專(zhuān)利名稱：：一種制備艾塞那肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于制藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種制備艾塞那肽的合成工藝。
背景技術(shù)：
：糖尿病是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂，高血糖主要由胰島素分泌或作用的缺陷引起。糖尿病可分兩種，胰島素依賴型糖尿病(I型糖尿病)和非胰島素依賴型糖尿病(II型糖尿病)，其中II型糖尿病患者占90%以上。WHO統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，目前全球已經(jīng)診斷的II型糖尿病達(dá)到1.3億人，我國(guó)已超過(guò)4000萬(wàn)人，是繼印度之后的第二大糖尿病大國(guó)。常用的II型糖尿病治療藥物包括雙胍類(lèi)、磺脲類(lèi)、ot-葡萄糖甘酶抑制劑、噻唑烷二酮類(lèi)及胰島素等。但研究發(fā)現(xiàn)，這幾類(lèi)常用藥物都有可能造成身體的不良反應(yīng)，特別是二甲雙胍，有導(dǎo)致患者乳酸性酸中毒的危險(xiǎn)性；而胰島素治療也常導(dǎo)致低血糖的發(fā)生。因此，迫切需要研制出新的II型糖尿病治療藥物。1995年，美國(guó)專(zhuān)利US5424286公開(kāi)了一種從南美大毒蜥(Gilkamonster,HelodermaHorridum)的唾液中分離出來(lái)的一種含有39個(gè)氨基酸的多肽，Exendin-4(H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser國(guó)Asp-Leu-Ser畫(huà)Lys國(guó)Gln-Met-Glu-Glu國(guó)Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp誦Leu隱Lys國(guó)Asn-Gly-Gly國(guó)Pro-Ser-Ser-Gly國(guó)Ala國(guó)Pro國(guó)Pro國(guó)Pro-Ser-NH2)。其結(jié)構(gòu)與人的胰高血糖素(Glucagon)有48%的同源性，與人的GLP-1(胰高血糖素樣肽-l)有53%的同源性。研究表明，作為GLP-1的類(lèi)似物，Exendin-4能夠與GLP-1受體作用，通過(guò)4刺激胰島P細(xì)胞再生，促進(jìn)胰島素分泌，抑制胰高血糖素的釋放，減慢胃排空速率，抑制食物攝入。其促胰島素分泌作用是根據(jù)血糖水平進(jìn)行的，故可降低低血糖的發(fā)生率，且對(duì)其他促胰島素分泌劑不敏感的II型糖尿病病人仍有降糖作用，同時(shí)GLP-1還可以減輕II型糖尿病患者的體重，是一類(lèi)全新的糖尿病治療藥物。2005年4月，美國(guó)禮來(lái)公司和Amylin公司共同開(kāi)發(fā)的糖尿病藥物倍它(Byetta，化學(xué)名Exenatide(人工合成的Exendin-4))獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。與此同時(shí)，國(guó)外許多制藥公司如諾和諾德制藥公司、默克制藥公司也在爭(zhēng)相研發(fā)與倍它屬于同類(lèi)型的藥物。另外，國(guó)內(nèi)外也有對(duì)Exendin-4進(jìn)行PEG修飾的(CN101125207)報(bào)道。最近的Exenatide及其類(lèi)似物的制備方法主要有兩種，其中一種是采用生物合成技術(shù)，利用人工基因重組方式得到Exenatide全序列(如CN1635117、CN1693459);另一種為固相合成方法，如美國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)US6卯2744中采用RinkAmideMBHAResin為反應(yīng)載體，HBTU為反應(yīng)激活劑，F(xiàn)moc多肽合成方法合成了Exenatide。但綜合這些文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，固相方法合成Exenatide時(shí)，多采用多肽合成儀直接合成，更多文獻(xiàn)關(guān)注的是Exenatide的生理活性，基本沒(méi)有具體研究Exenatide的規(guī)模化合成方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種高收率、低成本、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的艾塞那肽的固相合成工藝以及由此工藝合成的艾塞那肽的衍生物及其鹽，解決現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案一種制備艾塞那肽的方法，其特征在于，包括如下步驟1)由Fmoc-Ser(tBu)畫(huà)OH和替代度為0.1mmol/g0.8mmol/g的SieberAmide樹(shù)脂為起始原料，得到Fmoc-Ser(tBu)-SieberAmide樹(shù)脂；2)將Fmoc-Ser(tBu)-SieberAmide樹(shù)脂采用逐一偶聯(lián)的方式依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，合成得到側(cè)鏈全保護(hù)艾塞那肽-SieberAmide樹(shù)脂；3)對(duì)側(cè)鏈全保護(hù)艾塞那肽-SieberAmide樹(shù)脂裂解脫保護(hù)基團(tuán)，冰乙醚沉淀，得到的粗肽；粗肽經(jīng)高壓液相純化、凍干得到艾塞那肽。優(yōu)選的方案是所述的Fmoc-Ser(tBu)-SieberAmide樹(shù)脂，是Fmoc-Ser(tBu)-OH與SieberAmide樹(shù)脂在HATU和HOAt的作用下生成。更為優(yōu)選的方案是所述的Fmoc-Ser(tBu)-SieberAmide樹(shù)脂替代度為0.2mmol/g0.4mmol/g。更為優(yōu)選的方案是所述的具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸采用Fmoc基團(tuán)保護(hù)，各種氨基酸分別以Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc畫(huà)Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc畫(huà)Ile國(guó)OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc誦Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)隱OH、Fmoc-HisCTrt)-OH的形式應(yīng)用。更為優(yōu)選的方案是所述的Fmoc保護(hù)基通過(guò)哌啶處理來(lái)除去。更為優(yōu)選的方案是所述的逐一偶聯(lián)采用的激活劑包括偶聯(lián)劑和有機(jī)堿，偶聯(lián)劑為DIC+A或B+A，其中A為HOBt或者HOAt;B為HBTU或者HATU或者TBTU或者PyBOP;有機(jī)堿為T(mén)MP或者為DIPEA。更為優(yōu)選的方案是所述的逐一偶聯(lián)釆用的偶聯(lián)劑為T(mén)BTU/HOBt，有機(jī)堿為DIPEA。更為優(yōu)選的方案是所述保護(hù)氨基酸偶聯(lián)與脫保護(hù)過(guò)程中每一步都經(jīng)過(guò)KaiserTest檢觀"6更為優(yōu)選的方案是所述側(cè)鏈全保護(hù)艾塞那肽-SieberAmide樹(shù)脂裂解脫保護(hù)基團(tuán)從固相載體上的裂解裂解劑是三氟乙酸、苯甲硫醚、1,2-乙二硫醇、苯甲醚的混合液[三氟乙酸:苯甲硫醚:1,2-乙二硫醇苯甲醚(90:5:3:2v/v)]。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果本發(fā)明制備艾塞那肽的工藝方法采用替代度在特定范圍內(nèi)的SieberAmide樹(shù)脂，采用方便的固相合成方法合成艾塞那肽，具有規(guī)?；a(chǎn)能力，工藝穩(wěn)定、反應(yīng)操作簡(jiǎn)單、后處理容易、原料投入少、成本低、收率高等特點(diǎn)，具有可觀的經(jīng)濟(jì)實(shí)用價(jià)值，同時(shí)在多肽藥物設(shè)計(jì)合成領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。圖1是本發(fā)明制備艾塞那肽的方法總的工藝流程圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所使用的縮寫(xiě)的含義列如表1所示表1縮略詞表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>Pbf2,2,4,6，7-五甲基-2H-苯并呋喃-5-磺?；鵷Bu叔丁基DMFN，N-二甲基甲酰胺DCM二氯甲垸DBLK六氫吡啶/DMF溶液SiberAmideResin9-氨基-咕噸-3-氧-Merrifield樹(shù)脂Exenatide艾塞那肽實(shí)施例1Fmoc-Ser(tBu)-SieberAmideResin的制備將替代度為O.lmmol/g的Fmoc-SieberAmideResin25g，按照上述操作得到的Fmoc-Ser(tBu)-SieberAmideResin，檢測(cè)替代度為0.021mmol/g;將替代度為0.8mmol/g的Fmoc-SieberAmideResin25g，按照上述操作得到的Fmoc-Ser(tBu)-SieberAmideResin，檢測(cè)替代度為0.529mmol/g。本實(shí)施例更為優(yōu)選的方案是將Fmoc-SieberAmideResin25g，替代度為0.535mmol/g，加入到固相反應(yīng)器中，加入DCM溶脹樹(shù)脂30分鐘后，用20%DBLK脫Fmoc保護(hù)，得到H-SieberAmideResin，DMF洗滌4次，DCM洗滌2次。將4.22gFmoc-Ser(tBu)陽(yáng)OH，4.14gHATU，1.80gHOAt，2.4mlTMP在冰浴情況下溶于DMF中，加入上述樹(shù)脂中反應(yīng)45分鐘。反應(yīng)結(jié)束后用DMF、甲醇交替洗滌3次得到Fmoc-Ser(tBu)-SieberAmideResin，檢測(cè)替代度為0.298mmol/g。實(shí)施例2Fmoc-Ser(tBu)-SieberAmideResin的規(guī)模制備將Fmoc-SieberAmideResin2500g，替代度為0.535mmol/g，加入到固相反應(yīng)中，加入DCM溶脹樹(shù)脂30分鐘后，用20%DBLK脫Fmoc保護(hù)，得到H-SieberAmideResin,DMF洗滌8次，DCM洗滌4次。將4220gFmoc誦Ser(tBu)誦OH，4140gHATU，1800gHOAt，2.4LTMP在冰浴情況下溶于DMF中，加入上述樹(shù)脂中反應(yīng)55分鐘。反應(yīng)結(jié)束后用DMF、甲醇交替洗滌3次得到Fmoc-Ser(tBu)-SieberAmideResin，檢測(cè)替代度為0.315mmol/g。實(shí)施例3側(cè)鏈全保護(hù)Exenatide-SieberAmideResin的制備稱取3.2g(lmmol)Fmoc-Ser(tBu)誦SieberAmideResin加入反應(yīng)器中，用20%DBLK脫Fmoc保護(hù)，將1.012gFmoc-Pro國(guó)OH,0.49gHOBt，0.61mlDIC溶于DCM中，加入固相反應(yīng)器中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮檢測(cè)呈陰性為準(zhǔn)。重復(fù)以上步驟，依次完成37位到1位的保護(hù)氨基酸的連接，得到側(cè)鏈全保護(hù)Exenatide-SieberAmideResin。實(shí)施例4側(cè)鏈全保護(hù)Exenatide-SieberAmideResin的規(guī)模制備稱取3200g(lmol)Fmoc-Ser(tBu)-SieberAmideResin加入反應(yīng)器中，用20%DBLK脫Fmoc保護(hù)，將1012gFmoc-Pro-OH，490gHOBt，610mlDIC溶于DCM中，加入固相反應(yīng)器中，室溫反應(yīng)2-3小時(shí)，反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮檢測(cè)呈陰性為準(zhǔn)。重復(fù)以上步驟，依次完成37位到1位的保護(hù)氨基酸的連接，得到側(cè)鏈全保護(hù)Exenatide-SieberAmideResin。實(shí)施例5Exenatide粗肽的制備及純化1).將17.76g側(cè)鏈全保護(hù)Exenatide-SieberAmideResin加入到100ml圓底燒瓶中；2).配制新鮮裂解試劑80ml，其中三氟乙酸50ml，苯甲硫醚2ml，1，2-乙二硫醇2ml，苯甲醚6ml，二氯甲烷20ml，放入冰箱中預(yù)冷30min;3)將裂解試劑倒入樹(shù)脂中，冰浴下攪拌。反應(yīng)30分鐘后撤走冰浴，室溫下繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)。過(guò)濾樹(shù)脂，收集濾液。用少量TFA洗滌樹(shù)脂，合并濾液。將濾液i愛(ài)慢加入800ml冰乙醚中，出現(xiàn)白色沉淀。3000轉(zhuǎn)/分鐘離心，冰乙醚洗漆5次后，減壓干燥得到粗肽5.2g。粗肽收率79.5%。經(jīng)過(guò)高效液相純化得到艾塞那肽精肽l.lg，收率21.2%。實(shí)施例6Exenatide粗肽的規(guī)模制備及純化91).將1500g側(cè)鏈全保護(hù)Exenatide-SieberAmideResin加入到2000ml圓底燒瓶中；2).配制新鮮裂解試劑1000ml，其中三氟乙酸625ml，苯甲硫醚25ml，1，2-乙二硫醇25ml，苯甲醚75ml，二氯甲烷250ml，放入冰箱中預(yù)冷30min;3).將裂解試劑倒入樹(shù)脂中，冰浴下攪拌。反應(yīng)30分鐘后撤走冰浴，室溫下繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)。過(guò)濾樹(shù)脂，收集濾液。用少量TFA洗滌樹(shù)脂，合并濾液。將濾液緩慢加入15L冰乙醚中，出現(xiàn)白色沉淀。3000轉(zhuǎn)/分鐘離心，冰乙醚洗滌5次后，減壓干燥得到粗肽458g。粗肽收率80.6%。經(jīng)過(guò)高效液相純化得到艾塞那肽精肽94.2g，收率23.8%。實(shí)施例7艾塞那肽的衍生物及其鹽陰離子交換法得到艾塞那肽的衍生物及其鹽。純化條件色譜柱填料為陰離子交換樹(shù)脂AmberiiteIRA-93，柱子直徑和長(zhǎng)度為5cmX25cm。流動(dòng)相1-2%醋酸水溶液。流速50-60ml/min。檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。進(jìn)樣量為1.5-2.0g。轉(zhuǎn)鹽過(guò)程:將色譜柱用去離子水平衡后上樣，上樣量為30-40ml樣品溶液(純度大于99.0%的艾塞那肽三氟乙酸溶液)。1-2%醋酸水溶液洗脫50min，收集目的峰，將收集的目的肽溶液合并旋蒸濃縮至約100-150mg/mL后轉(zhuǎn)至合適大小容器，后進(jìn)行冷凍干燥，即可得到純度大于98.5%的符合要求的醋酸艾塞那肽。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。10權(quán)利要求1.一種制備艾塞那肽的方法，其特征在于，包括如下步驟1)由Fmoc-Ser(tBu)-OH和替代度為0.1mmol/g～0.8mmol/g的SieberAmide樹(shù)脂為起始原料，得到Fmoc-Ser(tBu)-SieberAmide樹(shù)脂；2)將Fmoc-Ser(tBu)-SieberAmide樹(shù)脂采用逐一偶聯(lián)的方式依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，合成得到側(cè)鏈全保護(hù)艾塞那肽-SieberAmide樹(shù)脂；3)對(duì)側(cè)鏈全保護(hù)艾塞那肽-SieberAmide樹(shù)脂裂解脫保護(hù)基團(tuán)，冰乙醚沉淀，得到的粗肽；粗肽經(jīng)高壓液相純化、凍干得到艾塞那肽。2.如權(quán)利要求1所述制備艾塞那肽的方法，其特征在于所述的Fmoc-Ser(tBu)-SieberAmide樹(shù)脂是Fmoc-Ser(tBu)-OH與SieberAmide樹(shù)脂在HATU和HOAt的作用下生成。3.如權(quán)利要求1所述制備艾塞那肽的方法，其特征在于所述的Fmoc-Ser(tBu)-SieberAmide樹(shù)脂替代度為0.2mmol/g0.4mmol/g。4.如權(quán)利要求1所述制備艾塞那肽的方法，其特征在于所述的具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸采用Fmoc基團(tuán)保護(hù)，各種氨基酸分別以Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro誦OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-。H、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc誦Met-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH的形式應(yīng)用。5.如權(quán)利要求4所述制備艾塞那肽的方法，其特征在于所述的Fmoc保護(hù)基通過(guò)哌啶處理來(lái)除去。6.如權(quán)利要求1所述制備艾塞那肽的方法，其特征在于所述的逐一偶聯(lián)采用的激活劑包括偶聯(lián)劑和有機(jī)堿，偶聯(lián)劑為DIC+A或B+A，其中A為HOBt或者HOAt;B為HBTU或者HATU或者TBTU或者PyBOP;有機(jī)堿為T(mén)MP或者為DIPEA。7.如權(quán)利要求6所述制備艾塞那肽的方法，其特征在于所述的逐一偶聯(lián)采用的偶聯(lián)劑為T(mén)BTU/HOBt，有機(jī)堿為DIPEA。8.如權(quán)利要求1所述制備艾塞那肽的方法，其特征在于所述保護(hù)氨基酸偶聯(lián)與脫保護(hù)過(guò)程中每一步都經(jīng)過(guò)KaiserTest檢測(cè)。9.如權(quán)利要求1所述制備艾塞那肽的方法，其特征在于所述側(cè)鏈全保護(hù)艾塞那肽-SieberAmide樹(shù)脂裂解脫保護(hù)基團(tuán)從固相載體上的裂解裂解劑是三氟乙酸、苯甲硫醚、1，2-乙二硫醇、苯甲醚的混合液。10.—種艾塞那肽的衍生物及其鹽，其特征在于由權(quán)利要求1至9任一所述制備艾塞那肽的方法獲得。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種制備艾塞那肽的方法，包括如下步驟1)由Fmoc-Ser(tBu)-OH和替代度為0.1mmol/g～0.8mmol/g的SieberAmide樹(shù)脂為起始原料，得到Fmoc-Ser(tBu)-SieberAmide樹(shù)脂；2)采用逐一偶聯(lián)的方式依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，合成得到側(cè)鏈全保護(hù)艾塞那肽-SieberAmide樹(shù)脂；3)對(duì)樹(shù)脂裂解脫保護(hù)基團(tuán)，冰乙醚沉淀，得到粗肽；粗肽經(jīng)高壓液相純化、凍干得到艾塞那肽。本發(fā)明采用的制備艾塞那肽的工藝方法具有反應(yīng)操作簡(jiǎn)單、后處理容易、收率高、成本低等特點(diǎn)，具有可觀的經(jīng)濟(jì)實(shí)用價(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)A61P3/00GK101538324SQ200910104990公開(kāi)日2009年9月23日申請(qǐng)日期2009年1月13日優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日發(fā)明者宓鵬程,李紅玲,袁建成,覃亮政,馬亞平申請(qǐng)人:深圳市翰宇藥業(yè)有限公司