專利名稱：：九里香葉總黃酮在制備治療糖尿病藥物中的應用的制作方法九里香葉總黃酮在制備治療糖尿病藥物中的應用本發(fā)明涉及對糖尿病具有治療作用的中藥有效部位，屬于中醫(yī)中藥領域。
背景技術：
：目前糖尿病發(fā)病率和病死率逐漸上升，已成為繼腫瘤、心腦血管疾病之后，危害人類健康的第三大病種，我國糖尿病的發(fā)病率與國外發(fā)達國家相比雖然并不算高，但我國人口眾多，病人的絕對人數(shù)卻居世界首位。因此，尋找安全有效的藥物用于防治糖尿病成為醫(yī)學研究的重要課題之一。目前用于治療2型糖尿病的口服降糖藥包括磺酰脲類、雙胍類、胰島素增敏劑、促胰島素分泌藥、醛糖還原酶抑制劑等。而這些口服降糖藥存在低血糖癥、胃腸道反應等副作用，同時隨著治療時間的延長，降糖效果呈降低趨勢。九里香[Murrayapaniculata(L.)Jack]為蕓香科九里香屬植物，主要產(chǎn)自我國云南、貴州、湖南、廣東、廣西、福建、臺灣等地。到目前為止從九里香[Murrayapaniculata(L.)Jack]葉中共分得9個黃酮類化合物，分別是3，5，6，7，8，3'，4'，5'-八甲氧基黃酮(3,5，6，7，8，3',4',5'—octaraethoxyflavone)、3，5，6，7，3'，4'，5'—^匕甲氧基黃酮(3，5，6，7，3'，4'，5'-h印tamethoxyflavone)(江蘇新醫(yī)學院，中藥大辭典，上冊，上海人民出版社，1977:44-45);5，7，8，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮(5，7,8,3'，4',5'—hexamethoxyflavone)、3，5，7，8，3'，4'，5'—七甲氧基黃酮(3,5，7，8，3'，4',5'-h印tamethoxyflavone)(植物學報1984，26(2):184-186);5，7，3',4'，5'-五甲氧基黃酮(5,7，3'，4',5'-pentamethoxyflavone)(化學學報1984，42，1308-1311)以及5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮以及3'-羥基-5，7，4'-三甲氧基黃酮(中國專利《千里香葉總黃酮及其制備方法及應用》，申請?zhí)?00710147357.2)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供的是一種植物提取物的新的醫(yī)藥用途，即九里香葉總黃酮在制備治療糖尿病藥物中的應用。所述九里香葉總黃酮其特征在于其中至少含有5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮中的兩種或兩種以上。而且其中5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮的含量之和大于50%或者5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮和5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮的含量之和大于50%。本發(fā)明所述的藥物可以是片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液等口服劑型，也可以是注射劑等非口服劑型。另外本發(fā)明所述的九里香葉總黃酮可以與其他藥物包括化學藥、中藥以及天然藥物組成復方藥物用于糖尿病的治療。本發(fā)明是通過如下創(chuàng)新性研究完成的。(1)通過對九里香葉化學成分的提取分離，從九里香葉中分得了6種黃酮類化合物，并通過NMR等波譜數(shù)據(jù)的分析鑒定了其結構，它們分別是5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7,3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮以及3'-羥基-5，7，4'-三甲氧基黃酮(2)通過提取純化工藝的研究，完成了九里香葉總黃酮的制備工藝，所得九里香葉總黃酮以5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮為主要成分(3)建立了5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮的HPLC含量測定方法，測定結果表明九里香葉總黃酮中上述黃酮類化合物的含量之和在50%至100%之間(4)通過動物實驗發(fā)現(xiàn)了九里香葉總黃酮對糖尿病的治療作用(5)對以九里香葉總黃酮為活性成分的藥物制劑進行了研究，從而完成了本發(fā)明。具體如下。1、九里香葉化學成分的提取分離及結構鑒定(中國專利《千里香葉總黃酮及其制備方法及應用》，申請?zhí)?00710147357.2)。2、九里香葉總黃酮的制備工藝(中國專利《千里香葉總黃酮及其制備方法及應用》，申請?zhí)?00710147357.2)。3、九里香葉總黃酮中黃酮含量測定(1)儀器、試劑、對照品Agilent1100Series高效液相色譜儀Z0RBAXExtend—C184.6X250誦ODS，5wm色譜柱VWD可變波長自外檢測器色譜甲醇、二次蒸餾水(2)色譜條件色譜柱用ZorbaxExtendODS柱，4.6X250,，5um;柱溫為25。C;流動相為甲醇水=58:42;流速為1.2mL/min;檢測波長為337nm;進樣量為20y1。(3)對照品溶液的制備分別取5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮和7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每1毫升分別含0.4、0.3、0.03、0.03、0.04毫克的溶液，搖勻，即得。(4)供試品溶液的制備取九里香葉總黃酮100mg，精密稱定，加甲醇溶解，超聲提取3次，每次加甲醇15ml，超聲時間均為20min，合并提取液，蒸干溶劑，加甲醇溶解并定容至100ml，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。(4)測定方法分別精密吸對照品溶液與供試品溶液各20ul，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，利用外標一點法進行含量計算。具體實施方式實施例1取九里香葉2公斤，85%乙醇回流提取3次，乙醇量分別為10、8、6倍，回流時間分別為60、45、30分鐘，濾過，合并提取液，減壓濃縮至無乙醇味，加水稀釋，過AB-8大孔吸附樹脂吸附，50升千分之一氫氧化鈉水溶液沖洗，水洗至中性，85%乙醇洗脫至薄層層析檢測不到JA(5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮)為止，洗脫液減壓回收乙醇，得九里香葉提取物。取此九里香葉提取物進行硅膠柱層析，乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作為流動相進行梯度洗脫，收集黃酮部分，回收溶劑，得九里香葉總黃酮38克。經(jīng)HPLC檢測，其中5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮含量為39.8%，5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮含量33.2%為，5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮含量為3.2%、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮含量為2.8%，7-羥基_5，3'，4'-三甲氧基黃酮含量為5.0%。實施例2取九里香葉2公斤，85%乙醇回流提取3次，乙醇量分別為IO、8、6倍，回流時間分別為60、45、30分鐘，濾過，合并提取液，減壓濃縮至無乙醇味，加水稀釋，過D4020大孔吸附樹脂吸附，80升千分之一氫氧化鈉水溶液沖洗，水洗至中性，85°/。乙醇洗脫至薄層層析檢測不到JA(5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮)為止，乙醇洗脫液過D941脫色樹脂脫色，減壓回收乙醇，得九里香葉提取物。取此九里香葉提取物進行硅膠柱層析，乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作為流動相進行梯度洗脫，收集黃酮部分，回收溶劑，得九里香葉總黃酮31克。取此九里香葉總黃酮再次進行硅膠柱層析，乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作為流動相進行梯度洗脫，5收集黃酮部分，回收溶劑，得精制九里香葉總黃酮26克。經(jīng)HPLC檢測，其中5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮含量為50.6.0%，5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮含量41.2%為，5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮含量為1.2%、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮含量為1.8%，7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮含量為2.0%。實施例3取九里香葉l公斤，85%乙醇回流提取3次，乙醇量分別為IO、8、6倍，回流時間分別為60、45、30分鐘，濾過，合并提取液，減壓濃縮至無乙醇味，加水稀釋，過AB-8大孔吸附樹脂吸附，85%乙醇洗脫至薄層層析檢測不到JA(5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮)為止，洗脫液減壓回收乙醇，得九里香葉提取物。取此九里香葉提取物進行硅膠柱層析，乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作為流動相進行梯度洗脫，收集黃酮部分，回收溶劑，得九里香葉總黃酮37克。經(jīng)HPLC檢測，其中5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮含量為24.8%，5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮含量21.2%為，5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮含量為2.0%、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮含量為1.6%,7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮含量為3.0%。實施例4取九里香葉總黃酮10克，加淀粉適量，制粒，裝入膠囊，制成1000粒，得九里香葉總黃酮膠囊。實施例5取九里香葉總黃酮10克，加預膠化淀粉、羧甲基淀粉鈉適量，制粒，壓片，制成1000粒，得九里香葉總黃酮片。實施例6取九里香葉總黃酮10克，加吐溫80適量，加10升加熱溶解，高溫滅菌，分裝成100瓶，得九里香葉總黃酮口服液。實施例7取九里香葉總黃酮10克，加入1000ml丙二醇和1000ml注射用水，攪拌溶解，過濾，滅菌，罐裝，每支2ml，得九里香葉總黃酮注射液。實驗實施例第一部分九里香葉總黃酮對腎上腺素所致高血糖小鼠的影響1實驗材料1.1實驗動物健康昆明種小鼠，雌雄各半，體重1620g，由吉林大學基礎醫(yī)學院動物實驗中心提供，質(zhì)量合格證號SCXK-(吉)2003-0001。九里香葉總黃酮，自制，批號070905(實施例l所得樣品，以下簡稱TFMP1)，071018(實施例2所得樣品，以下簡稱TFMP2)，071028(實施例3所得樣品，以下簡稱TFMP3)。1.2藥品與試劑上海禾豐制藥有限公司批號070303天津太平洋制藥有限公司批號070416優(yōu)克糖惠基生物科技股份有限公司鹽酸腎上腺素注射液二甲雙胍1.3主要儀器血糖儀優(yōu)克糖血糖試紙2實驗方法昆明種小鼠90只，雌雄各半，按體重隨機分為9組空白對照組給予O.5%CMC-Na模型組給予0.5%CMC-Na二甲雙胍組給予二甲雙胍100mg/kgTFMP1小劑量組給予TFMPl50mg/kgTFMPl大劑量組給予TFMPllOOmg/kgTFMP2小劑量組給予TFMP250mg/kgTFMP2大劑量組給予TFMP2lOOmg/kgTFMP3小劑量組給予TFMP350mg/kgTFMP3大劑量組給予TFMP3lOOmg/kg各組動物按上面方案灌胃給藥(容量為20ml/kg)，每日l次，共10日，實驗動物于給藥第9日禁食不禁水12h，第10日以優(yōu)克糖血糖儀測定空腹血糖值(mmol/L)為藥前值，然后給藥。末次藥后l小時，除對照組外其他各組動物分別皮下注射O.P/。腎上腺素0.25mg/kg，注射后于30、60、90min斷尾取血，用血糖儀測定血糖值(鵬ol/L)。3統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差(f±S)表示，統(tǒng)計分析采用組間比較t檢驗。4實驗結果結果表明，與空白對照組比較，模型組小鼠注射腎上腺素后3090min血糖均明顯升高，有顯著性差異(代O.Ol)。與模型組比較，二甲雙胍組和TFMP1、TFMP2大劑量組及TFMP3小、大劑量組注射腎上腺素后60min、90min血糖值均明顯下降(代O.05或代O.01)，提示TFMP1、TFMP2及TFMP3均可明顯對抗腎上腺素所致小鼠高血糖，結果見Tab.1。Tab丄EffectofTFMPonbloodglucoseinhyperglycemiamiceinducedbyadrenaline(JT士iS,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>第二部分TFMP的糖耐量實驗1實驗材料1.1實驗動物健康昆明種小鼠，雌雄各半，體重1620g，由吉林大學基礎醫(yī)學院動物實驗中心提供，質(zhì)量合格證號SCXK-(吉)2003-0001。1.2藥品與試劑10%葡萄糖注射液吉林科倫康乃爾制藥有限公司批號S070224LI格列本脲天津太平洋制藥有限公司批號0702051.3主要儀器血糖儀優(yōu)克糖優(yōu)克糖血糖試紙惠基生物科技股份有限公司2實驗方法昆明種小鼠90只，雌雄各半，按體重隨機分為9組空白對照組給予O.5%CMC-Na模型組給予0,5°/。CMC-Na格列本脲組TFMP1小劑量組TFMP1大劑量組TFMP2小劑量組TFMP2大劑量組TFMP3小劑量組TFMP3大劑量組給予格列本脲50mg/kg給予TFMP150mg/kg給予TFMPll(K)mg/kg給予TFMP250mg/kg給予TFMP2lOOmg/kg給予TFMP350mg/kg給予TFMP3lOOrag/kg各組動物按以上方案灌胃給藥，每日1次，連續(xù)10日，實驗動物于給藥第9日禁食不禁水12h，第IO日以血糖儀測定空腹血糖值(mmolZL)為藥前值，然后給藥。末次藥后l小時，除對照組外其他各組經(jīng)腹腔注射葡萄糖2g/kg，測定0.5、1、2小時的血糖值，觀察各組藥物作用。3統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差(f±S)表示，統(tǒng)計分析采用組間比較t檢驗。4實驗結果結果表明，與空白對照組比較，模型組小鼠注射葡萄糖后30120min血糖均明顯升髙，有顯著性差異(代O.Ol)。與模型組比較，格列本脲組注射葡萄糖后60、120min血糖值明顯下降(代O.05);TFMP1、TFMP2及TFMP3小、大劑量組注射葡萄糖后60min、120min血糖值均有下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義("0.05)。提示TFMP1、TFMP2及TFMP3對葡萄糖所致小鼠高血糖無顯著性作用，結果見Tab.2。Tab.2.EffectofTFMPonbloodglucoseinhyperglycemiamiceinducedbyglucose(X±5"，n=10)FBG(畫1/L)GroupOmin30min60min120minControlModelTFMP150mg/kg100mg/kgTFMP250mg/kg100mg/kgTFMP350mg/kg8.59±1.839.09±1.609.26±1.679.12±1.699.41±2.059.67±2.129.60±1.0218.47±7.28*:21.63±6.5316.93±5.7217.33±4.1415.62±3.709.93±1.0215,15±5.4(T14.45±3.8611.39±3.60丄3.09±4.3212.58±3.278.80±1.0013.41±3,36*'12.30±4.0011.52±3.7911.36±3.2710.59±2.659.38±1.9218.24±4.8712.18±2.4911.38±3.50100mg/kg9.56±2.0217.27±3.4411.55±3.2111.12±3.21Glibenclamide50mgZkg9.84±1.6518.97±4.67丄丄.22土2.06*10.32±3.20*#代0.05,w代0.01vsControl;*尸<0.05，林代O.01vsModel第三部分TFMP對大鼠實驗性2型糖尿病的影響1實驗材料1.1實驗動物健康Wistar大鼠，雄性，體重230290g，由吉林大學基礎醫(yī)學院動物實驗中心提供，質(zhì)量合格證號SCXK-(吉)2003-0001。1.2藥品與試劑鏈脲佐菌素美國Sigma化學公司批號:20070512二甲雙胍滅津太平洋制藥有限公司批號:070416膽固醇上海新興化工研究所批號:060228丙硫氧嘧啶上海復星朝暉藥業(yè)有限公司批號:070602吐溫-80天津市昆達工貿(mào)有限公司批號:0703171，2-丙二醇天津市博迪化工有限公司批號:20061003戊巴比妥鈉中國上海批號:060612TC測試盒溫州津瑪生物科技有限公司批號:2007090384HDL測試盒溫州津瑪生物科技有限公司批號:2007080011LDL測試盒溫州津瑪生物科技有限公司批號:2007080160TG測試盒溫州津瑪生物科技有限公司批號:2007090383肝糖原測試盒南京建成生物研究所批號:20070924SOD測試盒南京建成生物研究所批號:20071122MDA測試盒南京建成生物研究所批號:20071121iL-1e放免測試盒解放軍總醫(yī)院科技放免所批號:20071130IL-6放免測試盒解放軍總醫(yī)院科技放免所批號:20071130TNF-a放免測試盒解放軍總醫(yī)院科技放免所批號:20071130INS放免測試盒解放軍總醫(yī)院科技放免所批號:20071130C肽放免測試盒解放軍總醫(yī)院科技放免所批號:200711301.3主要儀器血糖儀優(yōu)克糖優(yōu)克糖血糖試紙惠基生物科技股份有限公司LDZ5-2型普通離心機北京醫(yī)用離心機廠DR-HW-1電熱恒溫水溫賴北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠7202B型可見分光光度計尤尼柯(上海)儀器有限公司GAMMAmaticII型r計數(shù)器瑞士K0NTR0N公司QL-901Vortex混懸器海門市其林貝爾儀器制造2.實驗方法2.1藥物配制脂肪乳配方豬油25%，膽固醇1%，丙硫氧嘧啶1%，吐溫-8025%，1,2-內(nèi)二醇20%。脂肪乳制備取豬油25g放入200ml燒杯中，加熱至iO(TC，加入25ml吐溫_80，制成油相。另一燒杯中加入30ml蒸餾水和20ml1，2-丙二醇加熱，制成水相。然后將水相加入油相，充分混勻，即制成脂肪乳劑。鏈脲佐菌素(STZ)，臨用時以O.1mol/L，PH4.2檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液新鮮配制成1%的STZ溶液。將TFMP用0.5%CMC-Na配成0.7%、0.35%的溶液，二甲雙胍在研缽內(nèi)用0.5%CMC-Na配成O.7%的溶液。2.2動物造模將250只Wistar大鼠隨機分為正常組和模型組，正常組大鼠給予蒸餾水10mi/kg，模型組大鼠在正常飲食基礎上按10ml/kg灌胃(ig)給脂肪乳劑，iO日后，正常組和模型組隨機取12只大鼠尾靜脈取血檢測血清TC、TG、FFA含量。然后，各組動物禁食不禁水12小時，正常組舌下iv0.lmol/L，WW.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，模型組舌下ivSTZ30mg/kg，藥后4小時ig給模型組大鼠25。/。葡萄糖溶液避免低血糖反應，72h后從造模大鼠中選取空腹血糖值〉11.lmmol/L的大鼠為2型糖尿病模型大鼠。2.3分組及給藥方法將2型糖尿病模型大鼠按血糖和體重隨機分為ll組，每組15只，g口TFMP1大、中、小劑量組、TFMP2大、中、小劑量組、TFMP3大、中、小劑量組、二甲雙胍組及模型對照組。具體給藥方案為正常對照組給予0.5%CMC-Na模型對照組給予0.5%CMC-Na二甲雙胍組TFMP1小劑量組TFMP1中劑量組TFMP1大劑量組TFMP2小劑量組TFMP2中劑量組TFMP2大劑量組TFMP3小劑量組TFMP3中劑量組TFMP3大劑量組給予二甲雙胍70mg/kg給予TFMP17.5mg/kg給予TFMP35mg/kg給予TFMP70mg/kg給予TFMP17.5mg/kg給予TFMP35mg/kg給予TFMP70mg/kg給予TFMP17.5mg/kg給予TFMP35mg/kg給予TFMP70mg/kg各組動物按照上述方案ig給藥，連續(xù)4周。2型糖尿病大鼠ig給脂肪乳10ml/kg，每3日給藥1次。每周斷尾取血，用血糖儀測定空腹血糖值一次，以實測值或變化百分率進行組間比較。各組存活動物于第四周最后1次給藥前禁食不禁水12h，測定空腹血糖值，ig給藥，藥后lh腹腔注射3。/。戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉，腹主動脈采血，分離血清，進行各種生化指標和放免指標的測定。采集各鼠同一部位肝臟，測定肝糖原含量。采集各鼠胰腺，10%甲醛固定。2.4觀測指標及測定方法2.4.1—般狀態(tài)觀察監(jiān)測實驗過程中空白組及糖尿病各組大鼠的一般狀態(tài)、體重、攝食及攝水等變化，并記錄各組大鼠每日的攝食攝水量。2.4.2血糖和肝糖元的測定測血糖前夜，各組大鼠禁食不禁水12h，次日斷尾取血，用血糖儀和優(yōu)克糖試紙測定空腹血糖值，每周1次。給藥第28日采集各鼠同一部位肝臟，按照肝糖元試劑盒說明書測定肝糖原含量。2.4.3糖尿病相關的氧化因子的測定腹主動脈采血約6ml，注入干凈的試管內(nèi)，4°C，2000rpm離心10min，分離血清，按相應的試劑盒說明書要求嚴格操作，一部分血清用于測定血清中TC、TG、HDL、LDL、SOD、MDA含量；另外一部分血清用放射免疫分析方法測定IL-10、IL-6、TNF-ct、INS、C肽含量，以HomaModel方法計算ISI和胰島素抵抗指數(shù)(Homa-IR)。2.4.4胰島細胞形態(tài)學觀察采集各鼠胰腺，10%甲醛固定，作免疫組化，進行胰島細胞的形態(tài)學觀察。13.統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)以均數(shù)土標準差±S)表示，計量資料進行組間t檢驗。4.實驗結果4.1高脂飲食對正常大鼠血脂的影響與正常組比較，模型組大鼠連續(xù)ig脂肪乳劑10日后出現(xiàn)血脂代謝紊亂TC、TG、FFA含量均顯著增高(代O.Ol)，結果見Tab.3。Tah.3.Effectofhighlyfattedfoodonserumlipidinnormalrats(X士5",n=12)GroupTC(mmol/L)TG(mmol/L)FFA—ol/L)Control1.59±0.260.64±0.110.74±0.31Model1.79±0.29*0.80±0.16#1.22±0.34**'代O.05，**代0.01vscontrol4.2TFMP對T2DM大鼠FBG及肝糖原的影響在模型組大鼠出現(xiàn)血脂代謝紊亂的基礎上舌下iv30mg/kgSTZ后，模型對照組大鼠第0、1、2、3、4周血糖值與正常對照組相比均顯著升高(代O.Ol)，第4周肝糖原含量與正常對照組相比明顯降低(代0.05)，表明大鼠T2DM模型建立成功。與模型對照組比較，TFMP1、TFMP2及TFMP335、70mg/kg劑量組及二甲雙胍組于藥后第3、4周FBG均明顯降低(代0.05或代O.01)，第4周肝糖原含量明顯升高(代0.05或代0.01)，提示TFMP1、TFMP2及TFMP3可顯著改善T2DM大鼠的高血糖癥狀，提高肝糖原含量，見Tab.4及Tab.5。Tab.4.EffectofTFMPonbloodglucoseinT2DMratsd±S)Bloodglucosecontentaftertreated(mmol/UGroup-0W1W2W3W4WNormal6.34±0.475.09±0.425.94±0.505.91±0.495.05±0.30Model23.44±4.89"20,33±7.69s*23.57±7.37**22.16±4.8420.27±4.24*sTFMP117.5mg/kg23.46±4.4219.28±7.6319.94±4.9718.67±5.7919.46±5.7635mg/kg22.61±3.9817.50±5.0019.77±2.1616.45±4.50*15.17±2.54*70mg/kg24.18±4.0416.20±3.5317.60±3.2715.16±3.ll林14.92±5.15*TFMP217.5mg/kg23.56±5.1818.89±5.2418.26±5.2618.11±5.3418.57±5.8235mg/kg24.37±4.2716.27±6.7217.07±5.1816.15±4.87*15.87±3.16*70mg/kg23.49±3.6716.01±4.5816.25±6.2115.04±3.24林15.18±5.36*TFMP317.5mg/kg24.06±5.0217.85±4.2917.97土5.1817.56±5.9817.21±5.3735mg/kg23.58±4.2417.14±5.2716.88±5.3515.42±3.28氺*15.21±3.04氺70mg/kg22.96±3.7816.47±4.6717.26±5.2515.01±3.17氺*14.95±4.98*Metformin70mg/kg24.68±5.8515.22±6.3414.19±5,36**14,73±5.27林14.89±3.37**"代O.05，*#代0.01vsnormal;*代0.05，**代0.01vsmodelTab.5.EffectofTFMPonliverglycogencontentinT2DMrats(7±<S)GroupDose(mg/kg)liverglucogen(mg/gliver)Normal—10.01±2.36DiabetesModel一7.77±2.09ttT匿l17.59.31±2.47359.92±1.89*709.94±2.00*TFMP217.59.28±2.02359.87±1.77*709.99±1.96*TFMP317.59.06±1.68359.97±1.58*7010.02±2.32*Metformin7010.51±1.89***代0.05vsno服l;*代0.05，林代O.01vsmodel4.3TFMP對T2DM大鼠血脂及脂代謝的影響與正常組比較，模型對照組TG、TC、LDL-C含量均顯著升高(代O.05或代O.01)，HDL-C含量明顯下降(代O.01);與模型對照組比較，TFMP1、TFMP2及TFMP370mg/kg劑量組的TC、TG及LDL-C含量均顯著下降，而HDL-C含量明顯上升(代O.05或代0.01);TFMP1、TFMP2及TFMP335mg/kg組的TC含量顯著下降，HDL-C含量明顯上升(代().05)，表明TFMP可改善T2DM大鼠的血脂代謝紊亂。結果見Tab.6。Tab.6.EffectofTFMPonserumlipidinT2DMrats(X±S)TCTGHDL-CLDL-CGroup(醒ol/L)(mmol/U(mmol/L)(隱ol/L)Normal1.74±0.390.70±0.250.98±0.260.66±0.33Model2.48±0,60#*1.16±0.44*0.68±0.19#*1.26±0.55#TFMPl17.5mg/kg2.23±0.341.02±0.370.82±0.321.12±0.4235mg/kg2.00±0.35*0.82±0.370.92±0.25*0.93±0.2970mg/kg1.90±0.22氺*0.75±0.21*0.94±0.28*0.83±0.29*TFMP217.5mg/kg2.30±0.571.13±0.480.85±0.381.12±0.4235mg/kg2.06±0.30*0.89±0.310.93±0.27*0.93±0.2970mg/kg1.98±0.48*0.77±0.25*0.96±0.30*0.83±0.29*TFMP317.5mg/kg2.18±0.621.09±0.290.79±0.411.15±0.4735mg/kg2.10±0.25*0.93±0.320.90±0.450.98±0.3170mg/kg1.87±0.27承*0.73±0.28*0.93±0.24*0.80±0.25*Metformin70mg/kg1.92±0.30*0.74±0.26*0.95±0.27*0.76±0.32*匕代O.05，"#代0.01vsnormal;*代0.05，林代O.01vsmodel4.4TFMP對T2DM大鼠胰島素分泌功能及胰島素抵抗的影響與正常組相比，模型對照組血清中胰島素和C-肽含量及胰島素分泌指數(shù)ISI顯著下降(代O.Ol)，Homa-IR明顯升高(代O.01);與模型對照組比較，二甲雙胍組和TFMP1、TFMP2及TFMP370mg/kg劑量組的胰島素和C-肽含量及ISI顯著升高(代O.05或代0.01)，Homa-IR明顯降低(代O.05或代O.01)，TFMP1、TFMP2及TFMP335mg/kg劑量組的C-肽含量及ISI顯著升高(代O.05)，Homa-IR明顯降低(代O.05)，說明TFMP能改善T2DM胰島e細胞功能，促進胰島素分泌，增強組織對胰島素的敏感性，改善IR。結果見Tab.7。Tab.7.EffectofTFMPonIns，C-p印tide，Homa-IRandISIinT2DMrats(7±5)GroupIns(yIU/ml)C-peptide(ng/ml)Hotna-IRISINormal29.30±9.590.49±0.156.35±0.48394.70±156.05Model7.87±2.83能0.32±0.089s*20.62±4.25"9.91±3.68ssTFMPl17.5mg/kg10.33±3.580.35±0.1519.92±5.8114.01±5.2535mg/kg9.78±3.860.43±0.16.77±2.16.22±8.20*70mg/kg12.65±4.79*0.46±0.16*15.48±5.19*27.34±18.56*TFMP217.5mg/kg10.47±3.660.37±0.3418.87±4.5314.04±4.6635mg/kg10.92±4.030.45±0.23*16.12±2.58*16.25±7.28*70mg/kg13.14±4.55*0.44±0.13*15.93±4.85*26.30±15.59**TFMP317.5mg/kg10.68土3.790.33±0.4219.15±5.5714.09±5.3335mg/kg10.55±3.430.46±0.25*16.52±3.16.76±6.46*70mg/kg12.98±4.26*0.48±0.24*15.07±4.52*25.30±16.56**Metformin70mg/kg12.95土3.22**0.49±0.IO林15.46±3.27林26.74±16.31**代O.01vsnormal;*代0.05，**代0.01vsmodel4.5TFMP對T2DM大鼠血清SOD活性及MDA含量的影響與正常組相比，模型對照組SOD活性明顯降低(代O.Ol)，MDA含量明顯增加(代O.Ol);與模型對照組比較，TFMP1、TFMP2及TFMP335、70mg/kg劑量組及二甲雙胍組的SOD活性明顯提高(代O.05或代O.Ol)，TFMP1、TFMP2及TFMP370mg/kg劑量組及二甲雙胍組的MDA含量明顯降低(代0.05)，結果見Tab.8。Tab.8EffectofTFMPonSODactivityandMDAcontentinT2DMrats(^±5)GroupDose(mg/kg)S0D(U/ml)MDA(腸l/ml)Nornal_338.57±50.8912.68±3.72DiabetesModel—245.96±74.8(T22.59±3.45賴TFMPl17.5300.27±50.7421.20±5.1935318.29±40.30*19.71±3.5370328.32±39.72*18,29±3.43*TFMP217.5297.68±61.3221.57±4.8835324.56±42.48*22.04±5.1870325.39±41.76*18.04±3.55承TFMP317.5312.36±52.3521.40±5.3335320.41±45.19.89±4.1370331.30±31.54林18.16±3.27*Metformin70323.95±29.73**18.27±4.81*賴代O.01vs證mal;*代0.05,林代O.01vsmodel4.6TFMP對T2DM大鼠血清IL-lp、IL-6、TNF-a的影響與正常組相比，模型對照組IL-1e、IL-6及TNF-a含量均明顯升高(P〈0.05或P〈0.01);與模型對照組比較，二甲雙胍組及TFMP1、TFMP2及TFMP335、70mg/kg劑量組的IL-1e含量均明顯降低(P〈0.05或P〈0.01);TFMP1、TFMP2及TFMP370mg/kg劑量組的IL-6含量明顯下降(P<0.05);TFMP1、TFMP2及TFMP3三個劑量組的TNF-a含量有下降趨勢，但無顯著性差異(ZM).05)。結果見Tab.9。Tab.9.EffectofTFMPonIL-lp、IL-6andTNF-ainT2DMrats(亍±。GroupIL-10(ng/ml)IL-6(pg/mL)TNF-a(ng/ml)Normal0.086土O.046132.95±22.081.405±0.399DiabetesModel0.164±0.07M179.58±47.54s1.965±0.520sTFMPl17.5mg/kg0.141±0.051157.62±34.691.783±0.44935mg/kg0.105±0.050*152.33±31.321.774±0.35870mg/kg0.092±0.037**143.21±19.49*1.637土0.276TFMP217.5mg/kg0.146±0.042159.61±37.221.769±0.53135mg/kg0.110±0.043*158.41±43.671.712±0.13870mg/kg0.090±0.035**140.65±21.09*1.572±0.358TFMP317.5mg/kg0.150±0.056161.65±28.321.641±0.56835mg/kg0.108±0.042*155.37±36.471.625±0.45770mg/kg0.094±0.032**139.77±24.13*1.605±0.376Metformin70mg/kg0.101±0.054*153.43±35.251.879±0.396:代0.05，**代0.01vsnormal;*代0.05，**代0.01vsmodel4.7胰島細胞形態(tài)學觀察與正常對照組比較，模型組胰島數(shù)目減少，胰島結構失去完整性，胰島細胞分散，分布不均勻，胰島內(nèi)P細胞數(shù)明顯減少；與模型對照組比較，二甲雙胍組及TFMP1、TFMP2、TFMP3組的胰島數(shù)目增多，胰島結構趨向完整，胰島內(nèi)0細胞數(shù)增多，對胰島的損傷有較好的改善作用。結論1)TFMP對小鼠腎上腺素所致高血糖有明顯的對抗作用，于藥后60min開始起效持續(xù)到90min。2)TFMP對小鼠葡萄糖所致高血糖有一定的對抗作用，但無顯著性差異。3)TFMP可以明顯降低T2DM大鼠的血糖，并于給藥后第3周開始血糖值降低最為顯著；并且能升高T2DM大鼠肝糖元的含量。4)TFMP可以改善T2DM大鼠的脂代謝紊亂。5)TFMP可以升高T2DM大鼠血清中C-肽水平和胰島素含量，提高胰島P細胞分泌指數(shù)，降低胰島素抵抗指數(shù)，改善IR。6)TFMP可以降低T2匿大鼠的血清MDA含量，升高SOD活性。7)TFMP可以降低T2DM大鼠的血清IL-1P、IL-6、TNF-a含量，減輕炎性反應。證明九里香葉總黃酮對糖尿病及其并發(fā)癥具有顯著的預防與治療作用。圖l胰島P細胞形態(tài)學免疫組化分析權利要求1、九里香葉總黃酮在制備治療糖尿病藥物中的應用。2、權利要求1所述的九里香葉總黃酮，其特征在于其中至少含有5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮中的兩種或兩種以上。3、權利要求1所述的九里香葉總黃酮，其特征在于其中5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黃酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3'，4'-三甲氧基黃酮的含量之和大于50%。4、權利要求1所述的九里香葉總黃酮，其特征在于其中5，7，3'，4'-四甲氧基黃酮和5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黃酮的含量之和大于50%。5、九里香葉總黃酮與化學藥或中藥或天然藥物組成的治療糖尿病的復方藥物。全文摘要本發(fā)明公開了九里香葉總黃酮在制備治療糖尿病藥物中的應用。從中藥九里香葉中提取分離的九里香葉總黃酮，主要含有5，7，3′，4′-四甲氧基黃酮、5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黃酮、5，6，7，3′，4′-五甲氧基黃酮、5，6，7，3′，4′，5′-六甲氧基黃酮、7-羥基-5，3′，4′-三甲氧基黃酮。動物實驗結果表明，九里香葉總黃酮能夠明顯降低T2DM大鼠的血糖，改善T2DM大鼠的脂代謝紊亂，升高T2DM大鼠血清中C-肽水平和胰島素含量，提高胰島β細胞分泌指數(shù)，降低胰島素抵抗指數(shù)，改善IR，降低T2DM大鼠的血清MDA含量，升高SOD活性，降低T2DM大鼠的血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量。證明九里香葉總黃酮對糖尿病具有顯著的治療作用。文檔編號A61K36/75GK101601760SQ200910117940公開日2009年12月16日申請日期2009年2月22日優(yōu)先權日2008年4月8日發(fā)明者于曉風,曲紹春,李緒文,桂明玉,睢大員,金永日申請人:長春瑞德醫(yī)藥科技有限公司