專利名稱：：人源化單抗Hu-ScFv18的輕、重鏈可變區(qū)基因和其編碼多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗HAbl8G/CD147的人源化單抗Hu-ScFv18的輕、重鏈可變區(qū)基因和由所述基因編碼的多肽，以及所述基因和多肽在制備用于診斷和治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康、威脅人類生命的主要?dú)⑹种弧?jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)年度報(bào)道，2005年全球有760萬(wàn)入死于惡性腫瘤(癌癥)。近年來(lái)，癌癥的病因與臨床診治研究有較大的進(jìn)展，但癌癥的死亡率仍然沒(méi)有得到有效的遏制。癌癥是一種基因病，其發(fā)生與演進(jìn)涉及多個(gè)基因并經(jīng)過(guò)多個(gè)不同的階段，與細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、血管生成和轉(zhuǎn)移相關(guān)的多種途徑的調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)。一方面臨床應(yīng)用傳統(tǒng)的癌組織學(xué)診斷方法，用癌組織分級(jí)和類型、癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)分級(jí)體系等指標(biāo)，無(wú)法準(zhǔn)確地進(jìn)行早期診斷，難以評(píng)估臨床預(yù)后，因此，對(duì)指導(dǎo)臨床制定處理方案具有很大的局限性.另一方面，傳統(tǒng)的癌手術(shù)，放療，化療也不能滿足臨床的需要。因此加快加強(qiáng)研究癌的診斷和治療一直是人們迫切的要求.自1975年Kohler和Milstein創(chuàng)建B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)以來(lái)，各種單克隆抗體(McAb)相繼出現(xiàn)，它們?cè)诩膊≡\治的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面發(fā)揮了積極的作用，其中以單抗的研制為各種難治性腫瘤帶來(lái)了新的希望。正是由于抗體藥物特異性高，可針對(duì)特定靶點(diǎn)制備，應(yīng)用于治療自身免疫性疾病、心血管病、傳染病、炎癥，特別是腫瘤治療，已成為當(dāng)前全球生物藥物領(lǐng)域研發(fā)的熱點(diǎn)，年銷(xiāo)售額超過(guò)百億美元的"重磅炸彈藥物"。至2007年美國(guó)FDA先后批準(zhǔn)26種抗體藥物上巿，有14個(gè)用于治療結(jié)腸癌、乳腺癌、淋巴癌等實(shí)體腫瘤。如治療淋巴瘤的抗體藥物利妥昔單抗(rituximab)，單藥治療總反應(yīng)率為50%，聯(lián)合化療有效率高達(dá)80%以上。抗體藥物也可被用作傳遞藥物的工具增強(qiáng)放化療的療效，很可能成為靶向和療效最強(qiáng)的腫瘤特異性生物藥物。與此同時(shí)，我國(guó)囯家藥品監(jiān)督管理局也加強(qiáng)了抗體藥物審批力度，已有11種抗體藥物批準(zhǔn)上巿。尤其值得注意的是我國(guó)已有一些具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗體藥物正在進(jìn)行臨床或者完成臨床研究，等待批準(zhǔn)上巿。目前，鼠源性單克隆抗體將逐漸被人源化抗體所替代，其主要原因是鼠源性單克隆抗體與人補(bǔ)體成分結(jié)合能力低，CDC作用相應(yīng)較弱，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力較弱；它與NK等免疫細(xì)胞表面Fc受體親和力弱，介導(dǎo)的ADCC作用較弱；鼠源抗體在人血循環(huán)中的半衰期短，它發(fā)揮ADCC與CDC作用的時(shí)間較短；鼠單克隆抗體具有免疫原性，宿主易產(chǎn)生抗抗體反應(yīng)(AAR)引起過(guò)敏反應(yīng)。這樣就嚴(yán)重阻礙了鼠單克隆抗體的進(jìn)一步應(yīng)用。為了解決這些問(wèn)題，人源化抗體顯示出了巨大的優(yōu)勢(shì)。目前，對(duì)鼠抗體人源化的構(gòu)建方法即鼠抗體的人源化改造主要方法包括嵌合抗體、表面重塑抗體、重構(gòu)抗體。嵌合抗體利用DM重組技術(shù)將鼠單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)出人鼠嵌合抗體，其人源化程度達(dá)到70%左右，完整地保留了異源單抗的可變區(qū)，最大限度地保持了其親和活性，降低了免疫原性。但由于人鼠嵌合抗^^仍然保留了30X的鼠源性，可誘發(fā)人抗小鼠反應(yīng)HAMA。表面重塑抗體對(duì)鼠抗體表面氨基酸殘基進(jìn)行人源化改造。該方法的原則是僅替換與人抗體SAR差別明顯的區(qū)域，在維持抗體活性并兼顧減少異源性基礎(chǔ)上選用與人抗體表面殘基相似的氨基酸替換；另外，所替換的區(qū)段不應(yīng)過(guò)多，對(duì)于影響側(cè)鏈大小、電荷、疏水性，或可能形成氫鍵從而影響到抗體互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)構(gòu)象的殘基盡量不替換。重構(gòu)抗體由異源抗體中與抗原結(jié)合相關(guān)的殘基與人抗體重新拼接構(gòu)建的，包括CDR區(qū)移植，部分CDR移植和特定決定區(qū)(SDR)轉(zhuǎn)移。CDR移植后的抗體也稱改型抗體。Jone等于1986年在Nature上報(bào)道了他們關(guān)于CDR移植抗體的研究成果，將鼠單抗B1-8單抗V區(qū)中的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列取代與其自身框架區(qū)(FR)最為相似的人源抗體中相應(yīng)CDR序列，開(kāi)創(chuàng)了這種新方法。Zenapax(Daclizumab)是美國(guó)FDA批準(zhǔn)的用該法產(chǎn)生使用于急性排異反應(yīng)或頑固性哮喘的人源化單抗.在此基礎(chǔ)上，Padlan等發(fā)現(xiàn)抗原抗體的相互作用主要由CDR區(qū)20%-334的氨基酸殘基完成，這些區(qū)域在各個(gè)抗體之間差異很大，被稱為特異性決定簇殘基(specifitydeterminingresidues,SDRs)，與CDR移植相比，這種方法能最大限度地減少抗體的鼠源序列，并將序列移植對(duì)抗體活性的影響降到最低。另外是全人源化抗體完全人抗體的形成始于二十世紀(jì)九十年代，目前獲得全人源化抗體方法有抗體庫(kù)篩選技術(shù)、基因工程小鼠制備全人抗體、轉(zhuǎn)染色體牛等。如用于類風(fēng)濕疾病的adali咖mab和結(jié)腸癌治療的panitumumab即為全人抗體。除上述提及方法外，此外我們還可見(jiàn)到框架區(qū)重塑(frameworkpatching),超級(jí)人源化(Superhumanization)等方法。這些方法大都和上述提及的方法類似。如超級(jí)人源化法和SDR移植法類似，即保留鼠源抗體的正則結(jié)構(gòu)(canonicalstructures),而該結(jié)構(gòu)對(duì)于維持親本抗體的空間結(jié)構(gòu)有著重要的作用。Tan等最先比較了人源和鼠源抗體，對(duì)可變區(qū)正則結(jié)構(gòu)相近或相同的抗體，完全移植到相應(yīng)的人源框架區(qū)，進(jìn)一步降低了待改造抗體的免疫原性，功能實(shí)驗(yàn)表明，這種方法也能很好使抗原結(jié)合活性保持.2004年-2006年美國(guó)食品食品藥品管理局(FDA)和歐洲藥品評(píng)估局(EMEA)共批準(zhǔn)上市的單抗藥物中，90%以上是人源化抗體。在疾病乾向治療的觀念曰益突顯的今天，抗體藥物的應(yīng)用范圍正逐漸超出腫瘤和免疫性疾??；另外，隨著新的疾病相關(guān)靶抗原被發(fā)現(xiàn)，治療性抗體必將發(fā)揮越來(lái)越重要的作用；而抗體的人源化也會(huì)為其進(jìn)一步的臨床上推廣應(yīng)用掃除障礙，即對(duì)抗體進(jìn)行人源化改造，一方面保持了抗體識(shí)別抗原的能力.另一方面，降低了鼠源性抗體的免疫原性，減少了人體針對(duì)鼠源性抗體產(chǎn)生的"人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)反應(yīng)"，從而相應(yīng)的提高了抗體在臨床應(yīng)用的安全性。目前在惡性腫瘤的診斷方面，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的生物診斷試劑主要分為4類l.血清癌標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒。2.放射免疫顯像試劑盒。3.免疫組織化學(xué)試劑盒。4.基因診斷試劑盒。血清學(xué)癌標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒主要包括AFP(甲胎蛋白)的檢測(cè)，用于診斷肝癌及睪丸癌，CEA(癌胚抗原)的檢測(cè)，用于診斷肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌等診斷，PSA(前列腺特異性抗原)的檢測(cè)用于前列腺癌診斷等。放射免疫顯像試劑盒主要包括CEA-Scan(Tc-99m標(biāo)記的CEA抗體)，用于結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌的體內(nèi)診斷；Nofetumobab(Tc-99m標(biāo)記的40KD的癌相關(guān)抗原的抗體)用于小細(xì)胞肺癌的體內(nèi)診斷；Oncoscint(Indium~lll標(biāo)記的抗Tag-72的抗體B72.3)，用于結(jié)腸癌的體內(nèi)診斷和Prostascint(Indium-Ill標(biāo)記的抗PSMA)，用于前列腺癌的體內(nèi)診斷。基因診斷試劑盒包括用熒光探針對(duì)組織中的her-2及尿液中的膀胱癌細(xì)胞的檢測(cè)。免疫組織化學(xué)試劑盒主要是her-2檢測(cè)試劑盒，用于her-2抗體藥物應(yīng)用前的判斷指標(biāo)。由此可以看出，目前國(guó)內(nèi)外免疫組織化學(xué)試劑盒同類產(chǎn)品較少，暫還沒(méi)有用HAbl8G/CD147這一癌標(biāo)志物進(jìn)行診斷試劑開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品.根據(jù)前期鼠源單抗HAbl8的研究結(jié)果顯示，與其他癌標(biāo)志物相比，HAbl8G/CD147更為廣譜、陽(yáng)性率更高，例如Her-2蛋白在乳腺癌的陽(yáng)性表達(dá)僅有20%~40°/。，HAbl8G/CD147的陽(yáng)性率為64.36%。因此HAbl8G/CD147的免疫診斷試劑的應(yīng)用更廣、敏感性更強(qiáng)。HAbl8G/CD147分子是第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞工程中心用腫瘤單抗HAbl8篩選人肝癌組織cDNA文庫(kù)得到的CD147家族的新成員。分析HAbl8G/CD147分子作為乳腺癌和肝癌的腫瘤標(biāo)志物在以下幾個(gè)方面具有臨床意義1)HAbl8G/CD147分子可作為癌的診斷標(biāo)志物免疫組化結(jié)果顯示，6HAbl8G/CD147在大多數(shù)癌組織，特別是上皮來(lái)源的癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率很高，其陽(yáng)性表達(dá)只限于癌細(xì)胞，背景清晰(間質(zhì)均不著色)，無(wú)非特異性著色，并且，在正常組織表達(dá)很低，在良性腫瘤和良性病變組織均為陰性；經(jīng)檢測(cè)各類癌1553例，其中陽(yáng)性檢測(cè)率達(dá)到1035例，陽(yáng)性率為66.64%;而239例正常組織中，陽(yáng)性率僅占到5.18%，反映出HAbl8G/CD147分子對(duì)癌細(xì)胞具有很高的敏感性和特異性。這將對(duì)癌的診斷具有重要的臨床意義。2)HAbl8G/CD147分子可作為癌早期診斷標(biāo)志物免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，HAM8G/CD147的陽(yáng)性率在乳腺不典型增生(癌前病變)為27.23X(12/44);肝細(xì)胞不典型增生100%(6/6，)；胃癌腸上皮化生為72.92%(35/48)，這些表達(dá)陽(yáng)性的不典型增生病變也可能已經(jīng)具有癌變的基因水平改變，發(fā)現(xiàn)和診斷這些病變將大大提高癌的早期診斷率，使這部分患者得到早期治療。3)Mbl8G/CD147分子可作為癌的組織學(xué)分級(jí)和預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)志物前期研究結(jié)果顯示HAbl8G/CD147在乳腺的髓樣癌，粘液癌不表達(dá)，在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌表達(dá)陽(yáng)性率高。表達(dá)強(qiáng)度與組織分級(jí)相關(guān)(P=0.002)。同時(shí)分析了HAbl8G/CD147分子與其它幾項(xiàng)(ER、PR、CerbB-2、p53、Ki67)指標(biāo)的關(guān)系，HAbl8G/CD147分子表達(dá)與CerbB-2呈顯著正相關(guān)(P-0.000)，與PR呈顯著負(fù)相關(guān)(P-0.000);對(duì)106例臨床病人進(jìn)行隨訪，發(fā)現(xiàn)HAbl8G/CDl47的表達(dá)與病人的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)、病人的生存密切相關(guān)(p-0.000)，說(shuō)明HAbl8G/CD147可以用作預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后不良的指標(biāo)。而我們的前期研究也表明，HAM8G/CD147在高分化肝癌的表達(dá)明顯的低于在低分化肝癌的表達(dá)，在肝癌肝移植術(shù)后其表達(dá)增髙預(yù)示著肝癌的復(fù)發(fā)。以上結(jié)果提示HAbl8G/CD147的表達(dá)強(qiáng)度對(duì)臨床評(píng)估腫瘤的預(yù)后，制定個(gè)體化的治療方案具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一個(gè)抗廣譜腫瘤標(biāo)志物HAbl8G/CD147的單克隆抗體的人源化單抗Hu-ScFv18重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因；以便獲得的由兩個(gè)片斷重組后表達(dá)出特異性識(shí)別和結(jié)合腫瘤標(biāo)志物HAbl8G/CD147的抗體活性片段。本發(fā)明的另一目的在于所述的人源化單抗Hu-ScFv18重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因和對(duì)應(yīng)多肽在制備用于診斷和治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供一個(gè)抗腫瘤標(biāo)志物HAbl8G/CD147單克隆抗體的人源化單抗Hu-ScFv18重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因和其編碼多肽。本發(fā)明的人源化單抗Hu-ScFv18重鏈和輕鏈可變區(qū)基因是從已有的鼠源性抗HAbl8G單抗的雜交瘤細(xì)胞株HAbl8中克隆的基因改造得到的，其中所述的重鏈可變區(qū)基因全長(zhǎng)為357bp,其核苷酸序列如序列表中〈400〉1所示，其編碼的多肽序列如序列表中<400>3所示。所述的輕鏈可變區(qū)基因全長(zhǎng)為333bp,其核苷酸序列如序列表中<400>2所示，其編碼的多肽序列如序列表中<400>4所示，上述兩個(gè)基因重組后可用于表達(dá)特異性識(shí)別和結(jié)合肝癌相關(guān)抗原HAbl8G的抗體活性片段。我們已有的研究顯示，HAbl8G/CD147是一個(gè)通用型腫瘤廣譜標(biāo)志物，因此針對(duì)雜交瘤HAbl8分泌的抗HAM8G/CD147的單抗進(jìn)行的人源化改造，所得到的人源化單抗Hu-ScFv18輕、重鏈可變區(qū)基因即可用于診斷和治療腫瘤藥物中應(yīng)用。圖l鼠源性HAbl8單抗VH和VL的結(jié)構(gòu)拓?fù)鋱D。圖2鼠源性HAbl8單抗可變區(qū)突變位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)圖。圖3PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖。圖4重組質(zhì)粒酵切鑒定的凝膠電泳圖。圖5人源化單抗Hu-ScFv18的細(xì)胞ELISA結(jié)果示意圖。圖6人源化單抗Hu-ScFv18的細(xì)胞免疫熒光結(jié)果示意圖。圖7人源化單抗Hu-ScFvl8的免疫組化結(jié)果示意圖.具體實(shí)施例方式8鼠源性HAbl8單抗輕、重鏈可變區(qū)基因克隆所用細(xì)胞株為第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞工程研究中心釆用傳統(tǒng)的融合方法獲得的一株高親和力、高特異性的鼠源性抗人肝細(xì)胞癌單抗HAb18雜交瘠細(xì)胞株《生物材料保藏證明生物材料的分類命名抗人肝癌單克隆抗體HAM8雜交癍細(xì)胞株，保藏單位中國(guó)傲生物菌種保藏管理委員會(huì)普通徵生物中心，地址中國(guó)北京中關(guān)村，保藏日期1999年12月6日，保藏編號(hào)CGMCCNO.0426),該抗體已通過(guò)了中國(guó)藥品生物制品檢定所的《人用鼠源性單克隆抗體射備及質(zhì)量控制要點(diǎn)》的要求，其抗原為HAbl8G分子，其分泌的翁體分子亞型為IgGl。利用該細(xì)胞株提取總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄和pca反應(yīng)可擴(kuò)纘鼠象性單拔H幼18輕、重鏈可變區(qū)基因。具體方法和結(jié)果已在下列文章和專利中公開(kāi)該細(xì)胞株的建立可參見(jiàn)《單克隆抗體通訊》，1989;2:33-36，陳志南，劉參仿，楊繼震等；該基因本發(fā)明人已經(jīng)獲得授權(quán)專利CN021144710?！禜At)18G分子單鏈抗體基因的構(gòu)建及在大腸桿菌中的分泌表達(dá)>》，中國(guó)免疫學(xué)雜志，2歸3年7期。鼠豫性HAbl8單抗可變區(qū)序列和結(jié)構(gòu)計(jì)算機(jī)分析本發(fā)明人利用基因序列翻譯軟件ORFfinder將鼠源的單抗HAblS重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL的核酸序列(專利CN021144H0)進(jìn)行翻譯，同時(shí)根據(jù)抗體基因數(shù)據(jù)庫(kù)Kabat、Abm、Chothia和Contact的規(guī)則標(biāo)^翁;體的互補(bǔ)決定區(qū)CDR區(qū)和用矩形框表示的SDR區(qū)，"小星"(Stafs)代表在不病數(shù)據(jù)庫(kù)中不同的CDR區(qū)(見(jiàn)表l)。表1鼠源性Mbl8單抗可變區(qū)序列及其分析HAbl8Vh^120舶VRSKAHfHA*#**Ksbst*…'…*w………《處匿………w…*…峰》…"…^……Cor^…………'m…"…脂………w80咖g:TESlT"RFTISRD"KSI"LQHR界LRAEDTGIYJCTIlf)SIATlH"QGT********KabatKabst-ContactContact^I恥WHAM8VLvI20切SNRR|TGVP***********Kabat、AbH、Chothia**,…*Kabat、AbK、-…""Contact……""Contacts,OKI*80咖KFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDA"FCJQft"SPFlTFGSGTKLEISRKPChothia*********Kabat、腿、Cho化ia-********Contacts………圖w利用抗體胚系基因數(shù)據(jù)庫(kù)VBase2的基因序列DNAPLOT對(duì)其核酸序列進(jìn)行分析，確定了HAbl8VH使用了Igh-VJ606VH6家族V基因片段，VL使用了IGKV19/28家族V基因片段.同基因數(shù)據(jù)庫(kù)Genbank的非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)nr做比對(duì)BlastP，組織來(lái)源分別選擇人Homosapiens和小鼠Musmusculus兩類。確定選擇相似性得分最高的人源、鼠源抗體可變區(qū)序列各ioo條進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，查找鼠源序列中的差異殘基，然后利用SWISS-MODEL對(duì)HAbl8可變區(qū)同源模建，對(duì)HAbl8的三維結(jié)構(gòu)模建和結(jié)構(gòu)分析即。最終獲得從PDB中挑逸與HAbl8VH、VL相似性得分合計(jì)值最高的IO個(gè)抗體結(jié)構(gòu)。利用結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)Swiss-Pdb10Viewer3.7的擬合功能將HAbl8VH、VL以該抗體結(jié)構(gòu)為模板進(jìn)行空間拼接，用軟件Gromos96獲得力場(chǎng)的計(jì)算能量值，將最小能量值的對(duì)接模型使用軟件Discover進(jìn)行分子力學(xué)優(yōu)化，得到鼠HAM8可變區(qū)精確的三維模型。進(jìn)一步分析抗體的可變區(qū)三維結(jié)構(gòu)，可知HAbl8VH的同源模板為lWmH、lv7nK、ldlfH、lwzlH,同時(shí)VL的同源模板為lncdL、lncaL、liaiL、lztxL，選擇具有73.3%相似性的lwzl作為拼接模板，結(jié)果經(jīng)GR0M0S96力場(chǎng)優(yōu)化后總能量為-8820.85KJ/Mo1。在Discover分子力學(xué)優(yōu)化后，用Procheck檢查得到G-factor值為0.13A，表示模型的各項(xiàng)指標(biāo)在對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)范圍內(nèi)。依據(jù)模建的三維模型計(jì)算鼠單抗可變區(qū)相對(duì)表面可及性、氫鍵作用，繪制結(jié)構(gòu)拓?fù)鋱D見(jiàn)閣l，其中方型框表示側(cè)鏈外露的殘基；畫(huà)形框表示表面可及性小于30%的殘基；三角框表示參與VH-VL相互作用的殘基；灰色表示差異殘基；黑色表示差異殘基中的異常殘基；箭頭表示分子內(nèi)氧鍵(NH—0C)。初步?jīng)Q定突變侯選位點(diǎn)，CDR-FR連接處參與形成氫鍵的殘基，以及在抗體框架區(qū)形成氪鍵保持球蛋白P片層結(jié)構(gòu)的殘基，對(duì)以上殘基均予以保留。在此基礎(chǔ)上檢査CDR中非SDR殘基，發(fā)現(xiàn)只有VL中CDR2的ThrL056外露面積為62.6%、且沒(méi)有參與氫鍵作用，可以作為突變侯選位點(diǎn)。通過(guò)以上分析，將最終得到的侯選突變位點(diǎn)分為三類無(wú)風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)、外側(cè)P片層位點(diǎn)、CDR區(qū)位點(diǎn)，具體見(jiàn)表2.通過(guò)觀察HAbl8模型，發(fā)現(xiàn)候選的突變位點(diǎn)均分布在CDR對(duì)側(cè)區(qū)和FR區(qū)上，遠(yuǎn)離CDR,見(jiàn)圖2。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>再次使用Naccess以范德華半徑為參數(shù)計(jì)算重鏈HAM8VH、輕鏈HAbl8VL和鼠單抗HAb18的相對(duì)表面可及性。利用軟件Chimera中的鍵能分析工具FindHBond分析HAb18VH、VL分子內(nèi)和分子間氫鍵相互作用。最終確定突變候選位點(diǎn)，最后通過(guò)類似的對(duì)突變產(chǎn)生的人源化抗體的模建與分析，獲得能編碼正確的抗體可變區(qū)的人源性VH與VL基因(見(jiàn)序列表).以同樣的方法構(gòu)建人源化抗體模型，使用Swiss-PdbViewer3.7將二者分子疊合，并計(jì)算得到RMSDallat咖為0.2lA，說(shuō)明引入突變殘基后并沒(méi)有改變?cè)笤纯贵w的CDR構(gòu)象。人源化單抗Hu-ScFvl8輕、重鏈可變區(qū)序列的擴(kuò)增和驗(yàn)證用重疊PCR(Over-lappingPCR)的方法，結(jié)合上面的鼠源性單抗HAbl8可變區(qū)序列和結(jié)構(gòu)計(jì)算機(jī)分析，對(duì)潛在的免疫源性較強(qiáng)，但不影響抗體結(jié)構(gòu)的侯選位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，從而獲得人源化單抗Hu-ScFv18重鏈可變區(qū)序列。設(shè)計(jì)的人源化單抗Hu-ScFv18可變區(qū)基因PCR擴(kuò)增IO條引物序列分別如下Partl引物P1-55ATGACCATGATTACGCCAAG3引物Pl-35AACACAAGACAGGCGCATAGATCCT3引物P2-55AGGATCtATGCGCCTGTCTTGTGTT3引物P2-35AGTGTCTTCAGTTCTTAAGTTG3引物P3-55CAACTTAAGAACTGAAGACACT3引物P3-35AGTAAGGATCCACCGCCACCCGAGCC3Part2引物P4-5.35CGGTGGATCCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGCGGTTCG3引物P4-5.25CGGTGGCGGTTCGAGTATTGTGATGACCCAGACTCCCAC3引物P4-5.15ATGACCCAGACTCCCACAAGCCTGGTTGT3引物P4-35GATGTGCGGCCGCGCGTTTGATTTCCA3PCR擴(kuò)增反應(yīng)的具體步驟按常規(guī)方法進(jìn)行，分別用上述各對(duì)引物擴(kuò)增所需的基因'反應(yīng)體系為模板2.5ul，dNTP(各0.4mM),10xBuffer5ul，ExTaqDNA聚合酶1.25u，5，端和3，端引物各5ul(約30pmol)，加水至50ul，混勻，瞬時(shí)離心后，加入l-2滴液體石蠟，置PCR儀上反應(yīng)。反應(yīng)條件94t:imin，54TClmin，72"Clmin，35個(gè)循環(huán)，最后72TC延伸10min。首先，以18-ScFv為模版(見(jiàn)本發(fā)明人文章和專利《HAM8G分子單鏈抗體基因的構(gòu)建及在大腸桿菌中的分泌表達(dá)》，中國(guó)免疫學(xué)雜志，2003年7期；中國(guó)專利CN021144710)，分別擴(kuò)增利用三對(duì)配對(duì)引物Pl-5/Pl-3，引物P2-5/P2-3，引物P3-5/P3-3獲得產(chǎn)物Pl(圖3，泳道2)，產(chǎn)物P2(圖3，泳道3)，產(chǎn)物P3(圖3，泳道4);將三個(gè)產(chǎn)物P1、P2、P3混合后，用配對(duì)引物Pl-5/P3-3再次擴(kuò)增獲得大約510pb的產(chǎn)物Partl(圖3，泳道5)。隨后再次用18-ScFv為模版，以引物P4-3/P4-5.1獲得中間產(chǎn)物P4.1;再用純化的中間產(chǎn)物P4.1為模版，以引物P4-3/P4-5.2獲得產(chǎn)物P4.2;最后用純化的P4.2為模版，以P4-3/P4-5.3獲得產(chǎn)物Part2(圖3，泳道6).將獲得的兩個(gè)片段基因Partl+Part2利用BamHl消化，連接，終產(chǎn)物直接用P4-3和Pl-5擴(kuò)增，獲得目標(biāo)基因Hu-ScFv18，其理論大小870bp,(圖3，泳道7箭頭所示)。目的片段T載體克隆測(cè)序方案如下將PCR產(chǎn)物凝膠電泳分離后回收，連入pMD18-T載體。連接反應(yīng)體系為pMD18-T載體lul，PCR產(chǎn)物凝膠純化重鏈(或輕鏈)3ul，去離子水lul,連接緩沖液5ul，混勻后4TC過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，條選重組克隆，然后釆用通用測(cè)序引物測(cè)序。突變后基因Hu-ScFv18放到T載體中測(cè)序驗(yàn)證正確后，通過(guò)分7I/AbfI雙酶切放到表達(dá)載體pCANT-AB5e，I雙酶切鑒定結(jié)果如圖4所示其中克隆1-6均插入了Hu-ScFvl8序列；泳道7是鼠源的ScFvl8對(duì)照(ScFvl8/pCANT)，8是陰性對(duì)照。從這個(gè)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)克隆l-6均插入了正確的Hu-ScFv18。最后將克隆1的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌AcW/表達(dá)蛋白；表達(dá)蛋白可通過(guò)Ni-NTA層析柱富集純化(按供應(yīng)商法馬西亞公司的標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行)。所獲得蛋白可用Western-blot和免疫熒光檢測(cè)表達(dá)蛋白的活性，進(jìn)而驗(yàn)證所獲得的人源性序列的可靠性。人源化單抗Hu-ScFv18可變區(qū)序列表達(dá)蛋白的活性驗(yàn)證將噬粒表達(dá)載體pCANT-AB5e利用Sfil/Notl進(jìn)行雙酶切，與本發(fā)明所克隆的人源化單抗Hu-ScFv18可變區(qū)序列的輕、重鏈可變區(qū)基因重組成可溶性Hu-ScFv18表達(dá)載體進(jìn)行常規(guī)的原核表達(dá)并純化.以正常人張氏肝細(xì)胞QSG-7701為陰性對(duì)照，肝癌細(xì)胞FHCC-98為樣本，用間接ELISA檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物-可溶性Hu-ScFvl8的活性。ELISA結(jié)果顯示，表達(dá)產(chǎn)物能和肝癌細(xì)胞FHCC-98結(jié)合，但是不能與正常的肝細(xì)胞結(jié)合(見(jiàn)圖5).這說(shuō)明純化產(chǎn)物獲得了表達(dá)的Hu-ScFvl8小分子抗體。另外，以此表達(dá)的可溶性Hu-ScFvl8小分子抗體結(jié)合上述兩種細(xì)胞的免疫熒光實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖6)，表明所表達(dá)的可溶性Hu-ScFv18小分子抗體可特異性結(jié)合在癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上，而不結(jié)合到正常的肝細(xì)胞表面，這也間接的說(shuō)明了表達(dá)的產(chǎn)物一Hu-ScFvl8具有一定的生物學(xué)活性。免疫組化試驗(yàn)結(jié)果示(見(jiàn)圖7):Hu-ScFv18小分子抗體可與肝癌組織結(jié)合，而與正常肝組織不結(jié)合，表明該人源化單抗Hu-ScFvl8具有識(shí)別、結(jié)合肝細(xì)胞肝癌的能力，具有發(fā)展成為抗肝癌制劑的潛能。通過(guò)生物信息學(xué)，對(duì)該可溶性Hu-ScFvl8小分子抗體的性質(zhì)預(yù)測(cè)如下組成氨基酸數(shù)目(Numberofaminoacids):256個(gè)；理論上的分子量(Molecularweight):27329.1;理論上的等電點(diǎn)(Theoreticalpi)::6.79;其中含有的陰性帶電殘基(Asp+Glu):22;陽(yáng)性帶電殘基(Arg+Lys):21;最終分子式為C1195H1829N3390383S8，即總原子數(shù)3754個(gè)；N端序列起始于E(Glu).體內(nèi)半衰期在網(wǎng)織紅細(xì)胞估計(jì)約1.0小時(shí)，在酵母約30分鐘；而在大腸桿菌至少大于IO.0小時(shí)。脂肪指數(shù)(AliphaticIndex)60.55.目前，腫瘤單抗應(yīng)用方面的研究主要集中在(1)腫瘤單抗在腫瘤相關(guān)抗原研究中的應(yīng)用單克隆抗體的發(fā)展提供了一個(gè)發(fā)現(xiàn)新腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤抗原新位點(diǎn)的有效手段。這些抗原可用于臨床血清學(xué)檢查，具有一定的診斷和評(píng)價(jià)治療效果的意義.(2)腫瘤單抗導(dǎo)向藥物研究以單抗為載體的放免顯像診斷、導(dǎo)向化療和導(dǎo)向放療近年取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。主要有①化學(xué)藥物一單抗交聯(lián)物；②細(xì)胞毒素一單抗交聯(lián)物；③放射性核素一單抗交聯(lián)物等。以本發(fā)明所述的人源化單抗Hu-ScFv18輕、重鏈可變區(qū)基因重構(gòu)成一定形式的蛋白藥物，可直接用于有關(guān)疾病特別是常見(jiàn)腫瘤，如肝癌，乳腺癌，肺癌等的診斷及導(dǎo)向治療。另外，以本發(fā)明所述的人源化單抗Hu-ScFvl8輕、重鏈可變區(qū)基因編碼的多肽及其衍生物作為載體，交聯(lián)上細(xì)胞毒性藥物、毒素、放射性核素、酶和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑等作為導(dǎo)向藥物，可用于有關(guān)疾病特別是腫瘤的診斷及治療.從本發(fā)明所述的人源化單抗Hu-ScFvl8輕、重鏈可變區(qū)基因編碼的多肽出發(fā)，可重組成的新型抗體主要有下列幾種形式(l)人源化抗體。針對(duì)該基因結(jié)構(gòu)的人源化改造，不但降低了可變區(qū)的鼠源性同時(shí)又保持了鼠MAb的特異性和親和力。(2)小分子抗體。主要有由VH-CH1和VL-C1組成Fab抗體、用一多肽接頭(GLy4Ser)3或其他柔性接頭可連接VH基因和VL基因而成單鏈抗體；由VH和VL以非共價(jià)鍵結(jié)合而成Fv片段抗體、由VH或VL—個(gè)功能結(jié)構(gòu)域組成的單域抗體；由單個(gè)CDR構(gòu)成的最小識(shí)別單位等。(3)多價(jià)微型抗體。主要有雙鏈抗體、(ScFv)2、Flex微型抗體、LD微型抗體、FUV)2、F(ab')3、(ScFv)4等.由于有多價(jià)抗原結(jié)合位點(diǎn)，親和力高，分子大小適中，既能穿透腫瘤組織，亦在腎臟中的清除率較慢的特點(diǎn)而具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。(4)雙特異性抗體。是一類具有雙重特異性和雙重功能的抗體，又稱雙功能抗體，上述基因可提供其中的一個(gè)靶點(diǎn).(5)重組抗體融合蛋白。把Fab或Fv等基因片段，與非抗體的毒素或酶等其它蛋白基因連接形成的具有把特定的生物活性導(dǎo)向靶部位的一種重組蛋白。(6)重組免疫毒素。將編碼抗體和毒素的基因重組而產(chǎn)生，特點(diǎn)是高效，非特異毒性低，體內(nèi)穩(wěn)定性好，易穿透腫瘤及體內(nèi)使用較安全。(7)噬菌體抗體。把Ig的V區(qū)基因與絲狀噬菌體dna上基因in或基因vin連接經(jīng)轉(zhuǎn)染宿主菌后，使其在膜表面外殼蛋白表達(dá)Fab或ScFv的融合蛋白產(chǎn)物.通過(guò)對(duì)此產(chǎn)物多輪相關(guān)抗原的親和吸附，從中淘篩出更加優(yōu)化的特異性抗體。以上述人源化單抗Hu-ScFvl8的輕、重鏈可變區(qū)基因編碼的多肽重組或衍生的抗體分子為載體，交聯(lián)上各種抗癌或抗炎癥的效應(yīng)物質(zhì)而形成的免疫偶聯(lián)物或?qū)蛩幬镏饕邢铝袔追N形式u)抗體-核素偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物可將核素有效地導(dǎo)向腫瘤組織局部，從而減少了因放療外照射引起的正常組織損傷及有關(guān)的不良反應(yīng)，并可對(duì)腫瘤進(jìn)行定位診斷和導(dǎo)向治療。這種方法即為放射免疫顯像和放射免疫治療。與單抗偶聯(lián)的常用核素有1251，131I,mIn，9flY，"Tc'，mRe和、e等。(2)抗體-化療藥物偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物能特異地導(dǎo)向腫瘤，可減低對(duì)正常組織的損傷，減少化療藥物的毒副作用。常偶聯(lián)的化療藥物如烷化劑中的磷酸酰胺；抗代謝中的氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶；抗生素類阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素；植物類長(zhǎng)春新堿、絲裂霉素等.(3)抗體-毒素偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物又稱免疫毒素。其殺傷細(xì)胞作用強(qiáng)且不依賴于生物輔助機(jī)制.其殺傷腫瘤機(jī)制與放療，化療不同，所以一般放療、化療效果差的腫瘤可用，應(yīng)用前景廣闊。常用的毒素有篦麻毒素、白喉毒素、紅豆毒素、肥皂草毒素、假單孢菌外毒素、鏈球菌溶血素、穿孔素等。(4)抗體-生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRM)偶聯(lián)物。BRM單獨(dú)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫能力和殺傷腫瘤細(xì)胞已取得較好的療效。但由于其輸入體內(nèi)后僅有部分到達(dá)腫瘤靶部位，其殺傷作用得不到充分發(fā)揮且有毒副作用。將BRM與單抗偶聯(lián)，通過(guò)單抗攜帶其到達(dá)靶部位而發(fā)揮殺傷腫瘤的作用，使這些因子的作用更強(qiáng)，且更加專一。常用的BRM有INF和IL-2等.(5)抗體導(dǎo)向酶解前藥。將抗體與藥物專一性活化酶的偶聯(lián)物注入體內(nèi)，間隔一定時(shí)間后注入前藥，使其在腫瘤部位轉(zhuǎn)化成髙濃度抗癌活性藥以殺傷腫瘤細(xì)胞。目前，可作為前藥的有苯甲酸氫芥的谷氨酰胺衍生物、磷酸鬼臼乙叉戒、磷酸絲裂霉素、葡糖苷酸柔紅霉素、阿霉素、5-氟胞嘧啶和頭孢菌素氣芥等?；罨赣恤入拿窯2、堿性磷酸酶、青霉素酰胺酶、P-內(nèi)酰胺酶、胞嘧啶脫氨酶、P-葡糖苷酶和氨基肽酶等.(6)免疫脂質(zhì)體。將MAb偶聯(lián)到脂質(zhì)體的表面能充分將MAb與抗原特異性結(jié)合的導(dǎo)向性及脂質(zhì)體能包裹大量藥物的特性融為一體，再包埋上有關(guān)藥物，則可提高藥物靶向性和療效。序列表<110>陳志南〈120〉人源化單抗Hu-ScFv18的輕、重鏈可變區(qū)基因和其編碼多肽及其應(yīng)用<160>4<210>1<211>357<212>DNA<220><221>V一region<222>(1)…(357)<400>1gaagtgaagcttgaggagtctggaggaggc"ggtgcastcctggagga48tctatgcgcctgtcttgtgttgcctctggattcacttttagtgacgcc96tggatggactgggtccgccagtctccaigagaagggacttgagtgggtt144getgaaatteigaageaaagetaataatcatgcaccatactatactgag192tctgtgaaagggaggttcaccateteacgagatgattecaagagtatt240atetacctgcaaatgaacaacttaagaactgaagacactggcatttat288tactgtaccaggg"ageacggetacccactggggccaagggactctg336gtcactgtctctteagetage357<210>2<211>333<212>雖<220><221>V_region<222>(l)...(333)<400>2agtattgtg"g￡LCCcagactcccgacagggttaccataacctgcaaggtagettggtaccaacagaagccattctatgcatecaatcgcaacactagtggatatgggacggatttcactgaagacctggcagtttatttctgtacgttcggcteggggacaaagctgacaagectggttgtateagcagga48gccagtcagagtgtgattaatgat96gggcagtctcctaaactgctgata144ggagttcctgatcgcttcactggc192ttcaccateageactgtgcagget240cagcaggattatagtcctccattc288gaaateaaacgcgcggccgca333<210>3<211>119<212>PRT<220><221>V_segment<400>3GluValLysLeuGluGluSerGlySerMetArgLeuSerCysValAlaTrpMetAspTrpValArgGinSerAlaGlulieArgSerLysAlaAsnSerValLysGlyArgPheThrlielieTyrLeuGinMetAsnAsnLeuTyrCysThrArgAspSerThrAlaValThrValSerSerAlaSer119GlyGlyIxuValGinProGlyGly16SerGlyPheThrPheSerAspAla32ProGluLysGlyLeuGluTrpVal48AsnHisAlaProTyrTyrThrGlu64SerArgAspAspSerLysSerlie80ArgThrGluAspThrGlylieTyr96ThrHisTrpGlyGinGlyThrLeu112<210>4<211>111<212>PRT<213>mouse<220><221>V_segment<400>4SerlieValMetThrGinThrProThrSerLeuValValSerAlaGly16AspArgValThrlieThrCysLysAlaSerGinSerVallieAsnAsp32ValAlaTrpTyrGinGinI>ysProGlyGinSerProLysLeuLeulie48PheTyrAlaSerAsnArgAsnThrGlyValProAspArgPheThrGly64SerGlyTyrGlyThrAspPheThrPheThrlieSerThrValGinAla80GluAspLeuAlaValTyrPheCysGinGinAspTyrSerProProPhe96ThrPheGlySerGlyThrLysLeuGlulieLysArgAlaAlaAla11120權(quán)利要求1、抗HAb18G/CD147的人源化單抗Hu-ScFv18的重鏈可變區(qū)基因，其具有序列表<400>1的序列。2、由權(quán)利要求l基因編碼的多肽產(chǎn)物，其具有序列表<400>3的序列。3、抗HAbl8G/CD147的人源化單抗Hu-ScFv18的輕鏈可變區(qū)基因，其具有序列表<400>2的序列。4、由權(quán)利要求3基因編碼的多肽產(chǎn)物，其具有序列表<400>4的序列。5、權(quán)利要求1或3所述的基因在制備用于診斷和治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及抗HAb18G/CD147的人源化單抗Hu-ScFv18的輕、重鏈可變區(qū)基因和其編碼多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明應(yīng)用一組設(shè)計(jì)的引物成功地將HAb18雜交瘤分泌的抗HAb18G/CD147單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因進(jìn)行了人源化改造，所得人源化單抗Hu-ScFv18的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因可編碼正確的抗體可變區(qū)。基于上述已克隆到的抗HAb18G/CD147的人源化單抗Hu-ScFv18輕、重鏈可變區(qū)基因，可以采用基因工程方法，構(gòu)建和表達(dá)多種針對(duì)HAb18G/CD147分子的小分子基因工程抗體，如單鏈抗體、嵌合抗體、Fab抗體等，以便用于肝癌的診斷和治療目的。文檔編號(hào)A61K48/00GK101550416SQ20091012614公開(kāi)日2009年10月7日申請(qǐng)日期2009年2月26日優(yōu)先權(quán)日2008年3月18日發(fā)明者征張,郁李,楊向民,陳志南申請(qǐng)人:陳志南