專利名稱：：抑制人hRAD21基因表達的siRNA和表達質粒及其在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種特異性抑制人hRAD21基因表達的siRNA及該siRNA的表達質粒和它們在制備治療或預防與人hRAD21基因有關的腫瘤的藥物中的應用。本發(fā)明利用生物計算機信息技術從GenBank中獲得一組人hRAD21基因序列，并以RNA干擾技術為基礎，設計出一組能誘發(fā)hRAD21RNA干擾的siRNA，通過化學法合成或質粒載體表達一定量的siRNA,從而特異性抑制人hRAD21基因的表達。達到抑制腫瘤的發(fā)生和生長的目的。該siRNA及其表達質粒可用于制備治療端粒酶陰性和端粒酶抑制劑耐受的惡性腫瘤的特異性藥物。
背景技術：
：端粒(telomere)是染色體末端由DNA與調節(jié)蛋白組成的特殊復合體，具有防止染色體末端降解、融合而起到保護染色體完整性、維持細胞穩(wěn)定性的作用。端粒隨正常細胞的有絲分裂而逐漸縮短，至一定程度后發(fā)生凋亡，因此端粒被稱為細胞生命的時鐘。惡性腫瘤細胞必須維持一定的端粒長度才能達到持續(xù)分裂和生長的目的。約85%或稍多的癌細胞依靠端粒酶(Telomerase)來維持端粒長度和細胞永生。研究顯示，還有約15%的腫瘤細胞并不依賴端粒酶來維持端粒長度，這些細胞也具有無限分裂的能力，但卻不能檢測到端粒酶活性。學術界將這種端粒維持機制定義為端粒替代延長機制(Alternativelengtheningoftelomeres,ALT),或稱為不依賴端粒酶的生長旁路。不依賴端粒酶的ALT旁路的腫瘤細胞的端粒長度不一致，其末端重復序列長度變化范圍大(從<2kb到>20kb)，而且研究表明ALT的出現與己知癌基因、抑癌基因變異或致癌方式無關。人類ALT細胞的另一個重要特征是存在一種特殊的核蛋白復合體，稱為ALT相關的早幼粒細胞白血病(PML)小體，簡稱APB小體。APB小體由端粒DNA、端粒結合蛋白(如TRF1和TRF2)、PML小體以及一系列參與DNA重組與修復的蛋白組成。研究表明，APB小體僅在ALT細胞中出現，并為ALT細胞維持端粒長度提供了所需的功能分子和場所。惡性腫瘤的ALT旁路是端粒酶研究中的一個重要的未知問題和領域，是探討惡性腫瘤生物學特性和永生機制的重要基礎，也是開展以端粒酶為治療耙點的生物治療前乃至化療前需要了解的問題。端粒酶抑制劑是一類特異性強，毒性小的較理想的新一代抗腫瘤藥物，是最具前景的腫瘤治療方向之一。但是，端粒酶抑制劑對于端粒酶陰性的人類腫瘤是無效的，并且，研究證實，應用端粒酶抑制劑治療端粒酶陽性的腫瘤時會使部分端粒酶陽性的腫瘤激活ALT機制而產生端粒酶抑制劑逃避現象。因此，研究ALT旁路特異性抑制劑是對于治療端粒酶陰性的惡性腫瘤以及產生端粒酶抑制劑逃避的惡性腫瘤具有重要意義。本說明書的第一個目的是提供一種用于制備ALT旁路特異性抑制劑的分子靶點，即hRAD21基因和/或蛋白。本發(fā)明所述的hRAD21是指裂殖酵母RAD21基因的人類同源物，也稱為姐妹染色體蛋白1(SCC1)，是姐妹染色單體粘連復合物(cohesin)的成分之一。目前認為其功能是參與真核細胞有絲分裂過程中新復制的姐妹染色單體的有效分離以及DNA雙鏈斷裂損傷的重組修復過程。本發(fā)明通過對比ALT細胞系與端粒酶陽性細胞系中的RAD21的mRNA和蛋白水平的表達情況，證實了ALT腫瘤細胞中hRAD21基因和蛋白的表達顯著上調。本發(fā)明通過雙色免疫熒光共定位技術證實了hRAD21蛋白是人類ALT惡性腫瘤細胞中APB小體的組成成分，從而證實了hRAD21基因和/或蛋白是參與ALT機制的重要功能分子。本發(fā)明的第二個目的是提供一種特異性抑制hRAD21基因表達的si脂A。本發(fā)明的第三個目的是提供上述siRNA的表達質粒。本發(fā)明的第四個目的是提供上述siRNA或產生該siRNA的表達質粒在制備抗腫瘤藥物中的應用。
發(fā)明內容按照實施例1，本發(fā)明提供了一種用于制備ALT旁路特異性抑制劑的分子靶點，所述的分子靶點是指hRAD21基因和/或蛋白。本發(fā)明提供了一種特異性抑制hRAD21基因表達的雙鏈DNAoligos序列。所述的雙鏈DNAoligos序列如下所示1#:CACATGGGCTTTTTGGAT3，AGCTATCCAAAAAGCCCATGTGTTCGAGTGTATCTCTTGAATACACTCGAACACATGGGCGG2#:5'GATCCCGCTGATAGCCTTCAGCTACATTCAAGAGATGTAGCTGAAGGCTATCAGCTTTTTGGATTAGCTGAAGGCTATCAGCGG按照實施例2，本發(fā)明提供了上述的雙鏈DNAoligos序列的制備方法。按照實施例3，本發(fā)明還提供了上述siRNA的表達質粒的制備方法。所述的質粒具有以下基本結構啟動子；hRAD21編碼區(qū)；終止密碼；環(huán)狀雙鏈DNA分子。所述的啟動子為真核基因中可啟動產生小雙鏈RNA的序列，它是啟動下游基因表達的原件，可以是人的RNA聚合酶III的啟動子或人的Hl啟動子；所述的終止密碼為采用56個T作為終止編碼區(qū)合成的終止密碼序列；所述的環(huán)狀雙鏈DNA分子為任何真核質粒載體和/或病毒的介于編碼區(qū)和啟動子之間的DNA序列，含有質粒載體DNA的復制起始位點，或含有抗生素抗性基因；所述的任何真核質粒載體和/或病毒是pLuescriptSk、pcDNA3.0、pcDNA3.1、pMALC-2、Plncx、腺病毒、腺相關病毒或仙臺病毒。按照實施例4，本發(fā)明提供了本發(fā)明所制備的siRNA的表達質粒在治療端粒酶陰性惡性腫瘤中的應用。下面結合附圖和實施例詳細描述本發(fā)明，所述的實施例是用于描述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。圖l:hRAD21基因和蛋白在ALT細胞中過表達圖2:ALT細胞中hRAD21蛋白與TRF2蛋白共定位圖3:ALT細胞中hRAD21蛋白與PML蛋白共定位圖4:真核表達質粒圖譜(注藍色字體部分是被BamHI和HindII酶切去除的部分)圖5:實施例2提供的RNAi耙點對hRAD21基因，在蛋白水平有明顯knockdown作用圖6:siRNA質粒轉染后ALT腫瘤細胞發(fā)生凋亡，細胞周期大部分停滯于SG2期實施例實施例1:hRAD21基因和/或蛋白是惡性腫瘤細胞ALT機制的重要功能分子1.應用定量Real-TimePCR技術證實hRAD21基因在ALT細胞中過表達用TRIZOL—步法提取ALT+細胞系(ffl(M18、G292、U20S、Saos-2)和端粒酶陽性細胞系(LOVO、HELa、HT29)的總RNA，經紫外分光光度計測定A260/A280值,取2ugRNA作逆轉錄模板。逆轉錄體系為25u1，引物為oligo(dT)15用SuperscriptII逆轉錄酶(Invitrogen),反應按說明書進行。選擇ACTB作為校準基因，驗證RAD21基因在幾個樣品中表達豐度的變化。ACTB上游引物序列為5'-3'CATGTACGTTGCTATCCAGGC,下游引物序列為:5'-3'CTCCTTAATGTCACGCACGAT;hRAD21上游引物序列為5'-3'GAGCACCAGCAATCTGAATGA，下游引物序列為5'-3'AGGCCCACCCATTGATACATTAT。使用R。Che公司LightCyclerPCR儀(R。Che，型號PTC-225),試劑為Lightcycler-faststartDNAmasterSYBRgreenI(R°Che)。20ul實驗體系，llUcDNA模板，鎂離子濃度3mM，引物濃度0.25UM，dNTP200UM。擴增程序為95。C變性10min;95°C10s，60°C5s，72°C15s，重復45個循環(huán)；75。C至95。C繪制溶解曲線。結果如圖1A所示，ALT細胞系中的hRAD21的mRNA表達水平較端粒酶陽性細胞系顯著增高(P<0.01)2.應用Westernblot技術證實hRAD21蛋白在ALT細胞中過表達常規(guī)方法提取ALT+細胞系(HI0-118、G292、U20S、Saos-2)和端粒酶陽性細胞系(LOVO、HELa、HT29)以及端粒酶陰性人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的總蛋白，分別測定濃度。取80Pg蛋白加樣，6%SDS-PAGE膠上樣電泳(IIOV，90min)，考馬斯亮藍染色，轉膜電泳(恒壓60V，120mA,8小時，冰盒中)，脫脂牛奶封閉，一抗(鼠抗hRAD21，1:500)《C過夜雜交，二抗(1:4000)37'C孵育lh，用新配制的發(fā)光試劑檢測。應用/5-actin作為內參照。結果如圖1B、C所示，ALT細胞系中的hRAD21的蛋白表達水平較端粒酶陽性細胞系顯著增高(P〈0.01)3.應用免疫熒光共定位技術證實hRAD21蛋白是ALT細胞APB小體的組成成分ALT細胞(GM847,SaOS-2和WI38VA13/2RA)在蓋片上生長融合到95%100%時，從孵箱中取出，用預溫的1XPBS洗3次，每次10分鐘，4%的甲醛室溫固定20—30分鐘，1XPBS洗3次，每次10分鐘，0.2%TritonX—100透化2—5分鐘，1XPBS洗3次，每次10分鐘，5%BSA室溫封閉30分鐘，加兔抗人hRAD21抗體和鼠抗人TRF2或PML抗體4°C過夜，1XPBS洗3次，每次10分鐘，依次FITC或TexasRed標記的二抗(用1。/^BSA稀釋)30分鐘，閉光，1XPBS洗3次，每次10分鐘，95%甘油封片。用LeicaMicrosystems熒光顯微鏡觀察并拍照。用PHOTOSHOP軟件進行圖像處理。結果如圖2禾卩圖3所示，ALT細胞中hRAD21蛋白與TRF2禾卩PML蛋白共定位，證實hRAD21蛋白是APB小體的組成成分。實施例2:特異性抑制hRAD21基因表達的雙鏈DNAoligos序列的制備方法反應體系如表1所示表1:雙鏈DNAoligos序列反應體系<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>_ddH20_70ul_Total_100ul上述反應體系混勻，9(TC溫育4分鐘，7(TC溫育IO分鐘，緩慢冷卻至室溫。實施例3:hRAD21基因的siRNA的表達質粒的制備所用真核表達質粒圖譜如圖4所示。使用BamHI和HindIII進行酶切消化，酶切反應體系如表2所示。將該反應體系的反應物置于37。C，lh。于4'C進行12小時連接反應。連接反應體系如表3所示。用氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細胞。從于37"C培養(yǎng)16小時的新鮮平板中挑取一個單菌落，轉到一個含有100mlLB或SOB培養(yǎng)基的1L燒瓶中。于37'C劇烈振搖培養(yǎng)3小時(旋轉搖床，300轉/分)。在無菌條件下將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置IO分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至0°C。于4°C,以4000轉/分離心IO分鐘，回收細胞。倒出培養(yǎng)液，將管倒置l分鐘,使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。以10ml用冰預冷的O.lmol/LCaC12重懸每份沉淀，放置于冰浴上。于4。C,以4000轉/分離心10分鐘，回收細胞。倒出培養(yǎng)液，將管倒置l分鐘,使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預冷的O.lmol/LCaC12重懸每份細胞沉淀。將細胞分裝成小份，放于-7(TC凍存。轉化用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取20(^1轉移到無菌的微量離心管中，每管加2pl連接液，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30分鐘。將管放到預加溫到42。C的循環(huán)水浴中放好的試管架上，恰恰放置90秒，不要搖動試管?？焖賹⒐苻D移到冰浴中，使細胞冷卻1一2分鐘。每管加800WS。C培養(yǎng)基。用水浴將培養(yǎng)基加溫至37"，然后將管轉移到37'C搖床上，溫育45分鐘使細菌復蘇。將150pi已轉化的感受態(tài)細胞轉移到含20mmo1/LMgS04和Amp抗性的SOB瓊脂培養(yǎng)基上。將平板置于室溫直至液體被吸收。倒置平皿，于37'C培養(yǎng)，16小時。在293T細胞中，采用WesternBlot的實驗方法，在蛋白水平鑒定目的基因在實施例2提供的RNAi靶點干擾情況下的敲減效率。轉染方法針對內源表達的蛋白質，采用Invitrogen的Lipofectin2000Kit進行不同靶點化學合成siRNA的轉染導入，檢測不同靶點RNAi的敲減效率。結果如圖5所示，實施例2提供的RNAi靶點對hRAD21基因，在蛋白水平有明顯kn"Ckdown作用。每次實驗針對每個RNAi靶點設計一對重復，并平行設定轉染組和陰性對照RNA干擾的兩組對照實驗。同時設置了陽性對照GAPDH的RNA干擾實驗組,用來監(jiān)測整個細胞培養(yǎng),轉染和RNA干擾實驗體系的效率。表2:酶切反應體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例4:應用實施例3制備的表達質粒對ALT腫瘤細胞增殖的抑制作用常規(guī)方法培養(yǎng)ALT惡性腫瘤細胞(G292),棄去細胞液，力Q2mlPBS洗一次。加1ml胰酶消化1-2分鐘。棄去胰酶，加3-4mlDMEM(不含血清)吹打均勻。將細胞滴加于6孔培養(yǎng)板中(每孔2ml)，培養(yǎng)24小時后，細胞融合度控制在7080%。配制工作母液在2.5nmol的雙鏈siRNA中加入125pilXUniversalBuffer,得到濃度為20的si頭A母液，工作母液于9(TC保溫2分鐘，自然冷卻至室溫后置于4"C過夜備用。對于6孔板的每個孔，用1.34嗎si脂A雙鏈(IOOpmol)。把20M的siRNA雙鏈與23^1DMEM混合。將LipofectAMINE2000試劑輕柔搖勻，取LipofectAMINE2000試劑在另一管中與245^1DMEM混合，在室溫下溫育5分鐘。把稀釋后的siRNA與稀釋后的LipofectAMINE2000進行混合，輕輕地顛倒混勻。在室溫下溫育20分鐘，以便形成siRNA與LipofectAMINE2000稀釋液的轉染復合物。把siRNA與LipofectAMINE2000的混合液加入培養(yǎng)細胞，輕柔前后推搖培養(yǎng)板以混勻液體。然后將培養(yǎng)板送入細胞培養(yǎng)箱。用常規(guī)方法進行流式細胞儀檢測。結果如圖6所示siRNA質粒轉染后腫瘤細胞發(fā)生凋亡，細胞周期大部分停滯于SG2期。序列表<110>首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院^20抑制人hRAD21基因表達的siRNA和表達質粒及其在制藥中的應用<160〉8<170>PatentlnVersion2.1<210>1<211>62<212>DNA<213>人工序列<220〉<223〉雙鏈DNAoligos序列一正向鏈序列<400>1gatcccgcccatgtgttcgagtgtattcaagagatacactcgaacacatgggc籠tgg60at62<210>2<211〉62<212>DNA<213>人工序列<220><223>雙鏈DNAoligos序列一反向鏈序列<400>2agctatccaaaaagcccatgtgttcgagtgtatctcttgaatacactcgaacacatgggc60gg"<210>3<211>64<212>DNA<213〉人工序列<220><223>雙鏈DNAoligos序列一正向鏈序列<400>3gatcccgctgatagccttcagctacattcaagagatgtagctgaaggctatcagcttttt60ggat64<210〉4<211>64<212>DNA<213>人工序列<220><223〉雙鏈DNAoligos序列一反向鏈序列<400>43gctetcc3a3犯gctgatsgccttcsgct3C3tctcttga噸t昭ctgaaggct3tca60gcgg64<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220〉<223〉ACTB上游引物序列<■>5catgtacgttgctatccaggc21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>ACTB下游引物序列<400>6ctccttaatgtcacgcacgat21<210>7<211>21<212>DNA<213〉人工序列<220><223>hRAD21上游引物序列<400>7gagcaccagcaatctgaatga21<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220〉<223〉hRAD21下游引物序列<400>8aggcccacccattgatacattat2權利要求1.靶向人hRAD21基因和/或蛋白的抑制劑在制備用于治療端粒酶陰性惡性腫瘤和/或端粒酶抑制劑耐受的惡性腫瘤的藥物中的應用。2.根據權利要求l所述的人hRAD21基因和/或蛋白的抑制劑，其特征在于該抑制劑是一種特異性抑制人hRAD21基因表達的雙鏈DNAoligos序列，其特征在于該雙鏈DNAoligos序列是下列兩種雙鏈DNAoligos序列中的一種或兩種，其堿基序列如下1#5'GATCCCGCCCATGTGTTCGAGTGTATTCAAGAGATACACTCGAACACATGGGCTTTTTGGAT3'AGCTATCCAAAAAGCCCATGTGTTCGAGTGTATCTCTTGAATACACTCGAACACATGGGCGG2#:5'GATCCCGCTGATAGCCTTCAGCTACATTCAAGAGATGTAGCTGAAGGCTATCAGCTTTTTGGATTAGCTGAAGGCTATCAGCGG3.根據權利要求l，2所述的人hRAD21基因和/或蛋白的抑制劑，其特征在于該抑制劑是一種可以產生特異性抑制人hRAD21基因表達的雙鏈DNAoligos序列的RNA干擾質粒，其特征在于該質粒具有以下基本結構啟動子；hRAD21編碼區(qū)；終止密碼；環(huán)狀雙鏈DNA分子。所述的啟動子為真核基因中可啟動產生小雙鏈RNA的序列，它是啟動下游基因表達的原件；所述的hRAD21編碼區(qū)為表達權利要求1所述的雙鏈DNAoligos序列的編碼區(qū)；所述的終止密碼為采用56個T作為終止編碼區(qū)合成的終止密碼序列；所述的環(huán)狀雙鏈DNA分子為任何真核質粒載體和/或病毒的介于編碼區(qū)和啟動子之間的DNA序列，含有質粒載體DNA的復制起始位點，或含有抗生素抗性基因。4.根據權利要求3所述的質粒，其特征在于啟動子可以是人的RNA聚合酶III的啟動子或人的HI啟動子。5.根據權利要求3所述的質粒，其特征在于其DNA序列中所述的任何真核質粒載體和/或病毒是pLuescriptSk、pcDNA3.0、pcDNA3.1、pMALC-2、Plncx、腺病毒、腺相關病毒或仙臺病毒。6.權利要求2所述的雙鏈DNAoligos序列在制備抗腫瘤藥物中的應用。7.權利要求3、4、5所述的質粒在制備抗腫瘤藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及一種特異性抑制人hRAD21基因表達的siRNA及該siRNA的表達質粒和它們在制備治療或預防與人hRAD21基因有關的腫瘤的藥物中的應用。本發(fā)明利用生物計算機信息技術從GenBank中獲得一組人hRAD21基因序列，并以RNA干擾技術為基礎，設計出一組能誘發(fā)hRAD21RNA干擾的siRNA，通過化學法合成或質粒載體表達一定量的siRNA，從而特異性抑制人hRAD21基因的表達。達到抑制腫瘤的發(fā)生和生長的目的。該siRNA及其表達質?？捎糜谥苽渲委煻肆Ｃ戈幮缘膼盒阅[瘤的特異性藥物。文檔編號A61K48/00GK101574528SQ20091011975公開日2009年11月11日申請日期2009年3月26日優(yōu)先權日2009年3月26日發(fā)明者王振軍,博趙申請人:首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院