專利名稱：基因rab13的拮抗劑的應用及包含該拮抗劑的藥物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因rabl3(SEQ ID NO. 1)的拮抗劑在制備用于抑制腫瘤細胞增殖和 促進腫瘤細胞凋亡或者用于增強抗腫瘤藥療效的藥物中到應用。本發(fā)明也涉及包含該拮抗 劑的用于抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡或者用于增強抗腫瘤藥療效的藥物。
背景技術：
現在已知ras、rab亞家族的許多成員在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起了一個促進作用， 是潛在的癌基因。如rab2與白血病的發(fā)病有關，在白血病中高表達；rab7、8與黑色素瘤有 關，在黑色素瘤中高表達；rabll在食管癌細胞的囊泡運輸中不正常而可能導致了食管癌 的發(fā)生；rab25在上皮來源的乳腺癌和卵巢癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲性方面都起了重要作用， 特別在乳腺癌和卵巢癌III、IV表達異常增高，它明顯促進了腫瘤細胞的增殖，抑制了凋亡 和失巢凋亡。腫瘤的發(fā)生是一個多階段、多步驟的過程，這一過程中伴隨著機體許多的細胞學、 遺傳學的改變，出現多種基因表達異常，包括癌基因的激活和/或抑癌基因滅活，激發(fā)異常 的信號傳導通路，導致細胞周期及細胞凋亡異常，從而使得細胞惡性轉化，并隨著各種分子 異常的累積，腫瘤出現進展、轉移。因此，了解這些在腫瘤發(fā)生過程中、在腫瘤組織中起了重 要作用的基因，對于腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的闡明、尋找新的腫瘤治療靶標具有重要意義。由于rab家族的一些成員是潛在的癌基因，已有的實驗結果表明在體內和體外采 用基因沉默或敲除的方法。均可以抑制腫瘤細胞的增殖和生長，因而就提出了一種新式 治療靶標，我們可以把這些潛在的癌基因作為腫瘤治療的新靶標。Genbank(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Genbank/index. html)中公開了一種基因 rabl3 (Gene ID 285282) (SEQ ID NO. 1)及其所編碼的蛋白質(GI 627514717) (SEQ ID NO. :2)。但是迄今為止，并沒有 文獻報道該基因在治療腫瘤方面的功能。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供基因rabl3(SEQ IDN0. 1)的拮抗劑在制備用于抑制腫瘤細 胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡或者用于增強抗腫瘤藥療效的藥物中的應用。本發(fā)明的另一個目的是提供包含該拮抗劑的用于抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤 細胞凋亡或者用于增強抗腫瘤藥療效的藥物。為了達到該目的，本發(fā)明提供了如下的技術方案本發(fā)明的基因rabl3(SEQ IDN0. 1)可以作為腫瘤治療的靶標，也就是說基因rabl3的拮抗劑可以用于制備用于抑制 腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡或者用于增強抗腫瘤藥療效的藥物。同時，本發(fā)明也提 供了一種用于抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡或者用于增強抗腫瘤藥療效的藥物， 其包含基因rab 13的拮抗劑。本發(fā)明人通過實驗發(fā)現在腫瘤細胞中，抑制和敲除rabl3基因的表達，可以抑制腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡，增加腫瘤細胞對抗癌藥的敏感性；反之，在腫瘤細胞中轉染基因rabl3則可以促進腫瘤細胞的增殖和存活，出現對抗癌藥抵抗。并且通過本發(fā)明后面的實施例及本領域的公知常識可以知道，針對基因rabl3的 任何拮抗劑都可以用于本發(fā)明的目的。例如，所述拮抗劑可以是抑制mRNA翻譯的反義RNA。 本領域技術人員已知反義RNA是指與mRNA互補的RNA分子。由于核糖體不能翻譯雙鏈的 RNA,所以反義RNA與mRNA特異性的互補結合，即抑制了該mRNA的翻譯。另外，最近幾年已 經成熟的siRNA也可以作為本發(fā)明所述的拮抗劑，所述siRNA是由雙鏈RNA來降解mRNA，從 而抑制mRNA轉錄后的翻譯，使得相應基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTCG)的一項技術。2001年Elbashir等《Nature》上首次報道通過21個核苷酸的siRNA成 功地在哺乳動物培養(yǎng)細胞中誘導特異性基因沉默。隨后，在小鼠等多種細胞中也取得了成 功。對于哺乳動物細胞來說，外源倒入的ds RNA長度超過30bp時，會引起非特異性的mRNA 降解?？梢愿鶕景l(fā)明的核酸序列設計一段ds DNA序列合成小雙鏈干擾的RNA或將ds DNA序列連接到載體中，構建干擾RNA的載體，載體進入細胞，利用體內的環(huán)境轉錄獲得拮 抗劑siRNA序列，使得Rabl3基因沉默而達到治療腫瘤的目的。本發(fā)明所述的siRNA分子含有第一鏈和第二鏈，第一鏈包含對應于基因rabl3核 苷酸序列的核糖核苷酸序列，第二鏈包含與基因rabl3核苷酸序列互補的核糖核苷酸序 列?？捎脭y帶本發(fā)明基因rabl3的克隆載體或表達載體轉導、轉化或轉染適當的宿主 細胞。所用的載體例如可以是質粒、病毒顆?；蚴删w形式的?？稍跒榛罨瘑幼印⑦x擇轉 化體或擴增所需的基因rabl3而適當修飾的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)被轉導、轉染或轉化的 宿主細胞。培養(yǎng)中所使用的溫度、PH等培養(yǎng)條件一般都是由所選用的表達特定蛋白質的宿 主細胞決定的，并且這些條件都是本領域技術人員熟知的?？砂粗亟MDNA技術使用本發(fā)明的基因rabl3生產本發(fā)明具有免疫調節(jié)活性和造血 細胞刺激活性的多肽。為此，可將所說的基因rabl3插入到各種用于表達該多肽的適當表 達載體中。這樣的載體包括染色體、非染色體來源的或合成的DNA序列，例如SV40的衍生 物、細菌質粒、噬菌體DNA、酵母質粒、噬菌體(由質粒和噬菌體DNA組合體衍生的載體)、以 及病毒(如桿狀病毒、牛痘病毒、腺病毒、家畜痘病毒)DNA，條件是這些載體能夠在所選擇 的宿主細胞中復制并存活。可用各種已知的方法將適當的DNA序列插入到載體的適當限制性核酸內切酶位 點中。插入到表達載體中的DNA序列被可操作地連接到適當的表達控制序列即啟動子，以 指導mRNA合成。這樣的啟動子的例子包括RSV、HIV、CMV或SV40啟動子，大腸桿菌Iac或 trp啟動子、噬菌體λ PL啟動子及在原核或真核細胞或其病毒中控制基因表達的其他啟動 子。此外，表達載體可含有啟動翻譯的核糖體結合位點及轉錄終止子，并含有一個或 多個選擇標志基因，以提供被轉化的宿主細胞的可選擇表型特征，如適用于真核細胞的新 霉素抗性或二氫葉酸還原酶基因，或適用于大腸桿菌中的氨芐青霉素或四環(huán)素抗性基因?？捎煤猩衔乃鲞m當DNA序列，以及適當啟動子或其他轉錄與翻譯控制序列的 載體轉化適當的宿主細胞，以使宿主表達所需的蛋白質?？墒褂萌魏芜m當的宿主細胞表達本發(fā)明的基因rabl3，可提到的適當宿主的例子有細菌細胞如大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌等；真菌細胞如酵母細胞；昆蟲細胞如果蠅和 中國家蠶細胞；哺乳動物細胞如CHO、COS細胞；以及人細胞如HEK293細胞、U937細胞和 Hela細胞。 具體地說，本發(fā)明涉及包括上述一個或多個基因rabl3的重組構建體，該構建體 包括在其中以正向或反向插入了本發(fā)明的基因rabl3的載體，如質?；虿《据d體，并且在 所說的基因rabl3的上游可操作地連接了適當的調節(jié)序列如啟動子序列和增強子序列。適用的載體的例子包括用于原核細胞的pMTY/4(馬大龍，高技術通訊11 26-29)、 pQE-9 (Qiagen) >pD10>pNH18A (Stratagene) >pKK233-3>pDR540>pRIT5 (Pharmacia) -MRj^. 用于真核細胞的 pcDNA3. l、pWLNE0、pSG (Stratagene)、ρSVL (Pharmacia)。適用的啟動子包 括lacl、T7、λ PL和trp等細菌啟動子，以及CMV、SV40等真核細胞啟動子。在一個實施方案中，本發(fā)明進一步涉及含有上述構建體的宿主細胞。宿主細胞可 以是高等真核細胞如哺乳動物細胞或人腫瘤細胞，或者是低等真核細胞如酵母細胞，或者 是原核細胞如大腸桿菌細胞?？捎帽绢I域已知的方法如氯化鈣轉染法、脂質體轉染法、電穿 孔法或微粒轟擊所說的構建體導入宿主細胞內?？砂闯Ｒ?guī)方法使用包含在宿主細胞中的構建體產生由基因rabl3編碼的多肽產 物(SEQ ID NO. :2)?；蛘?，也可使用常規(guī)的肽合成儀化學合成本發(fā)明的多肽(SEQID NO. 2)?；蛘撸部墒褂醚苌诒景l(fā)明的基因rabl3構建體的mRNA，在無細胞翻譯系統(tǒng)中產生所 需的蛋白質(SEQ ID NO. :2)。必要時，為了提高編碼本發(fā)明多肽的DNA在高等真核細胞中的轉錄效率，可在載 體中插入增強子序列。增強子一般是約含10-300個堿基對并作用于啟動子以增強DNA轉 錄的順式作用元件。另外，必要時也可在啟動子和下游結構序列之間插入一個能指導翻譯 產物向周質或細胞外培養(yǎng)基中分泌的前導序列(分泌信號)?；蛘?，可根據需要導入編碼融 合蛋白質的異源DNA序列，所說的融合蛋白可包括一個賦予所需特征，如用于穩(wěn)定被表達 之產物的或簡化其純化步驟的N末端識別肽?？蛇m用于原核細胞的市售表達載體一般均帶有可選擇標志和細胞復制原點，以及 已知克隆載體pBR322(ATCC37017)的其他遺傳元件。這樣的市售載體包括PGEM(Promega) 和pKK223-3 (Pharmacia)?？筛鶕x用的適當啟動子和待表達的結構基因序列來選擇衍 生于PBR322的適當載體。在轉化宿主細胞并在被轉化的宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用適當的方法 (如溫度變動或化學特質誘導)誘導啟動子，然后繼續(xù)培養(yǎng)之。培養(yǎng)完成后，可用離心法收 集細胞，并用任何已知的方法，如凍融法、超聲處理法、溶菌酶溶解法或機械破碎法破碎細 胞。也可用各種哺乳動物細胞表達本發(fā)明的重組蛋白質。哺乳動物表達系統(tǒng)的例子包 括人細胞系，如Hela、293和U937細胞系，以及C0S、CH0和BHK細胞系。哺乳動物表達載體 可含有復制原點、轉錄終止序列，及5’側翼非編碼序列?？墒褂醚苌赟V40的剪切和聚腺 苷酸化位點的DNA序列來提供必要的遺傳元件?？梢杂酶鞣N已知的方法從宿主細胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的Rabl3多肽，這 些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀法、酸萃取法、超濾法、離子交換層析法、磷酸纖維層析法、疏 水相互作用層析法、凝膠過濾法、親和層析法及高壓液柱層析法。
本發(fā)明的多肽可以是天然產生、化學合成、或用DNA重組技術由原核或真核細胞 產生的。優(yōu)選重組產生的多肽。本發(fā)明的基因rabl3的拮抗劑可以與一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑 相混合以制備藥物?？梢愿鶕委熌康?、給藥途徑的需要將藥物制成多種劑型，例如溶液 齊 、脂質體包裹劑、微膠囊劑及其他緩釋制劑。載體或賦形劑的例子包括生理鹽水、等滲葡 萄糖溶液、緩沖鹽水、甘油、乙醇及上述溶液的組合?？筛鶕枰诮M合物中添加輔助成例 如與本發(fā)明Rabl3的拮抗劑有協(xié)同作用的化合物；又如人血清白蛋白、低分子量肽，氨基酸 (如甘氨酸或賴氨酸)和金屬陽離子(如Zn2+，Mn2+，Mg2+和Ca2+)等蛋白保護劑；聚乙二醇、 羧甲基纖維素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽等穩(wěn)定劑；蛋白酶抑制劑及自由基清除劑；以及在粘 膜或皮膚局部給藥的情況下，添加二甲基亞砜或月桂氮卓酮等皮膚滲透劑?？赏ㄟ^常規(guī)途徑，特別是胃腸道外途徑使用本發(fā)明給藥。本發(fā)明藥物的有效劑量 范圍可從幾微克到幾毫克/公斤體重/天，但針對每個特定病人的具體用藥劑量應根據待 治療疾病或病理狀態(tài)的性質及嚴重程度、病人的年齡、體重、一般健康狀況給藥方式等因素 由臨床醫(yī)生來確定。上述這些方法以及用于這些方法的反轉錄病毒、包含在載體內的適當的啟動子、 包括啟動子和處于適當啟動子控制下的多核苷酸編碼序列的載體、用于轉染包裝細胞系以 形成生產細胞系的逆轉錄病毒質粒載體，以及適當的可被轉染的包裝細胞都是基因治療領 域中已知的?？山柚鞣N已知的方法用攜帶本發(fā)明多肽的核酸編碼序列的載體體外或體內轉 染包裝細胞或靶細胞。這些方法包括但不只限于電穿孔、微粒轟擊(例如使用Biolistic 裝置)、脂質體轉染法，以及磷酸鈣沉淀法或這些方法的聯(lián)合使用。另外，也可以將反轉錄病 毒載體包裹在脂質體中，或者偶聯(lián)到脂質體上，然后再運送到宿主體的適當靶細胞內?？傊?，可由生產細胞系產生包含本發(fā)明多肽的核酸編碼序列的感染性反轉錄病毒 載體顆粒，然后使用這樣的載體顆粒于體外或體內轉導宿主真核細胞。被轉導的真核細胞 將表達編碼所說多肽的核酸序列。可被轉的真核細胞包括但不只限于胚胎干細胞、胚胎癌 細胞和成人癌細胞，以及造血干細胞、肝細胞、成纖維細胞、成肌細胞、間質細胞、上皮細胞 及表皮細胞。用本發(fā)明的Rabl3多肽及其片段、類似物或衍生物作為免疫原制備相應的抗體。 抗體可以是多克隆或單克隆抗體，可以是嵌合的、單鏈的或人源化抗體及其Fab片段?？梢?用雜交瘤技術生產人單克隆抗體，可以用轉基因小鼠制備人源化抗體。所述制備該單克隆 及多克隆抗體技術為本領域已知的技術。本發(fā)明涉及可以阻斷或封閉Rabl3蛋白活性的拮抗劑，如前述單或多克隆抗體。 拮抗劑可以與一或多種藥學上可接受的載體、賦形劑或輔料結合形成藥物。本發(fā)明的有益效果是通過在藥物中應用基因rabl3的拮抗劑，可以抑制腫瘤細 胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡或者用于增強抗腫瘤藥的療效。為了更好地理解本發(fā)明，現在結合附圖及具體實施方式
對本發(fā)明進行詳細的說明。需要說明的是，所述的實施例僅僅是示例本發(fā)明的目的，而不應該理解為對本發(fā)明的任 何限制。


圖1是基因Rabl3在各種細胞系中的表達譜分析。圖2是CCK-8法檢測瞬時轉染rabl3對MDA_MB_231細胞增殖和代謝活性的影響。圖3是CCK-8法檢測過表達rabl3基因對hela細胞增殖和代謝活性的影響。圖4是過表達Rabl3基因對細胞凋亡的影響。圖5是Rabl3si_RNA對基因Rabl3特異性抑制效率的檢測。圖6是CCK-8法檢測瞬時沉默Rabl3基因對MDA_MB_231細胞生存和代謝活性的 影響。圖7是結晶紫染色法檢測過表達Rabl3基因對MDA-MB-231細胞生存能力的影響。圖8是Anncxin V-PI染色法檢測瞬時沉默Rabl3基因對MDA-MB-231細胞凋亡的影響。圖9是Anncxin V-PI染色法檢測過表達Rabl3基因使MDA-MB-231細胞對抗癌藥 紫杉醇的抵抗力增強。圖10是Anncxin V-PI染色法檢測瞬時沉默Rabl3基因使MDA-MB-231細胞對抗 癌藥紫杉醇的敏感性增加。本發(fā)明到申請文件中所用的技術如無特別說明均為本領域一般技術人員所公知 的常規(guī)技術。
具體實施例方式實施例1 :cDNA克隆和質粒構建基因rabl3(SEQ ID NO. 1)的cDNA克隆Genbank中所公開的rabl3基因染色體 定位3ql3. 33，由8個外顯子和7個內含子組成。ORF全長711bp，編碼236個氨基酸。根據Rabl3基因序列，設計Rabl3基因特異引物，上游引物Pl (Pl 5，-ATGGCGTCCCTGGATCGGGT-3，)，下游引物 P2 (P2 :5:CATCTAGATGAGCTGTGAAAAACTGCC_3~) 從人細胞系Hela cDNA文庫中通過PCR擴增得到Rabl3基因編碼區(qū)cDNA片段。PCR擴增中 采用Taq DNA聚合酶，得到含有3’突出堿基A的擴增產物，經電泳鑒定后將其回收、純化后 插入含有3，突出堿基T的線性pGEM-T Easy載體(Promega，A1360)，轉化大腸桿菌DH5 α， 提取質粒，用 ABI PRISM 3700DNA 分析儀(Perkin-Elmer/applied Biosystem)測序，獲得 Rabl3。當然也可以商購該基因。通過酶切pGEM-T Easy載體，產生5 ‘突出端，然后在體外加入RNApol來進行體外 翻譯，從而產生cRNA探針，它是用地高辛標記的，然后用它來檢測RABL3在Hela細胞中的 表達，用的是Northern blotting方法。發(fā)現它在Hela中是有表達的，它的大小和所公開 的蛋白質(SEQ ID N0. 2)大小是一致的。實施例2 基因rabl3的真核表達載體的構建 為了檢測RABL3對細胞的功能，首先構建含有RABL3cDNA的真核表達載體 pcDNA3. 1B-RABL3。pcDNA3. 1/MycHis (-) B (Invitrogen, V85520)是設計用于重組蛋白在 哺乳類動物細胞系中高表達的載體，它含有人巨細胞病毒CMV啟動子，可在哺乳類動物細 胞糸中實現高表達。Rabl3基因采用高表達效率的pcDNA3. 1/MycHis (-) B (Invitrogen, V85520)作為真核表達載體，運用分子克隆技術，將連接在pGEM-TEasy載體中的Rabl3cDNA片斷和pcDNA3. l/MycHis(-)B空載體同時用限制性內切酶EcoRI (Takara)酶切，兩者連接 后轉化大腸桿菌DH5 α，挑選轉化子提取質粒，通過測序挑選正向插入的克隆，即得列含有 Rabl3cDNA的真核表達載體pcDNA3. 1B-Rabl3。為隨后的基因功能研究打下基礎。實施例3 siRNA (小干擾RNA)合成根據測序得到的RABL3基因的序列，設計出針對Rabl3的特異性的si_RNA，序列 為正義鏈5~-CAAGAGCAGUAUUCUACAATT-3~ ；反義鏈5~_UUGUAGAAUACUGCUCUUGTG_3~，以 及不具有任何已知基因序列同源性的陰性對照si-RNA(非沉默的si-RNA)，其序列為正義 鏈5:UUCUCCGAAC⑶⑶CACGUTT-3"反義鏈5~-AC⑶GACACGUUCGGAGAATT-3—；該 siRNA 合 成后經PAGE純化，并根據合成廠家的說明，用無RNA酶水溶解，配制成使用濃度20uM，-20°C 保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r，380ul電轉體系中，取IOul si-RNA進行真核細胞轉染。這里需要說明 的是siRNA的設計及制備屬于本領域公知的技術，并不是本發(fā)明的內容。通常可以通過化 學合成、體外轉錄或者RNAaseIII消化ds RNA等方法進行制備siRNA。當然也可以委托專 業(yè)公司進行制備。實施例4 RT-PCR細胞系總m-RNA的提取，采用TRIZOL(Invitrogen，USA)RNA提取試劑，提 取步驟按照試劑使用說明書進行。逆轉錄反應使用Quantscript RT Kit第一鏈 合成試劑盒(TIANGEN，China)，合成出相應細胞系的c_DNA文庫，并通過Rabl3基 因特異性引物上游引物P3 5~ -TTGGGAGACTCAGGTGTTGGGAAA-3~ ；下游引物P4
-CAGTTGGCACCAAATCCCTGTTGA-3~，對該基因進行PCR擴增，進行相應細胞系的表達豐度 檢測，在進行檢測時，使用GAPDH作為內參，以保證各實驗組c-DNA含量一致。實施例5 細胞增殖檢測指標1.細胞計數試劑盒-8 (Cell counting kit_8，購買自 Dojindo，日本)(Cck_8)實 驗檢測細胞增殖和代謝水平利用電穿孔的方法將連接于真核表達載體上的rabl3基因瞬時轉染入 MDA-MB-231細胞，并在轉染后12小時按2500個/孔的細胞密度鋪入％孔板，待鋪入細胞 狀態(tài)穩(wěn)定，開始進行檢測。每隔12小時設為一個檢測點，檢測時，按每孔IOul的體積加入 cck-8，反應3小時，在450nm的波長下進行吸光度測量，得到各時間點的光密度值，并以此 作為反映細胞活力和增殖水平的重要指標。2.結晶紫染色實驗將瞬時轉染rabl3的細胞以及空載體陰性對照的細胞在轉染后的12小時以2500 個/孔的細胞密度鋪入96孔板，待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后(鋪入后12h)開始進行檢測。每隔12小 時設為一個檢測點。檢測時，將培養(yǎng)基徹底去除，并用PBS清洗三遍，以完全祛除凋亡細胞； 清洗完成后，按IOOul/孔的體積加入12%的甲醛固定1小時，加入結晶紫染液30ul/孔，染 色35分鐘，洗去浮色，將黏附于板底的已染色的活細胞進行初次比色留底(波長570nm)； 比色后，每孔加入IOOul脫色液，并吹打均勻，再將脫色液在570nm波長處進行比色分析，獲 得光密度值，并將該值作為衡量各孔活細胞數目的指標。實施例6 通過磷脂酰絲氨酸(PS)外翻，檢測凋亡細胞比例在轉染后相應的時間點胰酶消化、收集細胞，使用PBS洗滌細胞兩遍，并重懸于 200ul binding buffer(IOmM HEPES, ρΗ 7· 4，140mM NaCl,ImM MgC12,5mMKCl,2. 5mMCaC12))中，各實驗組分別加入終濃度為0. 5ug/ml的Annexin V(FITC-偶聯(lián))，混 合均勻后，室溫避光孵育20min，孵育后加入PI (lug/ml)，立即進行流式細胞儀(Becton Dickinson)檢測，每實驗組收集10000個細胞進行統(tǒng)計分析。實施例7 基因rabl3的表達譜分析如實施例4所述，通過RT-PCR的方法，獲得所選各種細胞系的c_DNA文 庫，并使用基因序列特異性引物(P3 5~ -TTGGGAGACTCAGGTGTTGGGAAA-3~ :P4
-CAGTTGGCACCAAATCCCTGTTGA-3~)監(jiān)測Rabl3基因在各種細胞系中的表達豐度，由實驗結果可得知，Rabl3基因在各種細胞系中，均有相對較為豐富的表達(見圖1)。實施例8 基因rabl3的功能研究(1)在人乳腺癌細胞系MDA-MB-231 (商購)中，瞬時轉染基因rabl3，產生促進腫瘤細胞增殖的作用。根據實施例5和6所述的方法，本發(fā)明利用上述構建的真核表達載體，運用電穿孔 的方法，將其導入人乳腺癌細胞系MDA-MV-231中，并在轉染后，通過AV-PI染色，CCK-8實 驗，結晶紫染色三種不同的實驗指標檢測細胞表型和功能的變化以及對腫瘤細胞增殖代謝 能力的影響。現分別敘述如下i通過cck-8實驗，運用摻入代謝的方法，發(fā)現瞬時轉染rabl3后，可引起 MDA-MB-231增殖能力增強，代謝水平升高Cell counting kit-8 (Cck-8)實驗是公認的檢測細胞活力和增殖程度較為敏感 的指標，實驗結果表明轉染rabl3基因的乳腺癌細胞較空載體陰性對照組相比，在轉染后 的12h，24h，36，48h，各時間點光密度值明顯升高，代謝強度明顯增大(見圖2)。相同的實 驗結果也在hela細胞系(購買于ATCC)中得到了驗證(見圖3)。該實驗從代謝和增殖的 角度，證明了人rabl3基因對腫瘤細胞具有促進增殖和加強代謝的作用，這一較為明確的 現象差異提示該基因在腫瘤細胞生存中的重要作用，從而可以成為一個與腫瘤細胞生存和 生長密切相關的侯選癌基因，成為癌癥預防或治療方面的新靶標。ii通過Armecin V-PI雙重染色的方法，利用流式細胞儀檢測凋亡細胞數，發(fā)現瞬 時轉染rabl3基因48h的細胞組中，Annecin V-PI單獨染色以及Annecin V-PI雙重染色 的細胞比例較陰性對照明顯升高，從而表明，rabl3基因對于腫瘤細胞具有促進增殖和維持 存活的作用(見圖4)，通過該實驗，驗證了上述試驗方法所揭示的基因功能，豐富了實驗指 標，從而為進一步的實驗研究提供了基礎和保證。(2)在人乳腺癌細胞系MDA-MB-231中，運用si_RNA技術，抑制rabl3基因的表達， 可抑制腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡。Si-RNA技術是近年來發(fā)展起來的，能夠有效的特異性降解相關基因表達 的重要技術，它更能從生理水平客觀而真實的反映基因的功能，為此，我們合成了 特異性針對rabl3基因的si-RNA (合成的siRNA命名為si237)，其正義鏈序列為 5、-CAAGAGCAGUAUUCUACAATT-3、；反義鏈序列為5 ~ -UUGUAGAAUACUGCUCUUGTG-3 ~。并從蛋 白水平和m-RNA水平檢測了該si-RNA的抑制效率，以驗證由si-RNA而引發(fā)基因沉默的有 效性。同時，為了去除si-RNA本身對轉染細胞的機能和代謝產生的影響，我們同時合成了 一條無任何抑制作用的無關對照si-RNA，非沉默si-RNA (命名為si non)，其正義鏈序列 為5:UUCUCCGAAC⑶⑶CACGUTT-3"；反義鏈序列為5~-AC⑶GACACGUUCGGAGAATT-3"，以科學合理的反映出基因敲除后，細胞表型和功能的變化。通過實驗結果，可以清楚地發(fā)現，Rab 13特異性si_RNA si237在轉染后24_48小時內，能夠從mRNA水平明顯有效的抑制rab 13基因的表達，同時，轉染后48h，蛋白質水平的 抑制效果也得到了確認(見圖5)，而陰性對照非沉默si-RNA卻不能起到抑制基因表達的作 用，從而為rabl3的功能研究提供了有效的工具和手段。通過將合成的SiRNA瞬時轉染進入MDA-MB-231細胞，運用以上提及的三種檢測細 胞存活和凋亡的實驗方法，我們可以清楚地看到，同陰性對照組相比，將rabl3基因沉默， 腫瘤細胞恢復了對凋亡的敏感性，增殖能力明顯受到抑制，細胞凋亡數明顯增多。現分別闡 述如下i cck-8 實驗運用電穿孔的方法，將rabl3特異性的siRNA瞬時轉染進入乳腺癌細胞系 MDA-MB-231中，運用上述相同的方法進行檢測，發(fā)現，同超表達產生的細胞增殖的變化相 反，抑制該基因的表達，可以使腫瘤細胞生長減緩，代謝減弱，密度降低(見圖6)，從而有效 地減低細胞的增殖代謝活性，推遲腫瘤細胞的發(fā)生和發(fā)展進程。通過si-RNA的轉染，我們 可以從正反兩個方面驗證rabl3基因在腫瘤存活和增殖水平的重要作用，從而完善的顯示 出該基因的真實功能。 結晶紫染色結晶紫染色實驗，通過對活細胞計數的方法，驗證rabl3基因促進腫瘤細胞增殖 的功能。利用Cell counting kit_8 (Cck_8)法檢測細胞增殖和活力，存在一定局限性，它 不能排除凋亡細胞崩解后，釋放至細胞外，但活性仍然存在的各種代謝相關酶類對代謝底 物的變色作用，從而產生實驗偏差。為了避免這一誤差造成的對基因功能的錯誤判斷，更直 觀而準確的把握基因的真實功能，我們采用活細胞染料結晶紫，對瞬時轉染了 rabl3siRNA 細胞和空載體陰性對照進行染色，并對已著色的活細胞進行比色分析，分別設置12h，24h， 36h，48h，72h，五個時間點，通過該方法，直接反映rab 13在各個時間點對細胞存活能力的 影響。通過結晶紫染色實驗，我們可以發(fā)現，在si-RNA轉入的細胞組中，其活細胞數較陰性 對照組明顯減少(見FIG 7)，說明rabl3siRNA對細胞具有增殖抑制的作用，從而排除了由 于實驗方法等因素造成的實驗誤差，從另一個角度更加充分的驗證了敲除rabl3基因，對 于腫瘤細胞生存的影響。iii AV-PI 雙重染色實驗中，轉染有效siRNA 48小時后，通過運用Armecin V-PI雙重染色的方法，并 使用流式細胞儀進行染色細胞計數的方法，我們可以更加明確的得出同以上實驗結果一致 的結論，該實驗表明rabl3基因的缺失，將明顯增加Armecin V、PI單染以及AV-PI雙染的 細胞數目，從而說明了敲除rabl3基因，將使細胞的生存能力受到影響，使腫瘤細胞凋亡比 例升高，存活的腫瘤細胞比例降低(見圖8)，試驗結果同以上實驗完全符合，從而為rabl3 基因作為一個腫瘤治療和監(jiān)測的新靶標提供了堅實的實驗支持。(3)基因rabl3與抗癌藥的實驗腫瘤細胞對于抗癌藥物的抵抗，是導致腫瘤治療失敗的重要原因，尋找新的治療 靶點，恢復腫瘤細胞對抗癌藥物的敏感性，成為腫瘤臨床治療的熱點和前沿。通過以上實驗數據和結果，可以清楚地發(fā)現，rabl3基因單獨轉入細胞，可以明顯地增強乳腺癌腫瘤細胞的增殖能力，但如果將基因敲除，細胞便維持在較低的增殖水平?；谝陨蠈嶒灥难芯拷Y果，探討rabl3同常用的腫瘤治療藥物之間的關聯(lián)，并以此作為腫瘤耐藥性研究的切入點，將成為該基因研究的最重要應用價值所在。通過以上分析，我們以抗癌藥敏感的細胞系MDA-MB-231為模型，將臨床治療乳腺 癌最為常用的藥物紫杉醇作用于基因rabl3超表達的乳腺癌細胞中，運用流式細胞儀檢測 的手段，觀察紫杉醇與基因rabl3之間的相互作用，以及對腫瘤細胞生存和增殖的影響，我 們發(fā)現，在使用終濃度為7uM紫杉醇24h的情況下，超表達rabl3基因可以明顯地降低紫杉 醇誘導的乳腺癌細胞的凋亡(見圖9)，反之，運用siRNA技術，將rabl3基因敲除，同對照組 相比，(見圖10)，顯著的增強了乳腺癌細胞對于紫杉醇誘導凋亡的敏感性，增強了紫杉醇 對乳腺癌細胞的抑制和殺傷能力。凋亡細胞的比例明顯加大。通過以上對人類新基因rabl3的功能實驗，我們可以發(fā)現，rabl3基因具有促進細 胞增值和代謝，維持細胞存活的功能表型，若將該基因敲除，則會出現細胞凋亡增加，存活 數目降低的現象，同時，該基因可以抵抗紫杉醇誘導的乳腺癌細胞的凋亡，從而表明，rabl3 可以作為降低腫瘤細胞耐藥性，提高化療藥藥效的的重要靶分子，通過對該基因表達水平 的調控，可以有效地提高紫杉醇對乳腺癌細胞的殺傷能力，而該基因的抑制劑是一個潛在 的化療藥增敏劑。序列表<110>北京大學<120>基因rabl3的拮抗劑的應用及包含該拮抗劑的藥物<130>CNC1F090007443<160>2<210>1<211>711<212>DNA<213> 智人(Homo Sapiens)<220><221>CDS<222>(1). . . (711)<400>1atggcgtccc tggatcgggt gaaggtactg gtgttgggag actcaggtgt tgggaaatct 60tcgttagtcc atctcctatg ccaaaatcaa gtgctgggaa atccatcatg gactgtgggc 120tgctcagtgg atgtcagagt tcatgattac aaagaaggaa ccccagaaga gaagacctac 180tacatagaat tatgggatgt tggaggctct gtgggcagtg ccagcagcgt gaaaagcaca 240agagcagtat tctacaactc cgtaaatggt attattttcg tacacgactt aacaaataag 300aagtcctccc aaaacttgcg tcgttggtca ttggaagctc tcaacaggga tttggtgcca 360actggagtct tggtgacaaa tggggattat gatcaagaac agtttgctga taaccaaata 420
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Phe Leu Arg Glu Gly Asn Gln lie Pro Gly Phe Pro Asp Arg Lys Arg
210215220
Phe Gly Ala Gly Thr Leu Lys Ser Leu His Tyr Asp22523023權利要求
基因rabl3(SEQ ID NO.1)的拮抗劑在制備用于抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡或者用于增強抗腫瘤藥療效的藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其中所述的腫瘤是人乳腺癌。
3.如權利要求1或2所述的應用，其中所述的拮抗劑是針對基因rabl3所轉錄的mRNA 的siRNA分子或者反義RNA。
4.如權利要求3所述的應用，其中所述的siRNA分子含有第一鏈和第二鏈，第一鏈包含 對應于基因rabl3核苷酸序列的核糖核苷酸序列，第二鏈包含與基因rabl3核苷酸序列互 補的核糖核苷酸序列。
5.如權利要求1或2所述的應用，其中所述的拮抗劑是針對基因rabl3所翻譯的蛋白 質(SEQ ID NO. 2)的單克隆抗體或多克隆抗體。
6.一種抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡或者用于增強抗腫瘤藥療效的藥物，其 包含基因rabl3(SEQ ID NO. 1)的拮抗劑。
7.如權利要求6所述的藥物，其中所述的腫瘤是人乳腺癌。
8.如權利要求6或7所述的用途，其中所述的拮抗劑是針對基因rabl3所轉錄的mRNA 的siRNA分子或者反義RNA。
9.如權利要求8所述的藥物，其中所述的siRNA分子含有第一鏈和第二鏈，第一鏈包含 對應于基因rabl3核苷酸序列的核糖核苷酸序列，第二鏈包含與基因rabl3核苷酸序列互 補的核糖核苷酸序列。
10.如權利要求6或7所述的藥物，其中所述的拮抗劑是針對基因rabl3所翻譯的蛋白 質(SEQ ID NO. 2)的單克隆抗體或多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因rabl3(SEQ ID NO.1)的拮抗劑在制備用于抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡或者用于增強抗腫瘤藥療效的藥物中的應用。本發(fā)明也涉及包含該拮抗劑的用于抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡或者用于增強抗腫瘤藥療效的藥物。
文檔編號A61K39/395GK101797390SQ20091012726
公開日2010年8月11日 申請日期2009年3月12日 優(yōu)先權日2009年3月12日
發(fā)明者李琦, 汪立, 王露, 馬大龍 申請人:北京大學