專利名稱：：3-羰基-12-烯-烏索烷化合物的抗腫瘤用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種三萜類化合物的抗腫瘤用途，具體涉及3-羰基-12-烯-烏索烷化合物的抗腫瘤用途，用于抑制胃癌細(xì)胞系SGC-7901和肝癌細(xì)胞系BEL-7404細(xì)胞增殖的。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明使用3-羰基-12-烯-烏索垸化合物由藥用植物苦j茶提取獲得，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下Z—、A苦丁茶在我國作為藥品和飲品使用有悠久歷史。苦丁茶主產(chǎn)于廣兩、廣東、海南、貴州、四川、福建等地。最早見于東漢時(shí)期的《桐君錄》，明代李時(shí)珍《本草綱目》上記載其無毒，煮飲能止渴，明目除煩等?？喽〔瓒?/toto^咖)，冬青科(Aquifoliaceae),冬青屬，別名苦丁茶。常綠喬木，高達(dá)20米；樹皮灰黑色，粗糙；枝條粗壯，平滑無毛，幼枝有棱。葉厚革質(zhì)，長橢圓形，長8—20厘米，寬4.5—7.5厘米，頂端銳尖，基部楔形，主脈在表面凹陷，在背面顯著隆起；葉柄粗壯，長約1.5厘米。聚傘花序密集于二年生枝條葉腋內(nèi)，雄花序每1分枝有花3—9朵，雌花序每1分枝有花1一3朵；花瓣橢圓形，基部連合，長約為萼裂片的3倍。果實(shí)球形，紅色或褐色；分核4。花期4一5月，果熟期10月?？喽〔韬悬S酮類、三砲及其皂武類、氨基酸類、多酚類與咖啡堿和維生素c等物質(zhì)。冬青屬苦丁茶在植物保健品產(chǎn)業(yè)化利用和臨床應(yīng)用上具有重要的藥理價(jià)值，其藥理作用包括保健心腦血管作用、降壓作用、降脂減肥作用、抗炎殺菌作用、抗生育作用、抗氧化作用及提高免疫功能作用。目前，有關(guān)苦丁茶成分的研究報(bào)道包括(文永新等.苦丁茶化學(xué)成分的研究.廣西植物，1990，10:364—368;文永新等.苦丁茶甙元I的結(jié)構(gòu)鑒定.植物學(xué)報(bào)，1999,41:206—208;OuyangMAefa/.Triterpenesandtriterpenoidglycosidesfromtheleavesof/feeA:zW/"c/ra.尸/2;;tocAem/W7,1996，41(3):871-877;歐陽明安等.苦丁茶冬青化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)研究.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1997，9(3):19—23;歐陽明安.新三萜及其皂甙化學(xué)結(jié)構(gòu)的NM附開究.波譜學(xué)雜志，1996，13:231—237;OuyangMAa,.Triterpenoidglycosidesfrom//ex&M(if>7cA".P/zytoc/em/str_y,1996,43:443-445;歐陽明安等.二萜大葉冬青甙I和苦丁冬青甙K的NMR研究.波譜學(xué)雜;志,2001，18:155—160;KeiichiNa/.Activity-GuidedisolationoftriterpenoidacylCoAcholesterylacyltransferase(A-CAT)inhibitorsfrom//exJAto1999，62:1061-1064;KeiichiN"a/.Triterpenoidsaponinsfrom//ex/b^/"c/^./M^尸ra41999,62:1128-1131;劉韶等.苦丁茶化學(xué)成分的研究.中國中藥雜志.2003，28:834—835)。有關(guān)冬青屬苦丁茶藥理作用的已有文獻(xiàn)和專利報(bào)道(楊彪等.苦丁茶提取物抗氧化作用的研究.廣西民族學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2000，6(2):108—110;陳一等.苦丁茶冬青葉的降壓作用研究.中草藥，1995，26:250—252;向華林.中國皋盧(苦丁)茶降脂作用的實(shí)驗(yàn)研究.中國中藥雜志，1994，19:497—498)，近年來，已報(bào)道的有關(guān)苦丁茶藥理作用的文獻(xiàn)未見以三萜化合物作用于胃癌細(xì)胞系SGC-7901和肝癌細(xì)胞系BEL-7404的抗腫瘤活性作用及誘導(dǎo)凋亡的反應(yīng)的報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是將3-羰基-12-烯-烏索垸化合物(以下簡稱化合物A)應(yīng)用于抑制癌細(xì)胞，具體用于抑制胃癌細(xì)胞系SGC-7901和肝癌細(xì)胞系BEL-7404的細(xì)胞增殖。1、本發(fā)明使用化合物A由苦丁茶A:^>ic/^)中分離，制備方法如下稱取苦丁茶冬青葉a/exA"力'"c/m)5kg，粉碎后用70%乙醇回流提取3次，濾去不溶物，蒸干提取液，將浸膏懸乳分散在冷水中，浸膏分為水溶性和脂溶性兩部分。取脂溶性提取物經(jīng)洗脫液石油醚-丙酮(10:2)，過200-300目的硅膠柱；然后，經(jīng)洗脫液正己垸—丙酮(10:1)反復(fù)硅膠(10-4(^m)分離，最后通過HPLC分離，得到化合物A。1抗腫瘤活性檢測(cè)方法(1)稱取化合物A2mg，用DMSO預(yù)溶，加入生理鹽水溶解至供試濃度，抽濾后備用。所述供試濃度為100Mg/mL，50jug/mL，25pg/mL，12.5Mg/mL，6.25Mg/mL，3.13pg/mL，1.65ng/mL，0.83(ig/mL，0.42pg/mL。(2)根據(jù)MTT法檢測(cè)化合物A對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901和肝癌細(xì)胞BEL-7404的抑制活性。(3)根據(jù)供試濃度抗腫瘤活性抑制率值，通過曲線回歸方程，計(jì)算ICs。值。2化合物A的誘導(dǎo)凋亡檢測(cè)歩驟根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA提取試劑盒說明提取細(xì)胞DNA，并用TE溶解。取20DNA上樣于1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。3化合物A對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax的作用檢測(cè)。(1)細(xì)胞接種后24h，分別加入化合物A至504g/mL。(2)培養(yǎng)24h，然后以胰酶消化液5mL消化、于離心機(jī)上1000rpm/min離心5min后收集細(xì)胞。(3)根據(jù)RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將提取的細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,備用。(4)利用設(shè)計(jì)的Bax基因引物和P-actin內(nèi)參基因引物，根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。所述Bax基因引物；Bax正向引物為5'-CGAGTGGCAGTGACATGT-3',Bax反向引物為5'陽TCTTCTTCCAGATGGTGAG-3'。所述(3-actin內(nèi)參基因引物；(3-actin正向引物為5'-CCAAGGCCAACCGCGAAGATG-3'，p-actin反向引物為5'-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCA-3'。(5)根據(jù)以下公式計(jì)算結(jié)果實(shí)驗(yàn)組目的組基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組基因的表達(dá)的變化倍數(shù)—-[(ct處理組目的基因-ct處理組內(nèi)參基因)-(ct對(duì)照組S的基因-ct對(duì)照組內(nèi)參基因)]本發(fā)明的試驗(yàn)證明，化合物A能抑制腫瘤細(xì)胞株的生長，在以人胃癌細(xì)胞株和肝癌細(xì)胞株為靶細(xì)胞的抗腫瘤活性試驗(yàn)巾，化合物A的半數(shù)致死量IC50值分別為16.66pg/mL和1.48pg/mL,表明化合物A可用于制備抗腫瘤藥物。通過電泳檢測(cè)，化合物A能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株產(chǎn)生凋亡。更進(jìn)一歩地通過實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)證明，化合物A誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要原因是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax表達(dá)量的增加來實(shí)現(xiàn)的，這是對(duì)上述抗腫瘤活性試驗(yàn)的進(jìn)一步證明。上述試驗(yàn)表明化合物A用于抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901和肝癌細(xì)胞BEL-7404細(xì)胞增殖，效果明顯?？捎糜谥苽淇鼓[瘤藥物；電泳檢測(cè)表明，化合物A可以用于促進(jìn)肝癌細(xì)胞BEL-7404凋亡。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)證明，化合物A可以促進(jìn)凋亡相關(guān)基因Bax表達(dá)量增加。具體表述為化合物A誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要原因是通過基因水平促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax表達(dá)量的增加來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的有益效果(1)本發(fā)明的試驗(yàn)證明，通過MTT法檢測(cè)化合物A的抗腫瘤活性，具有抑制胃癌細(xì)胞系SGC-7901和肝癌細(xì)胞系BEL-7404細(xì)胞增殖的活性，能夠抑制胃癌細(xì)胞系SGC-7901和肝癌細(xì)胞系BEL-7404的生長。(2)化合物A的半數(shù)致死量IC,值分別為16.66Mg/mL和1.48pg/mL，尤其是其對(duì)肝癌細(xì)胞系BEL-7404的半數(shù)致死量IC5。值與抗腫瘤臨床用藥5'-氟脲嘧啶對(duì)肝癌細(xì)胞系BEL-7404的半數(shù)致死量ICs。值相當(dāng)。(3)化合物A誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡效果明顯，具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系BEL-7404凋亡的作用，同時(shí)可以促進(jìn)凋亡相關(guān)基因Bax表達(dá)量增加，是可以用作抗腫瘤藥物的先導(dǎo)化合物?？梢杂糜谥苽淇鼓[瘤藥物。(4)本發(fā)明涉及的化合物A來源于苦丁茶冬青，屬于天然保健品，以苫丁茶為原材料的保健食品眾多。化合物A相對(duì)于其他抗癌藥物具有毒性和副作用都較小的特點(diǎn)。(5)苦丁茶冬青取材容易，價(jià)格低廉，化合物A的原材料成本低。(6)本發(fā)明涉及的化合物A結(jié)構(gòu)復(fù)雜，結(jié)構(gòu)中手性碳較多，該化合物主要來源于天然產(chǎn)物，不易人工合成。因此，由天然產(chǎn)物中分離獲得該類化合物是最簡捷實(shí)際的途徑。圖1為化合物A誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞BEL-7404凋亡DM電泳圖。其中，左圖為正常肝癌細(xì)胞株的DNA電泳圖；圖中，第一泳道為DNAMarker,第一、三、四泳道分別為正常肝癌細(xì)胞BEL-7404培養(yǎng)12h、24h和48h后的DNA樣品。右圖為化合物A作用于肝癌細(xì)胞凋亡DNA電泳圖；所述化合物A的濃度為50ng/mL。圖中，第一泳道為DNAMarker,第二、三、泳道分別為化合物A作用于肝癌細(xì)胞BEL-7404培養(yǎng)12h、24h和48h后的DNA樣品。具體實(shí)施例以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例l:化合物A的制備1.制備方法稱取干燥的苦丁茶冬青葉5kg，粉碎后55。C下用70%乙醇冋流提取3次，濾去不溶物，合并提取液，在38t:條件下真空減壓濃縮得浸膏，將浸膏懸乳分散在冷水中，浸膏分為水溶性和脂溶性兩部分。取脂溶性提取物經(jīng)洗脫液石油醚-丙酮(10:2)，過200-300目的硅膠柱；然后，經(jīng)洗脫液正己烷-丙酮(10:1)反復(fù)硅膠(10—40pm)分離，最后通過HPLC分離，得到化合物A。2.試驗(yàn)結(jié)果化合物A為無色晶體，試驗(yàn)數(shù)據(jù)如下IR(cm"):2918，1707(00)，1659(C=C)，1456，1381;EI—MSm/z:424[M]+，409[M-CH3]+，218，203，189，149，133;1HNMR(400MHz,CDC13):S5.15(1H，m，《/=3.0Hz，H-12)，1.10(s,3H)，1.08(s,6H)，1.06(s,3H)，L05(s,3H)0.92(s,3H)，0.81(s,6H);"C畫R(100顧z，CDC13):S217.8(C-3)，139.7(C-13)，24.2(C-12)59.1(C-18),55.3(C-5)47.9(C扁9)，42.2(C-14)，41.5(C-22)，40.0(C-8)39.7(C陽20)，39.6(C畫19)，39.4(C-l)，36.6(C陽IO)，34.2(C-17)，33.8(C-4)，32.5(C-7)，31.2(C-21),28.7(C-15)，28.2(C-28)，28.1(C-2)，36.9(C-23)，26.6(C-16)，23.6(C畫27)，23.2(C畫ll)，21.5(C-30)，21.3(C-25)，19.6(C-6)，17.4(C-26)，16.8(C-29),15.4(C-24)。實(shí)施例2:MTT法檢測(cè)化合物A抗腫瘤活性試驗(yàn)1.材料1.1培養(yǎng)基類RPMI1640(GibcoBRL)，小牛血清(杭州四季青)，青鏈霉素(Sigma)，胰蛋白酶(北京天象人生工)。1.2溶劑及溶液類MTT(廈門鷺隆生物公司)，DMSO(國產(chǎn)分析純)。1.3細(xì)胞株人胃癌細(xì)胞系SGC-7901,人肝癌細(xì)胞系BEL-7404。2.操作步驟消化后的單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后細(xì)胞按180pL/孔，接種于96孔平底培養(yǎng)板中，37。C下于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，按不同濃度加入經(jīng)細(xì)菌過濾器處理后的化合物A溶液及標(biāo)準(zhǔn)品溶液20pL/孔，培養(yǎng)3天。倒去培養(yǎng)液用PBS清洗。加MTT(0.2mg/L)200)aL/孔，放入(302培養(yǎng)箱37。C培養(yǎng)4h。除去MTT，加入DMSO-甘氨酸緩沖液，搖床搖0.1-0.5h(細(xì)胞看不見為止)。設(shè)置入=570nm，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值(即此波長下的吸光度)。每個(gè)96孔板設(shè)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照。陽性對(duì)照加入50iag/mL的5'-氟脲嘧啶，陰性對(duì)照加入培養(yǎng)液。兩種對(duì)照在邊緣和中間各設(shè)二孔，以防邊緣效應(yīng)?？瞻讓?duì)照設(shè)在右上角第一個(gè)孔。按下式計(jì)算抑制率對(duì)照組OD值一實(shí)驗(yàn)組OD值抑制率=對(duì)照組(9D值X100%抗癌藥物活性以IC5。衡量，IC幼是抑制率為50%時(shí)的樣品濃度。3.試驗(yàn)結(jié)果化合物A的抗腫瘤活性IC5。結(jié)果如表1所示，化合物A對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901和肝癌細(xì)胞BEL-7404的活性作用IC5。值均較低，尤其是其作用于肝癌細(xì)胞BEL-7404的ICs。值，與標(biāo)準(zhǔn)品5'-氟脲嘧啶作用于肝癌細(xì)胞BEL-7404的IC5。值相當(dāng)，因此可以確定化合物A具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，可用于制備抗腫瘤藥物。表1化合物A的抗腫瘤活性IC5。結(jié)果IC50IC50化合物(ng/mL±SD)(貼/mL士SD)X1^6±5.251.48±0.545'—氟脲嘧啶(5-FU)].01±0.041.45±0.21化合物A和標(biāo)準(zhǔn)品5'—氟脲嘧啶按照濃度梯度依次稀釋為100化/mL，50Pg/mL，25Pg/mL，12.5Pg/mL，6.25^g/mL，3.13Pg/mL，1.65Pg/mL，0.83Pg/mL。表1中a為化合物A對(duì)胃癌細(xì)胞系SGC-7901的IC,。值，b為化合物A對(duì)肝癌細(xì)胞系BEL-7404的ICs。值。IG。值代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，平行試驗(yàn)重復(fù)三次。實(shí)施例3:化合物A誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)1.材料凋亡細(xì)胞DNA提取試劑盒(TaKaRa)。細(xì)胞株人胃癌細(xì)胞系SGC-7901，人肝癌細(xì)胞系BEL-7404。2.操作步驟(1)細(xì)胞接種，24h后分別加入化合物A至終濃度50(ig/mL。(2)繼續(xù)分別培養(yǎng)12h，24h，48h后以胰酶消化液5mL消化、于離心機(jī)上1000rpm/min離心5min后收集試驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞。(3)根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA提取試劑盒說明提取細(xì)胞DNA，并用TE溶解。(4)取20pLDNA上樣于1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。3.試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，左圖中正常肝癌細(xì)胞DNA在培養(yǎng)12h、24h和48h后，DNA片段未出現(xiàn)任何異常情況。而右圖中，肝癌細(xì)胞經(jīng)50pg/mL的化合物A作用12h時(shí)，就開始出現(xiàn)DNA降解的現(xiàn)象，在24h時(shí)，DNA降解程度加強(qiáng)，到48h時(shí)，DNA降解程度最強(qiáng)，幾乎完全降解。DNA成片段化降解是DNA凋亡的一個(gè)重要特征。因此，我們確定化合物A對(duì)肝癌細(xì)胞的活性是通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的，而且此過程產(chǎn)生于化合物A作用于細(xì)胞12h的時(shí)候。實(shí)施例4:化合物A對(duì)凋亡相關(guān)基因Bax的作用1材料RNA提取試劑盒(TaKaRa)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，SYBR/Vemix五;c7^熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa)。引物Bax正向引物5'—CGAGTGGCAGTGACATGT—3'，Bax反向引物5'—TCTTCTTCCAGATGGTGAG—3'。(3—actin正向引物5'—CCAAGGCCAACCGCGAAGATG—3'，p—actin反向引物5'—AGGGTACATGGTGGTGCCGCCA—3'。2操作步驟(1)細(xì)胞接種，培養(yǎng)24h分別加入化合物A至5嗎/mL，10pg/mL，20嗎/mL。(2)繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后后以胰酶消化液5mL消化細(xì)胞、于離心機(jī)匕1000rpm/min離心5min離心收集試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞。(3)根據(jù)RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將提取的細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，備用。(4)利用設(shè)計(jì)的Bax及P-actin(內(nèi)參基因)基因引物，根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明使用SYBRGreenI嵌合熒光法于ABI系列7700熒光儀—卜.進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下94。C4minl個(gè)循環(huán)，94。C20s，40個(gè)循環(huán)，60°C30s，40個(gè)循環(huán)。(5)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用以下方法實(shí)驗(yàn)組目的組基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組基因的表達(dá)的變化倍數(shù)=-KCt處理組目的基因-Ct處理組內(nèi)參基因)-(Ct對(duì)照組目的基因-Ct對(duì)照組內(nèi)參基因)]丄3試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，5pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品5'—氟脲嘧啶作用于肝癌細(xì)胞24h后Bax基因的表達(dá)量是正常細(xì)胞的3.18倍，促進(jìn)其表達(dá)量增加；同濃度下的化合物A作用于肝癌細(xì)胞24h后Bax基因的表達(dá)量與正常細(xì)胞相當(dāng)。但隨著濃度的升高，化合物A對(duì)肝癌細(xì)胞Bax基因的表達(dá)量的促進(jìn)作用是逐漸增強(qiáng)的，當(dāng)濃度為lOpg/mL時(shí)，其表達(dá)量為正常細(xì)胞的4.12倍，與相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作用下的基因表達(dá)量相當(dāng)。當(dāng)濃度為20pg/mL時(shí)，其表達(dá)量為正常細(xì)胞的9.56倍，比相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作用下的基因表達(dá)量要高。綜上所述，化合物A對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡作用可能一方面是通過對(duì)凋亡相關(guān)基因Bax表達(dá)量的增加來實(shí)現(xiàn)的。閔此，化合物A可以用于制備抗腫瘤藥物。表2化合物A對(duì)肝癌細(xì)胞系BEL-7404凋亡相關(guān)基因Bax表達(dá)量的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2中，a為正常肝癌細(xì)胞BEL-7404中基因Bax的表達(dá)量，即未加化合物A和5'-氟脲嘧啶時(shí)肝癌細(xì)胞BEL-7404中基因Bax的表達(dá)量；b、c、d分別為化合物A和5'-氟脲嘧啶在濃度為5嗎/mL、10pg/mL和2(^g/mL時(shí)，對(duì)肝癌細(xì)胞BEL-7404中基因Bax的表達(dá)量?；虮磉_(dá)量表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，平行試驗(yàn)重復(fù)三次。權(quán)利要求1、一種如下式所示的3-羰基-12-烯-烏索烷化合物的用途，其特征在于用于抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901和肝癌細(xì)胞BEL-7404細(xì)胞增殖。2、如權(quán)利要求1所述的3-羰基~12-烯-烏索烷化合物的用途，其特征在于用于促進(jìn)凋亡相關(guān)基因Bax表達(dá)量增加，并促進(jìn)肝癌細(xì)胞BEL-7404凋亡,全文摘要本發(fā)明涉及3-羰基-12-烯-烏索烷化合物抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901和肝癌細(xì)胞BEL-7404的用途。試驗(yàn)表明3-羰基-12-烯-烏索烷化合物用于抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901和肝癌細(xì)胞BEL-7404細(xì)胞增殖，效果明顯，可用于制備抗腫瘤藥物。電泳檢測(cè)表明，3-羰基-12-烯-烏索烷化合物可以通過促進(jìn)凋亡相關(guān)基因Bax表達(dá)量的增加，促進(jìn)肝癌細(xì)胞BEL-7404凋亡。文檔編號(hào)A61K31/56GK101574352SQ200910111980公開日2009年11月11日申請(qǐng)日期2009年6月15日優(yōu)先權(quán)日2009年6月15日發(fā)明者吳祖建,歐陽明安,碩沈,謝聯(lián)輝申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)