專(zhuān)利名稱：：夾竹桃多糖提取物的制備方法及多糖提取物的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種夾竹桃多糖(NP)提取物的制備方法及其醫(yī)藥用途，具體地說(shuō)，涉及一種夾竹桃多糖(NP)提取物的制備方法以及該多糖提取物在制備抗腫瘤藥物方面的用途。
背景技術(shù)：
：夾竹桃(Aferi娜i;K/;腿Mill.)屬于夾竹桃科夾竹桃屬植物，是我國(guó)常見(jiàn)的一種觀賞植物。葉及莖皮含大量強(qiáng)心甾，入藥煎湯或研末，能強(qiáng)心利尿，定喘鎮(zhèn)，試用于心力衰竭，喘息咳嗽，'癲癇，跌打損傷腫痛等。也用于制備殺釘螺的農(nóng)藥。目前關(guān)于夾竹桃屬植物的抗腫瘤作用有美國(guó)專(zhuān)利5135745"extractsofAferi咖species,methodsofpreparation,andusetherefore",描述了一種夾竹杉fe科植物歐洲夾竹杉fe(Neriumoleander)提取物的抗腫瘤效果及其制備方法，通過(guò)將植物材料煮沸幾小時(shí)得到的提取物對(duì)細(xì)胞增殖性疾病有緩解作用，也有報(bào)道歐洲夾竹桃中的強(qiáng)心甾可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。也有報(bào)道歐洲夾竹桃(Neriumoleander)提取物可誘導(dǎo)Y-IFN的產(chǎn)生，從而起到抗病毒的效果(中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?00410058927.7)。而國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)夾竹桃(GVer^/ffli/^icwBMill.)提取物抗腫瘤的研究報(bào)道。植物多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能，具有抗病毒、抗菌、抗寄生蟲(chóng)、抗腫瘤、抗輻射、抗衰老等多方面的生物活性，因而越來(lái)越受到研究者的重視。近年來(lái)，大量的研究表明，中藥多糖具有抗腫瘤作用，且毒副作用小，因而已成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。香菇多糖、當(dāng)歸多糖、豬苓多糖、云芝多糖等一批質(zhì)量穩(wěn)定、療效確切、毒性和不良反應(yīng)小的多糖類(lèi)藥物己作為抗腫瘤藥物廣泛用于臨床。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種夾竹桃((Aferi^h&'cMill.)多糖(NP)提取物的制備方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該夾竹桃多糖(NP)提取物在制備治療人和動(dòng)物腫瘤性疾病的藥品中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及該夾竹桃多糖(NP)提取物作為制備治療動(dòng)物和人的腫瘤的藥物組合物中的應(yīng)用，包括該提取物與其它藥物、藥物載體或賦形劑的組合用于制備治療動(dòng)物和人腫瘤性疾病的藥物。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所說(shuō)的夾竹桃多糖(NP)提取物的提取方法采用以下技術(shù)方案(1)采集夾竹桃鮮葉，水洗干凈，晾干水分，5065"C烘干，粉碎后過(guò)60目篩制成夾竹桃葉粉末。(2)用70%乙醇在60'C下回流3次，每次3h，去除夾竹桃葉粉末色素和油脂，過(guò)濾取濾渣，揮干溶劑。(3)取揮干溶劑后的濾渣，按濾渣水為1:610的體積比例于609『C熱水中抽提，每次4h,重復(fù)抽提3次后，離心或抽濾去渣，取上清液；熱水中抽提優(yōu)選溫度是95t:。(4)采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮由步驟(3)得到的上清液至原體積的1/21/4，得到濃縮液；濃縮液加IO%三氯乙酸至口}1=4.0，4。C冰箱放置24h后以8000r/min離心15min,棄沉淀，再取上清液用0.5mol/L的NaOH液調(diào)溶液的pH值至中性，采用sevage法、TCA法、酶法中的一種或者這幾種方法聯(lián)用去除濃縮液中的蛋白，再取上清液。(5)將去除蛋白的上清液裝入透析袋透析3d，其中先流水透析2d，后蒸餾水透析ld，進(jìn)一步去除溶液中的小分子成分得到夾竹桃多糖凈提取物。(6)在得到的夾竹桃多糖凈提取物中加入3倍體積的95%乙醇，在4'C下，靜置ld后，以8000r/min離心15min，收集沉淀物，該沉淀物依次用無(wú)水乙醇、丙酮和乙醚洗滌三次后，冷凍干燥即得本發(fā)明所說(shuō)的夾竹桃粗多糖(NP)提取物粉劑。(7)將夾竹桃粗多糖(NP)提取物粉劑，以100mg加入1ral蒸餾水制成針劑；按照腹腔傳代7d生長(zhǎng)良好的S180荷瘤小鼠的體重(kg)分三級(jí)劑量給藥，第一級(jí)50mg/kg,第二級(jí)100mg/kg，第三級(jí)150mg/kg組，每組10只S180荷瘤小鼠，每天腹腔注射給藥，連續(xù)給藥10d后，次日稱重；頸椎脫臼處死小鼠，剝離每只鼠腫塊，用濾紙吸干腫瘤表面血污后稱重，計(jì)算抑瘤率。三級(jí)劑量給藥的抑瘤率分別為第一組40.00%，第二組50.83%第三組44.17%，表明NP對(duì)S180肉瘤有顯著的抑制作用，其中NP100mg/kg組的抑瘤效果最好，抑瘤率可達(dá)50.83%，說(shuō)明夾竹桃多糖(NP)提取物在制備治療人和動(dòng)物腫瘤性疾病的藥品中可以應(yīng)用。同時(shí)夾竹桃多糖(NP)提取物可作為制備治療動(dòng)物和人的腫瘤的藥物組合物中的應(yīng)用，包括該提取物與其它藥物、藥物載體或賦形劑的組合用于制備治療動(dòng)物和人腫瘤性疾病的藥物。本發(fā)明采用適用于夾竹桃((船n'咖//kZ/omMill.)葉中多糖提取物的提取分離方法，對(duì)夾竹桃((Aferii/邁i'/7t/Zc咖Mill.)葉進(jìn)行提取分離后得到夾竹桃((Afe"'wffli/7t/ic"/zMi11.)多糖提取物，研究表明以該方法獲得的提取物對(duì)小鼠肉瘤S180有較好的抑制效果，并與臨床重要抗腫瘤化療藥物有顯著的協(xié)同效果；該提取物也可顯著延長(zhǎng)S180腹水癉小鼠的壽命。該提取物的抗腫瘤作用可能與其增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能相關(guān)。從該提取物中分離純化得到的兩種單一成分的多糖可以直接抑制人源腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)凋亡，說(shuō)明該提取物也對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接的殺傷作用。圖1是本發(fā)明所述的夾竹桃多糖NP3SephadexG-100凝膠柱層析圖。圖2夾竹桃多糖NP4SephadexG-100凝膠柱層析圖3是本發(fā)明所述的夾竹桃多糖(NP)提取物的NP3和NP4的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；圖4是本發(fā)明所述的夾竹桃多糖(NP)提取物不同濃度NP4處理K562細(xì)胞96hDNA片段化檢測(cè)結(jié)果(M:Maker;A:陰性對(duì)照組；B:80嗎/mL;C:160pg/mL;D:320pg/mL)。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但并不因此而限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l:采集夾竹桃葉洗凈60。C烘干后，粉碎過(guò)60目篩，稱取200g，用70%乙醇在60。C下回流去色素、脫脂3次，每次3h，殘?jiān)?0'C烘干；稱取烘干后的藥材，按照質(zhì)液比藥材水=1:10在95'C水浴中熱水抽提，每次4h，重復(fù)抽提3次，抽濾去殘?jiān)蟮蒙锨逡海徊捎眯D(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮上清液至原體積的1/2,得到濃縮液；濃縮液先用三氯乙酸法去蛋白(多糖濃縮液加10%三氯乙酸至pH=4.0，4。C冰箱放置24h后以8000r/min離心15min，棄沉淀)，再取上清液用0.5mol/L的NaOH液調(diào)溶液的pH值至中性，再加入1/3體積的sevage(氯仿正丁醇=4:1)，振蕩20min后，8000rpm離心15min，去沉淀，重復(fù)1次，去掉殘余蛋白。上清液裝入透析袋(分子量7000-14000D),流動(dòng)水透析2d,蒸餾水透析1d，透析液濃縮至1/2體積后按體積比95%乙醇多糖液=3:1進(jìn)行醇沉多糖，靜置24h(4'C)，以8000r/min離心15min，取沉淀用無(wú)水乙醇洗滌數(shù)遍，冷凍干燥得夾竹桃粗多糖(NP)7',9g。實(shí)施例2:按實(shí)施例1所述方法提取的夾竹桃多糖提取物(NP)腹腔注射對(duì)小鼠肉瘤S180的抑制作用。取腹腔傳代7d生長(zhǎng)良好的S180荷瘤小鼠，頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下抽取腹水；用滅菌的生理鹽水稀釋?zhuān)靹蛑瞥赡[瘤細(xì)胞混懸液(1.0X107/mL);按0.2niL/只，接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下。將接種24h后小鼠隨機(jī)分為5組生理鹽水陰性對(duì)照組、環(huán)磷酰胺(CTX)陽(yáng)性對(duì)照組(20mg/kg)、NP的50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg組，每組10只，每天腹腔注射給藥，連續(xù)給藥IOd后，次日稱重，頸椎脫臼處死小鼠，剝離每只鼠腫塊，用濾紙吸千腫瘤表面血污后稱重，計(jì)算抑瘤率。結(jié)果見(jiàn)表l.抑瘤率(％)-(l—實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)X100%表lNP對(duì)小鼠S180肉瘤生長(zhǎng)的抑制作用(義is,n=10)組別劑量(mg/kg.d)開(kāi)始體重(g)結(jié)束體重(g)瘤重(g)抑瘤率(%)陰性對(duì)照組—22.05±1.0232.60±1.421.20±0.08—多糖組5021.30±0.8231.20±2.020.67±0.08*44.17多糖組10021.24±0.3631.76±1.120.59±().11"50.83多糖組15021.05±0.2931.82±2.230.72±0.09*40.00CTX組2021.56±0.8528.93±1.770,67±0.11*44.17與陰性^f照組比較'戶<0.01;與CTX組對(duì)照組比較'戶<0.05NP各組給藥后的荷瘤小鼠毛發(fā)有光澤，活動(dòng)和進(jìn)食正常；陰性對(duì)照組荷瘤小鼠毛發(fā)干枯、蓬松，微微發(fā)黃，行動(dòng)遲緩；CTX組荷瘤小鼠毛發(fā)顏色和活動(dòng)情況不如NP組但比陰性對(duì)照組要好，體重明顯減輕，進(jìn)食量有所減少。陰性對(duì)照組瘤塊大、界限不清、質(zhì)地較軟、難以剝離，有的甚至浸潤(rùn)至胸骨、鎖骨及腋窩后側(cè)等處；NP各組和CTX組瘤體較小、界限清晰、質(zhì)地較硬、容易剝離。由表1可見(jiàn)NP50、100、150mg/kg組的瘤重與生理鹽水陰性對(duì)照組相比較，均有非常顯著性差異(代O.01)，其中100mg/kgNP組與CTX組比較有顯著性差異(代0.05)。NP50、100、150mg/kg組的抑瘤率分別為40.00%、50.83%、44.17%，表明NP對(duì)S180肉瘤有顯著的抑制作用，其中NP100mg/kg組的抑瘤效果最好，抑瘤率可達(dá)50.83%，NP對(duì)S180肉瘤的抑制似乎不呈劑量依賴關(guān)系。實(shí)施例3:按實(shí)施例l所述方法提取的夾竹桃多糖提取物(NP)尾靜脈注射對(duì)S180腹水瘤小鼠生命延長(zhǎng)率的影響。腹腔接種S180腫瘤細(xì)胞，每只小鼠注射S180腫瘤細(xì)胞1.0X10MN將接種24h后的小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，24h后處理組注射N(xiāo)P，分別為50tng/kg、100mg/kg、150mg/kg組，陰性對(duì)照組注射等量生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組注射20mg/kg的CTX，連續(xù)給藥10cU尾靜脈給藥。以給藥當(dāng)天為第l天記錄小鼠生存時(shí)間，計(jì)算荷瘤小鼠生命延長(zhǎng)率。結(jié)果見(jiàn)表2.生命延長(zhǎng)率(％)=(給藥組平均的生存時(shí)間/對(duì)照組平均的生存時(shí)間一l)X100%表2NP對(duì)腹水瘤小鼠生命延長(zhǎng)率的影響Cfis,n=10)組別劑量(mg/kg.d)生存時(shí)間(d)生命延長(zhǎng)率(°/。)陰性對(duì)照組——9.8±1.2——多糖組5014.0±1.5*42.86多糖組10016.1±1.9*64.29多糖組15014.1±1.5*43.88CTX組2014.4±1.7*46.94與陰性對(duì)照組比較'戶<0.01實(shí)施例4:剝?nèi)?shí)施例2中各組荷瘤鼠的瘤組織后，迅速在IO%中性甲醛溶液固定后，24h內(nèi)進(jìn)行常規(guī)脫水、透蠟、包埋，所得蠟塊連續(xù)切片，采用免疫組化法檢測(cè)瘤組織PCNA、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。(1)染色過(guò)程主要如下石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟和水化后，PBS(pFN7.4)沖洗3minx3次，根據(jù)每一種抗體的要求，對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)(Bcl-2和Bax采用微波抗原修復(fù)，PCNA采用高壓抗原修復(fù))，取出于室溫下冷卻，蒸餾水沖洗3minx2次，PBS洗2minx2次，每張切片滴加50叱過(guò)氧化酶阻斷溶液(試劑A)，室溫下孵育10min，PBS洗3minx3次，除去PBS液，加50PL正常非免疫動(dòng)物血清(試劑B)，室溫下孵育10min，除去血清滴加第一抗體，室溫下孵育60min，PBS洗5minx3次，除去PBS液，滴加50WL生物素標(biāo)記的第二抗體(試劑C)，室溫下孵育10min，PBS洗3minx3次，除去PBS液，滴加50(C生物素-過(guò)氧化物酶溶液(試劑D)，室溫下孵育IOmm，PBS洗3minx3次，除去PBS液，加新鮮配置DAB溶液，顯微鏡下觀察3-10min,自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1%HC1分化，PBS沖冼返藍(lán)，經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，鏡檢。(2)結(jié)果判斷PCNA陽(yáng)性染色位于細(xì)胞核，Bcl-2陽(yáng)性染色位于細(xì)胞漿，Bax陽(yáng)性染色位于細(xì)胞漿。陽(yáng)性細(xì)胞染色為棕黃色或棕褐色。每個(gè)標(biāo)本低倍鏡(xlOO)下觀察，隨機(jī)選擇5個(gè)視野；高倍鏡(x400)下每個(gè)視野選取200個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以百分?jǐn)?shù)表示，計(jì)算肉瘤組織中表達(dá)PCNA、Bcl-2和Bax的細(xì)胞陽(yáng)性率。由表3可看出NP50、100、150mg/kg組與陰性對(duì)照組相比，給藥后肉瘤組織中PCNA細(xì)胞的陽(yáng)性率明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異非常顯著(代O.Ol):Bcl-2細(xì)胞的陽(yáng)性率明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異非常顯著(代O.Ol);Bax細(xì)胞的陽(yáng)性率明顯升高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異非常顯著(代O.Ol)，其中100rag/kgNP組與CTX組比較差異非常顯著(代O.Ol)。說(shuō)明了NP能顯著抑制S180肉瘤細(xì)胞PCNA、Bcl-2蛋白的表達(dá)并且同時(shí)促進(jìn)了Bax蛋白的表達(dá)。表3各實(shí)驗(yàn)組PCNA、Bel-2、Bax蛋白的表達(dá)結(jié)果(i^^，n=10)組別'劑量(mg/kg.d)PCNA細(xì)胞陽(yáng)性率(%)Bcl-2細(xì)胞陽(yáng)性率(%)Bax細(xì)胞陽(yáng)性率(%)陰性對(duì)照組—60.00±4.0263.90±4.0822.85±3.64多糖組5036.00±2.42*36.30±3.55*36.44±4.15*多糖組10031.20±4.04*31.50士1.41'57.76±4.11"多糖組15036.30±2.56*35.80±2,59*36,73士3.79*CTX組2032.00±3.26'37.60±2,30*35.40±2.46*與陰性對(duì)照組比較""P〈0.01;與CTX組對(duì)照組比較^<0.01實(shí)施例5:夾竹桃多糖(NP)與環(huán)磷酰胺(CTX)聯(lián)用對(duì)S180皮下移植肉瘤的抑制作用按實(shí)施例1所述方法提取的夾竹桃多糖提取物(NP)，接瘤方法與實(shí)施例2相同，將接種24h后的小鼠隨機(jī)分為6組生理鹽水陰性對(duì)照組、CTX單用治療組給予CTX10mg/kg、CTX單用治療組2給予CTX20mg/kg、NP單用組給予NP100mg/kg、NP聯(lián)合CTX治療組1給予NP100mg/kg+CTX10mg/kg、NP聯(lián)合CTX治療組2給予NP100mg/kg+CTX20mg/kg，每組10只，NP腹腔注射給藥，CTX尾靜脈給藥，每只小鼠每天給藥，連續(xù)給藥10d。末次給藥后24h頸椎脫臼處死荷瘤小鼠，剝?nèi)×鰤K并用吸水紙吸凈瘤塊表面血污后稱重。比較單純用CTX治療組與加用NP聯(lián)合治療組間抑瘤率的差異，觀察NP與CTX聯(lián)用對(duì)S180皮下移植性肉瘤的抑制作用效果。NP與CTX聯(lián)用的藥物聯(lián)合作用評(píng)價(jià)，通過(guò)以藥物相互作用指數(shù)(CDI)為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)NP與環(huán)磷酰胺(CTX)聯(lián)合應(yīng)用治療S180小鼠肉瘤的效果進(jìn)行藥物聯(lián)合作用評(píng)價(jià)。抑瘤率(％)=(對(duì)照組平均瘤重一實(shí)驗(yàn)組平均瘤重)g/對(duì)照組平均瘤重gX100%藥物相互作用指數(shù)(CDI)的計(jì)算公式為CDI=AB/(AXB)在本實(shí)驗(yàn)中，AB為兩聯(lián)用組與生理鹽水對(duì)照組瘤重的比值，A或B是各藥單獨(dú)用藥組與生理鹽水對(duì)照組瘤重的比值。當(dāng)CDK1時(shí)，表示兩藥聯(lián)用具有協(xié)同作用；當(dāng)CDK0.7時(shí)，表示兩藥聯(lián)用的協(xié)同作用非常顯著。由表4所示各用藥組的瘤重與陰性對(duì)照組比較差異均非常顯著(7><0.01^,抑瘤效果明顯，抑瘤率均>30%。其中CTX10mg/kg組抑瘤率為31.85%，抑瘤效果明顯，與NP100mg/kg組聯(lián)用抑瘤率達(dá)到62.22%，CDI=0.95，表示此兩種劑量藥物聯(lián)用具有協(xié)同作用。CTX20mg/kg組抑瘤率為40.00%，與NP100mg/kg組聯(lián)用抑瘤率達(dá)63.70%，可增強(qiáng)CTX20mg/kg組的抑瘤作用，CD卜l.lO1.0表示此兩種劑量藥物聯(lián)用不具有協(xié)同作用。表明NP100mg/kg與CTX10mg/kg組聯(lián)用具有協(xié)同作用。表4NP與CTX聯(lián)用對(duì)S180裸鼠皮下移植瘤的協(xié)同抑制效果(；土s,n=l0)組別劑量(mg/kg.d)瘤重(g)抑瘤率(％)CDI陰性對(duì)照組一1.35±0.26——CTX組1100.97±0.11*31.85一CTX組2200.81±0.06*40.00—一多糖組1000.74±0.08*45.19—CTX組1+多糖組10+1000.51±0.67*62.220.95CTX組2+多糖組20+1000.49±0.07*63.701.10與陰性對(duì)照組比較'尸<0.01實(shí)施例6:夾竹桃多糖(NP)對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞碳廓清能力和免疫器官指數(shù)的影響將正常實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，分別為生理鹽水陰性對(duì)照組，NP50、100、150mg/kg組，連續(xù)8d腹腔注射按實(shí)施例l所述方法提取的夾竹桃多糖提取物(NP)，末次給藥24h后，稱其體重，按每IOg體重O.1mL的劑量尾靜脈注射給予小鼠墨汁(無(wú)菌生理鹽水稀釋5倍的印度墨水)，立即計(jì)時(shí)，于注入墨汁后2min、10min分別從眼眶靜脈叢取血30叱，并立即將其加入到3mL濃度為0.1X的Na2C03溶液中，以O(shè).1%的化2<:03溶液作空白對(duì)照，用分光光度計(jì)在600nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值(A)。然后頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟、胸腺和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱重。按下式計(jì)算吞噬指數(shù)a、碳廓清指數(shù)K、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)。吞噬指數(shù)a=體重/(肝重+脾重)XK1'3碳廓清指數(shù)K:(LgA,—LgA2)/(ts—tj脾臟指數(shù)(％)=脾臟重量mg/動(dòng)物體重gX100%胸腺指數(shù)(％)=胸腺重量mg/動(dòng)物體重gX100%公式中a:吞噬指數(shù)，反映每單位組織重量的吞噬活性；K:廓清指數(shù)，表示吞噬速率；A1:t對(duì)的吸光度值；A2:t2時(shí)的吸光度值；t1:給墨汁后第l次取血的時(shí)間；t2:給墨汁后第2次取血的時(shí)間。由表可看出NP100、150mg/kg組的碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)與陰性對(duì)照組比較差異非常顯著(尸<0.01)，50mg/kg組的吞噬指數(shù)與陰性對(duì)照組比較差異顯著(代0,05)，表明NP能顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，顯著提高碳廓清率。其中NP100mg/kg劑量組的碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)最為突出，可見(jiàn)NP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力不呈劑量依賴關(guān)系。由表5可看出NP50、100、150mg/kg組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與陰性對(duì)照組比較差異顯著或非常顯著(尸〈0.05或尸<0.01)，表明NP能顯著增加小鼠的臟器指數(shù)。其中NP100mg/kg劑量組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)最為突出。表5NP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞碳廓清能力的影響(xi:s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與陰性對(duì)照組比較》<0.05，"P<0.01實(shí)施例7:'夾竹桃多糖(NP)對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響l.雞紅細(xì)胞懸液制備用配好的肝素潤(rùn)濕注射器針管，然后抽取活雞血，立即置人盛有5倍于取血量的1%肝素抗凝劑的三角燒瓶中，混勻，4'C冰箱內(nèi)保存。使用前，以無(wú)菌生理鹽水離心洗滌3次，前l(fā)次離心速度為150Orpm，離心5min，棄上清液和界面粒細(xì)胞層，最后連續(xù)離心2次(2000rpm5min)，根據(jù)壓積用生理鹽水配成5%雞紅細(xì)胞懸液備用。2.小鼠分組及給藥將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，分別為生理鹽水陰性對(duì)照組，NP50、100、150mg/kg組,連續(xù)8d腹腔注射按實(shí)施例l所述方法提取的夾竹桃多糖提取物(NP)，于停藥后第2天每只小鼠腹腔注射6%的淀粉肉湯(0.3g牛肉膏、1.0g蛋白胨、0.5g氯化鈉、6.0g可溶性淀粉溶在IOOmL蒸餾水中，煮沸滅菌，置4r冰箱中保存?zhèn)溆?，每只鼠lmL，48h后腹腔注射雞紅細(xì)胞懸液每只鼠lmL，1h后再向腹腔注射0.9%的生理鹽水1mL稍揉其腹部'頸椎脫臼處死小鼠，每只鼠取腹腔液涂片，冷風(fēng)吹干，甲醇固定5min,姬姆薩染液染色10min，沖洗，晾干，高傳鏡(X400)觀察，計(jì)數(shù)100個(gè)吞噬細(xì)胞，按下列公式計(jì)算吞噬率及吞噬指數(shù)吞噬率(％)=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/100個(gè)巨噬細(xì)胞X100%吞噬指數(shù)=100個(gè)巨噬細(xì)胞所吞噬雞紅細(xì)胞數(shù)的總和/100由表6可看出NP50、100、150mg/kg組的吞噬百分率和吞噬指數(shù)與陰性對(duì)照組比較差異非常顯著(代O.01)，表明NP能顯著增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性。其中NP100mg/kg組的吞噬百分率和吞噬指數(shù)最為突出。表6NP對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響(義土&n=10)組別劑量(mg/kg.d)吞噬百分率(％)吞噬指數(shù)陰性對(duì)照組—36.45±1.510.卵±0.08多糖組5041.47±1.61*1.24±0.12'多糖組10052.67±1.62*2.20±0.15*多糖組15045.79±1.64*1.66±0.12'與陰性對(duì)照組比較><0.01實(shí)施例8:夾竹桃多糖(NP)對(duì)ConA誘導(dǎo)的正常小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成4組，每組5只，分別為生理鹽水陰性對(duì)照組，NP50、100、150mg/kg組,連續(xù)8d腹腔注射按實(shí)施例l所述方法提取的夾竹桃多糖提取物(NP)，末次給藥后4h小鼠以頸椎脫臼處死，75X乙醇浸泡5min，無(wú)菌取脾，剪碎，加入無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基5mL，用研磨棒研磨，過(guò)200目不銹鋼細(xì)胞篩，吸取研磨后的上清于試管內(nèi)，1500rpm離心5min，'棄上清液后加入0.83%Tris_NH4Cl5mL,靜置5min，以使紅細(xì)胞完全破壞，1500rpm離心5min，棄上清液后用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，再以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液制成1X107mL脾淋巴細(xì)胞懸液，加入96孔培養(yǎng)板，每孔180叱，每組4個(gè)復(fù)孔，每孔加入ConA20叱至終濃度為5Pg/mL，置5%0)2培養(yǎng)箱37。C培養(yǎng)48h，加入MTT20HL,放置5%(]02培養(yǎng)箱37。C反應(yīng)4h,輕輕吸出上清液，每孔加入二甲亞砜150叱，于振蕩器上振蕩30s，酶標(biāo)儀595nm處讀取A值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖率(另設(shè)4個(gè)只加培養(yǎng)液的調(diào)零孔)。細(xì)胞增殖率(％)=供試品組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值X100%由表7可看出在NP對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)中NP50、100、150mg/kg組在595nm的吸光度值與陰性對(duì)照組比較差異非常顯著(PO.01)，各組的淋巴細(xì)胞增殖率分別為130%、174%、139%，說(shuō)明NP能明顯提高ConA誘導(dǎo)的小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖能力，其中NP100mg/kg劑量組的吸光度值和淋巴細(xì)胞增殖率最為突出。表7NP對(duì)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響(xis，n=5)組別劑量(mg/kg.d)吸光度值(595nm)淋巴細(xì)胞增殖率(％)陰性對(duì)照組—0.251±0.027一多糖組500.326±0.011*130多糖組1000.435±0.079*174多糖組1500.348±0.011*139與陰性對(duì)照組比較*尸<0.01實(shí)施例9:夾竹桃多糖(NP)對(duì)LPS誘導(dǎo)的正常小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成4組，每組5只，分別為生理鹽水陰性對(duì)照組，NP50、100、150mg/kg組，連續(xù)8d腹腔注射按實(shí)施例l所述方法提取的夾竹桃多糖提取物(NP)，末次給藥后4h小鼠以頸椎脫臼處死，75M乙醇浸泡5min，無(wú)菌取脾，剪碎，加入無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基5mL，用研磨棒研磨，過(guò)200目不銹鋼細(xì)胞篩，吸取研磨后的上清于試管內(nèi)，1500rpm離心5min，棄上清液后加入0.83%Tris-NH4C15mL，靜置5min，以使紅細(xì)胞完全破壞，1500rpm離心5min，棄上清液后用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，再以含IO%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液制成lX10VmL脾淋巴細(xì)胞懸液，加入96孔培養(yǎng)板，每孔180A，每組4個(gè)復(fù)孔，每孔加入LPS20叱至終濃度IOPg/mL，置5%〔02培養(yǎng)箱37'C培養(yǎng)48h，加入MTT20叱，放置5%〔02培養(yǎng)箱37。C反應(yīng)4h，輕輕吸出上清液，每孔加入二甲亞砜150叱，于振蕩器上振蕩30s，酶標(biāo)儀595nm處讀取A值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖率(另設(shè)4個(gè)只加培養(yǎng)液的調(diào)零孔)。細(xì)胞增殖率(％)=供試品組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值X100%由表8可看出在NP對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)中NP50、100、150rag/kg組在595nra的吸光度值與陰性對(duì)照組比較差異非常顯著(戶<0.01)，各組的淋巴細(xì)胞增殖率分別為150%、199%、142%，說(shuō)明NP能明顯提高LPS誘導(dǎo)的小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞的增殖能力。其中NP100mg/kg劑量組的吸光度值和淋巴細(xì)胞增殖率最為突出。表8NP對(duì)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響(xf&n=5)組別劑量(mg/kg.d)吸光度值(595nm)淋巴細(xì)胞增殖率(％)陰性對(duì)照組一0.227±0.007—多糖組500.341±0.022*150多糖組1000.452±0.031*199多糖組1500.323±0.027*142與陰性對(duì)照組比較'戶<0.01實(shí)施例10:夾竹桃多糖的純化采用DEAE-SephadexA-25離子交換柱和葡聚糖SephadexG-100凝膠柱來(lái)進(jìn)一步純化實(shí)施例1得到的夾竹桃多糖。采用下列步驟對(duì)分離膠進(jìn)行預(yù)處理。(1)DEAE-S印hadexA-25離子交換柱的預(yù)處理25gDEAE-SephadexA-25用蒸餾水充分溶脹，用0.5mol/LHC1浸泡30min,水洗至中性，用0.5mol/LNaOH浸泡30min，水洗至中性，再用0.5mol/LHC1浸泡30min，水洗至中性，得C1-型DEAE-S印hadexA-25,然后加蒸餾水浸泡備用。(2)葡聚糖SephadexG-100的預(yù)處理加入適量(略大于吸水率)蒸餾水，加熱煮沸1h，去除凝膠顆粒中的氣泡。多糖純化步驟(1)DEAE-S印hadexA-25裝柱濕法裝柱(1.6cmx50cm)，柱子垂直安裝好，取蒸餾水當(dāng)緩沖液倒入柱內(nèi)1/3處，然后將脫氣后的離子吸附劑用玻璃棒沿壁小心地緩慢倒入柱內(nèi)。(2)平衡待離子吸附劑沉降后打開(kāi)螺旋夾，用3-5倍的蒸餾水作為緩沖液來(lái)平衡層析柱，使凝膠柱的凝膠分布、膨脹度、離子分布等達(dá)到一個(gè)均衡狀態(tài)。(3)上樣加樣前，在平衡好的離子交換柱表面放一片干凈的濾紙。取50mg粗多糖，配成10mgZraL溶液，過(guò)濾后，沿柱壁緩慢加入，注入洗脫液開(kāi)始洗脫。(4)洗脫分別用蒸餾水、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0mol/LNaCl分段梯度洗脫，流速2min/mL，自動(dòng)收集器收集流份，每管5mL。(5)收集用苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)糖液，合并洗脫液多糖陽(yáng)性高峰部分。(6)濃縮、透析、干燥濃縮洗脫液，在蒸餾水中透析48h，用少量AgN03溶液檢驗(yàn)無(wú)氯離子存在后，冷凍干燥得N1，N2兩個(gè)組分。(7)取Nl,N2各50mg，分別配成10mg/mL溶液，過(guò)濾去渣后，過(guò)SephadexG-100柱子，蒸餾水洗脫，流速2min/mL，自動(dòng)收集器收集流份，每管5mL，苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)糖峰的含量，合并洗脫液多糖陽(yáng)性高峰部分，濃縮、冷凍干燥得夾竹桃純多糖NP3和NP4。經(jīng)SephadexG-100柱層析(圖1,2)和聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(圖3)純度鑒定，證實(shí)NP3和NP4為分子量均一的多糖。實(shí)施例11:MTT法測(cè)定NP3和NP4抑制K562細(xì)胞的增殖作用人白血病細(xì)胞株K562,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置37。C，含5%C02，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天換液傳代l次。實(shí)驗(yàn)用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。將K562細(xì)胞密度調(diào)整為Ixl05/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180pL，然后每孔分別加入不同濃度的NP3和NP4(用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液配制)20使多糖終濃度分別為640pg/mL、320嗎/mL、160pg/mL、80)ig/mL、40ng/mL、20|ag/mL,陰性對(duì)照組加入等體積的無(wú)血清培養(yǎng)液，設(shè)空白對(duì)照組(不加細(xì)胞而只加培養(yǎng)基)，每組設(shè)4個(gè)平行孔，置于37t、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的<:02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、孵育48h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20^L,繼續(xù)孵育4h后，小心吸去上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150nL，振蕩10min，置酶標(biāo)儀上測(cè)定490nm和630nm雙波長(zhǎng)處吸光度(A),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，以藥物濃度對(duì)細(xì)胞增值抑制率的對(duì)數(shù)值作直線回歸，計(jì)算ICso值。細(xì)胞增殖抑制率(％)=(l-用藥組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)xi00%IC5()=lg-l[Xm-i(Zp-0.5)其中Xm:設(shè)計(jì)的最大濃度的對(duì)數(shù)值；i:各濃度倍比數(shù)的對(duì)數(shù)值；Zp:各組生長(zhǎng)抑制率之和；0.5;經(jīng)驗(yàn)常數(shù)。不同濃度的NP3、NP4作用K562細(xì)胞48h后，K562細(xì)胞的生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制，并且隨著藥物濃度的升高抑制作用逐漸加強(qiáng)，均呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，NP3作用K562細(xì)胞48h的ICw為131.21嗎/mL，KP4作用K562細(xì)胞48h的IC5o為113.88|ag/mL,結(jié)果見(jiàn)表9，10。表9不同濃度的NP3作用K562細(xì)胞48h后MTT檢測(cè)結(jié)果(iiy)組別吸光度A抑制率(％)陰性對(duì)照組0.322±0.036—0.296±0.028*8.07鄭g/mL0.286±0.022*11.1880Hg/mL0.259±0.02廣19.57160Pg/mL0.167±0.013**48.140.061±0.008**81.066柳g/mL0.015±0.003**95.65與陰性對(duì)照組比較*尸<0.05，**尸<0.01表10不同濃度的NP4作用K562細(xì)胞48h后MTT檢測(cè)結(jié)果(jc封)組別吸光度A抻制率(％)陰性對(duì)照組0.322±0.036—20化/mL0.288±0.047*10.56卿g/mL0.266±0.041*17,390.235±0.014**27.02160lVmL0.147±0.029林54.35320Hg/mL0.048±0,015^85.09■6柳g/mL0.020±0.011**93.79與陰性對(duì)照組比較'尸<0.05,*V<0.01實(shí)施例12:細(xì)胞集落形成試驗(yàn)檢測(cè)NP3和NP4對(duì)K562細(xì)胞集落形成的影響培養(yǎng)體系的總體積為lmL，RPMI-1640培養(yǎng)液含10%的胎牛血清和0.8%的甲基纖維素，實(shí)驗(yàn)組多糖的終濃度分別為120pg/mL、80pg/mL、40)ag/mL，陰性對(duì)照組加無(wú)血清等量的無(wú)血清RPMI-1640，K562細(xì)胞終濃度為3xl02/mL，種于24孔板，每組設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)第lld，計(jì)數(shù)集落數(shù)目(大于或等于20個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞群為一個(gè)集落)，計(jì)算集落形成抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。集落形成抑制率(％)=(l-實(shí)驗(yàn)組集落數(shù)/對(duì)數(shù)組集落數(shù))xlOOo%NP3、NP4處理組與陰性對(duì)照組相比集落數(shù)差異顯著或非常顯著(尸<0.05或戶<0.01)。隨著NP3、NP4濃度的增加，K562細(xì)胞集落形成抑制率均明顯上升，NP3的抑制率依次為20.9%、48.9%、88.1%，NP4的抑制率依次為24.5%、54.9%、90.8%，并且藥物處理組與陰性對(duì)照組相比，集落明顯小的多，且胞內(nèi)顆粒增多變大，見(jiàn)表ll，12。表ll不同濃度的NP3對(duì)K562細(xì)胞集落形成的影響(jc±5)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表12不同濃度的NP4對(duì)K562細(xì)胞集落形成的影響(x")<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>與陰性對(duì)照組比較'戶<0.05,"尸<0.01實(shí)施例13:N4對(duì)K562細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的檢測(cè)采用DNA片段化方法檢測(cè)，簡(jiǎn)要步驟如下(1)取陰性對(duì)照組與NP4終濃度分別為80ng/mL、160嗎/mL、320ng/mL處理96h的K562細(xì)胞(107個(gè)細(xì)胞左右)；(2)PBS洗滌2次，加入50pL細(xì)胞裂解液充分裂解；(3)12000rpm離心5min，吸上清于另一EP管；(4)加入SDS(終濃度為1°/0、RnaseA(終濃度為1ng/nL)，置56。C孵育120min;(5)再加入蛋白酶K(終濃度為2.5pg/nL)，37T作用120min;(6)加入1/10體積的10M乙酸銨，2.5體積無(wú)水乙醇沉淀DNA，-20。C放置過(guò)夜；(7)12000rpm離心5min，棄上清；(8)提取的DNA風(fēng)干后，溶于20iiLTE緩沖液；(9)經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳，35V，34h后用0.5嗎/mL溴化乙錠染色30min;(10)紫外燈下觀察，用凝膠圖象分析儀攝取并分析結(jié)果。NP4處理K562細(xì)胞96h后，320pg/mL、160pg/mL處理組均出現(xiàn)明顯凋亡特征的DNA改變，即呈典型的DNA降解"梯狀"條帶片段，并且隨著作用藥物濃度的升高凋亡梯狀條帶更加明顯，80ng/mL組現(xiàn)象不明顯，而陰性對(duì)照組NP4處理組未出現(xiàn)DNA片段化現(xiàn)象(圖4)。權(quán)利要求1、一種夾竹桃多糖提取物的制備方法及多糖提取物的醫(yī)藥用途，其特征在于它是用以下方法得到的(1)采集夾竹桃葉水洗干凈，晾干水分，50～60℃左右烘干，粉碎后過(guò)60目篩；(2)藥材粉末用70％乙醇在60℃下回流3次，每次3h，過(guò)濾取濾渣，揮干溶劑；(3)取揮干溶劑后的濾渣，按濾渣∶水為1∶6～10的體積比例于60～99℃熱水中提取，離心或抽濾去渣，取上清，優(yōu)選的提取溫度是95℃；(4)采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮由步驟(3)得到的提取液至原體積的1/2～1/4，得到濃縮液；濃縮液加10％三氯乙酸至pH＝4.0，4℃冰箱放置24h后以8000r/min離心15min，棄沉淀，再取上清液用0.5mol/L的NaOH液調(diào)溶液的pH值至中性，采用sevage法、TCA法、酶法或者這幾種方法聯(lián)用去除溶液中的蛋白；(5)將去除蛋白的上清液裝入透析袋透析，流水透析3d，后蒸餾水透析1d；(6)由步驟(5)所得的上清液中加入3倍體積的乙醇在在4℃下，靜置1d后，以8000r/min離心15min，收集沉淀物，該沉淀物經(jīng)依次用無(wú)水乙醇、丙酮和乙醚洗滌后冷凍干燥。2、如權(quán)利要求1的夾竹桃多糖提取物的制備方法及多糖提取物的醫(yī)藥用途，其中所說(shuō)的夾竹桃是指夾竹桃((7Ven'咖j'/7&'c咖Mill.)的葉、枝、根和皮。3、如權(quán)利要求1的夾竹桃多糖提取物的制備方法及多糖提取物的醫(yī)藥用途，其中所說(shuō)的用于制備治療動(dòng)物和人腫瘤性疾病的藥品包括該夾竹桃提取物單獨(dú)使用及作為有效成分與其它藥物、藥物載體或賦形劑的組合使用。全文摘要本發(fā)明涉及夾竹桃多糖提取物的制備方法以及該多糖提取物在制備抗腫瘤藥物方面的用途。夾竹桃鮮葉洗凈晾干，烘干粉碎；用乙醇回流除色，取濾渣熱水中抽提后取上清液；濃縮上清液離心棄沉淀，將上清液裝入透析袋透析進(jìn)一步去除溶液中的小分子成分得到夾竹桃多糖凈提取物；加入乙醇，離心沉淀，該沉淀物依次三次后，冷凍干燥即得本發(fā)明所說(shuō)的夾竹桃粗多糖(NP)提取物粉劑。提取物可作為制備治療動(dòng)物和人的腫瘤的藥物組合物中的應(yīng)用，包括該提取物與其它藥物、藥物載體或賦形劑的組合用于制備治療動(dòng)物和人腫瘤性疾病的藥物。提取物中分離純化得到的兩種單一成分多糖可以直接抑制人源腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡，說(shuō)明對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接的殺傷作用。文檔編號(hào)A61K36/24GK101612180SQ20091011190公開(kāi)日2009年12月30日申請(qǐng)日期2009年6月5日優(yōu)先權(quán)日2009年6月5日發(fā)明者吳建璋,肖義軍,陳元仲申請(qǐng)人:福建師范大學(xué)