729.428.632.71.400.600.811.202.480.9510.8211.9537.032.125.033.227.326.133.529.41.3438.835.718.622.338.530.2定定定定定定定定定定定定定定定定定定規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)合合合合合合合合合合合合合厶n厶n厶n合厶n符符符符符符符符符符符符符符符符符符定定定定定定定定定定定定定定定定定定規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)規(guī)合合合合合合合合合合合合合合合合合合符符符符符符符符符符符符符符符符符符~~Sl"十批樣品測(cè)定結(jié)果，結(jié)合大生產(chǎn)的實(shí)際操作及藥材質(zhì)量波動(dòng)等各種因素，暫擬定紫蘇葉油中紫蘇烯不得少于20%、紫蘇醛不得少于25%。實(shí)驗(yàn)例1:一、試驗(yàn)藥物(1)樣品I:普通紫蘇葉油(紫蘇醛含量40%)0.4呢溶液a00ml含紫蘇葉油0.4ml，1%CMC-Na乳化稀釋)。(2)樣品II:自產(chǎn)紫蘇葉油(紫蘇醛紫蘇烯二25%:15%)0.4%溶液(100ml含紫蘇葉油0.4ml，1%CMC-Na乳化稀釋)。(3)樣品m:組合物(紫蘇醛:紫蘇烯=25%:15%，用90%提取物1%CMC-Na稀釋)0.4%溶液(100ml含組合物0.4ml，1%CMC-Na乳化稀釋)，(4)樣品IV:組合物(紫蘇醛紫蘇烯=15%:25%，用90%提取物1%CMC-Na稀釋)0.4%溶液(100ml含組合物0.4ml，1%CMC-Na乳化稀釋)樣品IIV由太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司提供。(5)對(duì)照品I:藿香正氣液(批號(hào)09060754，太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司生產(chǎn))。(6)對(duì)照品II:藿香正氣液(批號(hào)0807024,北京亞東生物制藥有限公司生產(chǎn))。2.印度墨汁，BDH公司，批號(hào)495860011。臨用時(shí)取墨汁，超聲振蕩至勻。二、試驗(yàn)動(dòng)物健康昆明種小白鼠，雌雄兼用，體重1824g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。三、試驗(yàn)方法與結(jié)果23.3323.0829.6229.1523.2029.3828.3228.6532.7632.2428.4832.5027取昆明種小鼠70只，雌雄各半，隨機(jī)分為7個(gè)組，每組10只，即樣品1iv組、對(duì)照品in組、空白組<樣品i、n、m、iv組與對(duì)照品in組灌胃給藥劑量相當(dāng)于成人劑量的30倍，空白組給予等量的生理鹽水。試驗(yàn)前l(fā)d禁食不禁水，24h后分別灌胃給予各組小鼠含200mL/L墨汁的生理鹽水、樣品iiv和對(duì)照品in的混懸液(樣品和對(duì)照品用1%CMC-Na乳化稀釋，并加入墨汁，臨用時(shí)超聲混勻)，20min后拉頸處死，立即剖取全部小腸，將其自然擺直，不加牽引地平鋪于濕潤(rùn)的玻璃板上，測(cè)量墨汁頭端在腸管內(nèi)移動(dòng)的距離及小腸全長(zhǎng)(從幽門至回盲部)，計(jì)算墨汁推進(jìn)率，結(jié)果見表l。表l.對(duì)小鼠腸蠕動(dòng)的影nf(iS化""o)組別小腸長(zhǎng)度墨汁推進(jìn)距推進(jìn)率(cm)離(cm)(%)樣品I30.85±3.7815.33±3.66樣品II38.17±2.9223.20±5.27樣品m32.33±3.3019.92±3.85樣品IV33.35±4.7320.30土4.01對(duì)照品I30.85±4.1420.31±3.21對(duì)照品II29.40±5.2215.81±4.46空白組34.60±3.2817.09±4.2850.38±13.76P=0.91663.76±10.01P=0.01762.02±12.24P=0.04862.03±7.92P=0.04066.21±9.68P=0.004653.54±9.69P=0.46449.73±12.86注各用藥組推進(jìn)率與生理鹽水組比較，t檢驗(yàn),表i顯示，樣品niv組和對(duì)照品i組對(duì)小鼠墨汁推進(jìn)率與空白組(生理鹽水)比較有顯著性提高(P<0.05);樣品i和對(duì)照品n與空白組比較無顯著性提高(P〉0.05)。實(shí)驗(yàn)例2一、試驗(yàn)藥物1.紫蘇烯供試品(含紫蘇稀90%，由太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠提供)。紫蘇烯在藿香正氣液中含量約為O.01%。取紫蘇烯供試品，用19&CMC-Na乳化并稀釋為含紫蘇烯1.0ul/ml的乳液，冰箱保存，作為紫蘇烯小白鼠灌胃試驗(yàn)用藥，臨用時(shí)充分振搖。取紫蘇烯供試品，用乙醇分別稀釋為含紫蘇烯70ul/ml、140ulml/ml的醇液，作為紫蘇烯小白鼠耳殼試驗(yàn)用藥2.雙氯芬酸二乙胺乳膠劑(扶他靈，批號(hào)X1099，北京諾華制藥有限公司)，規(guī)格1%。3.內(nèi)毒素(批號(hào)900128,湛江安度斯生物有限公司)，規(guī)格50EU/支。4.藿香正氣液(批號(hào)88060064,太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠)，規(guī)格10ml/支。5.巴豆油，自制，乙醇稀釋為含油3%的溶液，作為紫蘇烯小白鼠耳殼致炎試驗(yàn)用藥。6.阿斯匹林，臨用時(shí)用1%濃度的西黃芪膠漿配成含藥20mg/ml的混懸液。7.印度墨汁，BDH公司，批號(hào)495860011。臨用時(shí)取墨汁，超聲振蕩至勻。二、試驗(yàn)動(dòng)物健康昆明種小白鼠，雌雄兼用，體重1824g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；SD大鼠，雌雄兼用，體重190240g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。三、試驗(yàn)方法與結(jié)果1.紫蘇烯對(duì)小鼠耳殼巴豆油致炎的影響取昆明種小白鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，分別于3個(gè)組的小鼠右耳殼兩面涂紫蘇烯0.07ml/ml、0.14ml/ml的醇液(每耳30ul)和雙氯芬酸二乙胺乳膠劑O.lg，第4組為空白組，涂生理鹽水；每日l(shuí)次，連續(xù)給藥3天。于末次給藥后lh，用棉簽沾溫水拭凈小鼠右耳殼兩面，擦干，即涂30ul巴豆油溶液于小鼠右耳殼兩面致炎，致炎lh后拉頸處死動(dòng)物，剪下兩耳片，用4)5mm的打孔器分別將兩耳片同一部位打下，用天平(％。)稱重，每鼠右耳片重量減去左耳片重量即為腫脹度，結(jié)果見表l。表l.小鼠耳殼巴豆油致炎試驗(yàn)結(jié)家(iSD，"-io)組別腫脹度(mg)P紫蘇烯70Pl/ml組紫蘇烯140ul/ml組雙氯芬酸組空白對(duì)照組12.2±3.512.3±6.48.9±3.316.6±3.7P=0.014P=0.015P=1.2E—4注各用藥組與空白對(duì)照組比較，t檢驗(yàn)。表1顯示，紫蘇烯預(yù)防性給藥后對(duì)小鼠耳殼巴豆油致炎有顯著的抑制作用(P〈0.05)2.紫蘇烯對(duì)大鼠內(nèi)毒素致熱的影響大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)2d后，合格大鼠(ld內(nèi)間隔lh連續(xù)兩次測(cè)得肛溫變化《0.3°C,連續(xù)2d)30只，隨機(jī)分為阿斯匹林組、紫蘇稀組、空白組，每組各10只。藥前禁食10h，排空直腸后測(cè)肛溫兩次，每次間隔30min，取均值作為基礎(chǔ)體溫。各組分別腹腔注射內(nèi)毒素溶液10EU/kg，同時(shí)分別灌胃給藥，阿斯匹林組100mg阿斯匹林/kg體重；紫蘇稀組3.3U1紫30蘇稀/kg體重(相當(dāng)于成人劑量100倍)；空白組灌胃等量蒸餾水。分別于給藥后l、2、4、6h測(cè)肛溫，結(jié)果見表2。表2.對(duì)內(nèi)毒素致熱體溫溫差A(yù)T的影響組別體溫差A(yù)Tlh2h4h6h阿斯0.55±0.46±0.37±0.29±匹林0.230.180.280.27組P=0.0517P=0.0105P=5.9E-4P=3.0E-4紫蘇稀組0.79±0.34P=0.10000.79±0.23P=0.72340.74±0.17P=0.19640.88±0.38P=0.8940空白0.79±0.75±0.87±0.91±組0.280.260.250.35注體溫差A(yù)T-發(fā)熱體溫一基礎(chǔ)體溫。各用藥組與空白對(duì)照組比較，t檢驗(yàn)。表2顯示，紫蘇烯(相當(dāng)于成人劑量100倍)對(duì)內(nèi)毒素致大鼠體溫升高無明顯影響(P〉0.05)。3.紫蘇烯對(duì)小鼠在體小腸蠕動(dòng)的影響取昆明種小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為6個(gè)組，每組10只，即生理鹽水組、藿香正氣液組(相當(dāng)于成人劑量35倍)，紫蘇烯14組(相當(dāng)于成人劑量1040倍)。實(shí)驗(yàn)前l(fā)d禁食不禁水，24h后分別灌胃給予各組小鼠含200mL/L墨汁的生理鹽水、藿香正氣液、紫蘇烯混懸液20ml/kg體重，20min后拉頸處死，立即剖取全部小腸，將其自然擺直，不加牽引地平鋪于濕潤(rùn)的玻璃板上，測(cè)量墨汁頭端在腸管內(nèi)移動(dòng)的距離及小腸全長(zhǎng)(從幽門至回盲部)，計(jì)算墨汁推進(jìn)率，結(jié)果見表3。_表3.對(duì)小鼠腸蠕動(dòng)的影1#(±幼，"=10)_H小腸長(zhǎng)度墨汁推進(jìn)距離"~推進(jìn)率(％)_(cm)_(cm)_紫蘇10倍36.79±4.28"~24.36±4.46"""組8.86P=9.2E-5紫蘇烯20倍組37.62±4.6527.55±3.8073.47±9.44P=3.4E-6紫蘇烯30倍組34.34±6.9125.83±4.7675.48±7.29P=3.犯-7紫蘇烯40倍組34.96±5.6526.64±4.3370.44±4.03P二5.9E-7藿香正氣液組38.14±1.1923.79±3.7361.73±9.56P=0.00129生理鹽水組37.40±0.9616.98±3.8845.24±9.81注各用藥組推進(jìn)率與生理鹽水組比較，t檢驗(yàn)。表3顯示，紫蘇烯與藿香正氣液對(duì)小鼠墨汁推進(jìn)率與生理鹽水組比較有顯著性提高(P〈0.05)。四、小結(jié)實(shí)驗(yàn)顯示，紫蘇烯預(yù)防性給藥后對(duì)小鼠耳殼巴豆油致炎有顯著的抑制作用(P〈0.05);紫蘇烯(相當(dāng)于成人劑量1040倍)與藿香正氣液對(duì)小鼠小腸蠕動(dòng)(墨汁推進(jìn)率)有明顯的促進(jìn)作用(P〈0.05);紫蘇烯(相當(dāng)于成人劑量100倍)對(duì)內(nèi)毒素致大鼠體溫升高未見明顯作用(P〉0.05)。試驗(yàn)例3:紫蘇烯抑菌作用初步觀察1.金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、固體LB培養(yǎng)基均為微生物室提供。2.取紫蘇烯粗品，用石油醚(3060°C)稀釋，配成10iil/mL(相當(dāng)于藿香正氣液中紫蘇烯的125倍)溶液。將實(shí)驗(yàn)用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別接種于固體LB培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)基上打孔，孔內(nèi)各加入l滴上述溶液，于37'C培養(yǎng)24h，測(cè)抑菌圈直徑(mm)，與未稀釋的藿香正氣液比較，結(jié)果見表l。表l.紫蘇烯抑菌活性考察(n=3)細(xì)菌抑菌圈直徑(mm)紫蘇烯藿香正氣液金黃色1417葡菌大腸桿1219菌說明書中引用的下列參考文獻(xiàn)，都作為說明書的一部分1.Chp中國(guó)藥典2005版一部.volI:692.伍永富，秦少容，劉世琪，紫蘇葉油研究進(jìn)展，時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥2007.18(8):20193.王婷婷，李清，畢開順等，白芷揮發(fā)油GC指紋圖譜研究，藥物分析雜志2007，27(9):13404.孟青，馮毅凡等，紫蘇揮發(fā)油GC/MS分析，廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)2004.20(6):5905.大多義昭.生藥學(xué)雜志，1984,38(1):127.HondaGishoetal.ChemPharmBull，1986，34(4):1672.1—一_紫蘇醛參照物溶液圖譜；2—_一指標(biāo)峰的指定；3——-參與共有模式建立的IO批樣品色譜圖；4一對(duì)照色譜5-----典型色譜圖及共有特征峰標(biāo)定；6-—對(duì)照紫蘇葉油樣品(Zsy080905)色譜7-----紫蘇烯對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線；8一-一紫蘇醛對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線；9-—-陰性樣品GC色譜10-紫蘇醛、紫蘇烯對(duì)照品溶液GC色譜11-—樣品溶液GC色譜圖。圖3權(quán)利要求1、一種紫蘇葉油的指紋圖譜鑒別方法，其特征在于供試品指紋圖譜與對(duì)照紫蘇葉油指紋圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)模擬相似度計(jì)算軟件計(jì)算，相似度不得小于0.90。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述紫蘇葉油的指紋圖譜鑒別方法，其特征在于(a)色譜條件色譜柱為彈性石英毛細(xì)管柱，固定相為二苯基-二甲基聚硅氧垸、苯基-甲基聚硅氧烷、腈丙苯基-二甲基硅氧垸、腈丙甲基-苯甲基聚硅氧烷或聚乙二醇；程序升溫的初始溫度508(TC，保持815分鐘，以每分鐘5l(TC的速率升溫至100120°C，保持2040分鐘，再以每分鐘103CTC的速率升溫至22027(TC，保持38分鐘；檢測(cè)器250300。C，氣化溫度240270。C;分流比(1050):1;檢測(cè)器為氫火焰檢測(cè)器或質(zhì)荷比范圍為101000質(zhì)譜檢測(cè)器；(b)參照物溶液的制備取紫蘇醛對(duì)照品適量，精密稱定，加入l:l體積比的無水乙醇-正己烷溶液制成每lml含1.00mg的溶液，即得；(c)對(duì)照紫蘇葉油溶液的制備取對(duì)照紫蘇葉油約30mg，精密稱定，置2ml進(jìn)樣瓶中，精密加入l:l體積比的無水乙醇-正己烷溶液lml，搖勻，即得；(d)供試品溶液的制備'取紫蘇葉油約30mg，精密稱取，置2ml進(jìn)樣瓶中，精密加入1:l體積比的無水乙醇-正己垸溶液lml，搖勻，即得。(e)測(cè)定法精密吸取對(duì)照紫蘇葉油溶液、供試品溶液和參照物溶液各1U1，注入氣相色譜儀，測(cè)定。供試品指紋圖譜與對(duì)照紫蘇葉油指紋圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)模擬相似度計(jì)算軟件計(jì)算，相似度不得小于0.90。3、根據(jù)權(quán)利要求2紫蘇葉油的指紋圖譜鑒別方法，其中(a)色譜條件彈性石英毛細(xì)管柱用交聯(lián)5%苯基甲基聚硅氧垸作為固定相；程序升溫初始溫度6(TC，保持10分鐘，以每分鐘8。C的速率升溫至115°C，保持30分鐘，再以每分鐘15"的速率升溫至23(TC，保持5分鐘；檢測(cè)器25(TC，氣化溫度25(TC;分流比30:1;(b)參照物溶液的制備取紫蘇醛對(duì)照品適量，精密稱定，加入l:l體積比的無水乙醇-正己烷溶液制成每lml含1.OOmg的溶液，即得；(c)對(duì)照紫蘇葉油溶液的制備取對(duì)照紫蘇葉油約30mg，精密稱定，置2ml進(jìn)樣瓶中，精密加入l:l體積比的無水乙醇-正己烷溶液lml，搖勻，即得；(d)供試品溶液的制備取紫蘇葉油約30mg，精密稱取，置2ml進(jìn)樣瓶中，精密加入1:l體積比的無水乙醇-正己烷溶液lml，搖勻，即得；(e)測(cè)定法精密吸取對(duì)照紫蘇葉油溶液、供試品溶液和參照物溶液各1iU，注入氣相色譜儀，測(cè)定；供試品指紋圖譜與對(duì)照紫蘇葉油指紋圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)模擬相似度計(jì)算軟件計(jì)算，相似度不得小于0.90。4、一種紫蘇葉油中紫蘇烯和紫蘇醛的測(cè)定方法，其特征在于(a)色譜條件色譜柱為彈性石英毛細(xì)管柱，固定相為二苯基-二甲基聚硅氧烷、苯基-甲基聚硅氧垸、腈丙苯基-二甲基硅氧烷、腈丙甲基-苯甲基聚硅氧烷、聚乙二醇；程序升溫的初始溫度508(TC，保持815分鐘，以每分鐘515。C的速率升溫至100150°C，保持14分鐘，再以每分鐘240。C的速率升溫至22027(TC，保持16分鐘；檢測(cè)器250300°C，氣化溫度240270。C;分流比(1050):1;檢測(cè)器可以為氫火焰檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器(質(zhì)荷比范圍為101000);(b)對(duì)照品溶液的制備取紫蘇醛、紫蘇烯對(duì)照品適量，精密測(cè)定，加1:l體積比的無水乙醇-正己烷溶液制成每lml分別含紫蘇醛1.OOmg、紫蘇烯1.OOmg溶液，即得；(c)被測(cè)定的供試品溶液的制備取被測(cè)定的紫蘇葉油約20mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加1:l體積比的無水乙醇-正己烷溶液至刻度，搖勻，即得；(d)測(cè)定方法分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各ita，注入氣相色譜儀，測(cè)定，即得；被測(cè)品中紫蘇烯不得少于20%;含紫蘇醛不得少于25%。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的紫蘇葉油中紫蘇烯和紫蘇醛的測(cè)定方法，其中(a)色譜條件彈性石英毛細(xì)管柱，交聯(lián)5%苯基甲基聚硅氧垸為固定相；程序升溫初始溫度6(TC，保持10分鐘，以每分鐘8"C的速率升溫至115'C，保持2分鐘，再以每分鐘3(TC的速率升溫至230°C，保持4分鐘；檢測(cè)器250。C，氣化溫度25(TC;分流比15:1;理論板數(shù)以紫蘇醛峰計(jì)算應(yīng)不低于50000;(b)對(duì)照品溶液的制備取紫蘇醛、紫蘇烯對(duì)照品適量，精密測(cè)定，加1:l體積比的無水乙醇-正己烷溶液制成每lml分別含紫蘇醛1.OOmg、紫蘇烯1.OOmg溶液，即得；(c)被測(cè)定的供試品溶液的制備取被測(cè)定的紫蘇葉油約20mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加1:l體積比的無水乙醇-正己烷溶液至刻度，搖勻，即得；(d)測(cè)定方法分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各ita，注入氣相色譜儀，測(cè)定，即得；被測(cè)品中紫蘇烯不得少于20%;含紫蘇醛不得少于25%。全文摘要本發(fā)明公開了紫蘇葉油的指紋圖譜鑒別方法。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)含有紫蘇烯和紫蘇醛的紫蘇葉油在促進(jìn)小腸蠕動(dòng)作用方面顯著優(yōu)于只含紫蘇醛的紫蘇葉油，因此將紫蘇烯和紫蘇醛作為紫蘇葉油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明還公開紫蘇葉油中紫蘇烯和紫蘇醛的測(cè)定方法。文檔編號(hào)A61P31/00GK101669992SQ200910104599公開日2010年3月17日申請(qǐng)日期2009年8月11日優(yōu)先權(quán)日2009年8月11日發(fā)明者余佳文,冉亞東,進(jìn)盧,孫燕玲,柳官,張玉方,濤彭,秦少容申請(qǐng)人:太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司