專利名稱：：溶解和結(jié)合莢膜多糖的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及疫苗領(lǐng)域，尤其涉及抗腦脊膜感染和疾病的疫苗。
背景技術(shù)：
：腦膜炎奈瑟氏球菌OV""eha歷e肌';^7'W力'^是革蘭氏陰性的人類致病菌。它寄生在咽部，導(dǎo)致腦脊膜炎并且有時(shí)不發(fā)生腦脊膜炎而導(dǎo)致敗血病。它和淋病奈瑟球菌緊密相關(guān)，但明顯和腦膜炎雙球菌區(qū)別的特征是，存在一種多糖莢膜，它存在于所有的致病腦膜炎雙球菌中?；谟袡C(jī)體的莢膜多糖，12種腦膜炎奈瑟氏球菌血清組已經(jīng)被確認(rèn)(A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。A組經(jīng)常是sub-Saharan非洲皮膚疾病中所含有的致病菌。血清組B和C是美國(guó)和大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家絕大多數(shù)病例的致病菌。血清組W135和Y是美國(guó)和其它發(fā)達(dá)國(guó)家剩余病例的致病菌。來自腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖典型的配制方法包括步驟為沉淀(例如應(yīng)用陽離子洗滌劑)、乙醇分餾、冷石碳酸提取(除去蛋白質(zhì))以及超離心(除去LPS)[例如參考資料l]。來自血清組A、C、Y和W135的莢膜多糖四價(jià)疫苗已經(jīng)知道很多年了[2，3]并且已經(jīng)批準(zhǔn)應(yīng)用于人類。雖然在青少年和成年人中有效，它引起低的免疫應(yīng)答和較短的保護(hù)時(shí)間，不能應(yīng)用于嬰兒[例如4]。這是因?yàn)槎嗵鞘荰細(xì)胞獨(dú)立的抗原，產(chǎn)生不能提高的較弱免疫應(yīng)答。在這種疫苗中的所述多糖不共軛并以1:1:1:1的比例[5]存在。MENCEVAXACWY"各自包含50yg從凍干形式重組獲得的提純多糖。共軛血清組C寡糖也批準(zhǔn)應(yīng)用于人類[例如MenjugateTM;參考資料6]。然而仍需要發(fā)展針對(duì)血清組A、W135和Y的共軛疫苗，并生產(chǎn)它們
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種提純細(xì)菌莢膜多糖的方法，它包括的步驟有(a)沉淀所述的多糖，接著(b)用乙醇使沉淀的多糖重新溶解。所述的多糖可以用來配制疫苗，如軛合疫苗，尤其是針對(duì)腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、W135和Y的疫苗本文知道了很多沉淀可溶性多糖的技術(shù)。優(yōu)選的方法是應(yīng)用一種或多種陽離子洗滌劑。所述洗滌劑優(yōu)選的通常有以下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中R"R2和R:,相同或不同，各自代表烷基或芳基；或R,和R2與其所結(jié)合的氮原子一起形成一種5-或6-元的飽和雜環(huán)，R3代表烷基或芳基；或Ri，&和&與其所結(jié)合的氮原子一起形成一種5-或6-元的雜環(huán)，氮原子不飽和，R4代表烷基或芳基，X—代表陰離子。在所述方法中特別優(yōu)選的洗滌劑是四丁銨鹽和十六烷基三甲銨鹽(例如溴鹽)。十六烷基三甲基溴化銨('CTAB，)特別優(yōu)選[8]。CTAB也可以是溴化十六碳烷基三甲銨、十六烷基三甲基溴化銨(cetrimoniumbromide)、塞太弗倫和Centimide。其它的洗滌劑包括海地美溴銨(hexadimethrinebromide)和溴化十四垸基三甲銨鹽。莢膜多糖在培養(yǎng)過程中釋放入介質(zhì)。相應(yīng)的，用來沉淀的初始材料典型的會(huì)是來自離心細(xì)菌培養(yǎng)物的上層清液或是濃縮的培養(yǎng)物。沉淀的步驟也許對(duì)于多糖來說是有選擇性的，但它也會(huì)典型的同時(shí)沉淀其它組分(例如蛋白質(zhì)、核酸等等)。沉淀的多糖可以通過在溶解之前的離心而收集。在沉淀之后，所述多糖(典型的以陽離子洗滌劑復(fù)合物的形式)重新溶解。為了使污染物(例如蛋白質(zhì)、核酸等)最少化，要優(yōu)選的應(yīng)用對(duì)于所述多糖有相對(duì)選擇性的溶劑。己經(jīng)發(fā)現(xiàn)乙醇在這方面有優(yōu)勢(shì)，并且它對(duì)于所述的CTAB-多糖復(fù)合物是高度選擇性的。其它較低的醇也可以應(yīng)用(例如甲醇、l-丙醇、2-丙醇、l-丁醇、2-丁醇、2-甲基-l-丙醇、2-甲基-2-丙醇、二醇等等)。所述乙醇優(yōu)選的加入到多糖沉淀中而產(chǎn)生的最終乙醇濃度(基于乙醇和水的含量)為50%和95%之間(例如大約是55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或大約90%)，優(yōu)選的是在75%和95%之間。所述最適宜的最終乙醇濃度依賴于獲取多糖的細(xì)菌血清組。所述乙醇可以純的形式或用以可混溶的溶劑(例如水)稀釋的形式加入到多糖中。優(yōu)選的溶液是乙醇水混合物，優(yōu)選的比例是在大約70:30和95:5之間(例如75:25，80:20，85:15，90:10)。和配制莢膜多糖的傳統(tǒng)方法相比，乙醇提取后所述的兩個(gè)沉淀步驟更快更簡(jiǎn)單。和在參考資料9中描述的方法相比，所述方法應(yīng)用陽離子洗滌劑比陰離子洗滌劑多。和參考資料10所述的方法不一樣，所述多糖更多的是應(yīng)用乙醇重新溶解，而不是通過應(yīng)用鈣或鎂鹽離子交換。和參考資料ll所述的方法不一樣，沉淀不需要惰性多孔載體。而且，和前面的技術(shù)方法不同，應(yīng)用酒精來重新溶解多糖，而不是將它沉淀。所述細(xì)菌莢膜多糖通常來自奈瑟氏菌屬。優(yōu)選的來自腦膜炎奈瑟氏球菌，包括血清組A，B，C、W135和Y。優(yōu)選的血清組是A、W135和Y。所述方法也適合配制來自流感嗜血菌(泡柳o;/^7M眾/7〃e/7zse)(尤其是B型，或，hib，)和肺炎鏈球菌(5^e/^ococc^/we"/z7o;w'ae)(肺炎球菌)的莢膜多糖。迸一,娜多薪艦薦在重新溶解后，將進(jìn)一步處理多糖來除去雜質(zhì)。這在甚至較小的污染都不能接受(例如人類疫苗產(chǎn)品)的情況中是尤其重要的。這將典型的包括一或多步的過濾?？梢詰?yīng)用深度過濾。這對(duì)凈化特別有用?？梢詰?yīng)用通過活性碳的過濾。這對(duì)于除去色素和示蹤有機(jī)物是有用的。它可以重復(fù)進(jìn)行直至，例如0D肌J0.2?？梢詰?yīng)用篩分過濾(sizefiltration)和超濾。一旦過濾除去了雜質(zhì)，可以將所述多糖沉淀來作進(jìn)一步的處理和/或加工。這個(gè)可通過交換陽離子(例如加入鈣或鈉鹽)方便的完成。所述多糖可以被化學(xué)修飾。例如，它可以被修飾以封固基團(tuán)來替代一個(gè)或多個(gè)羥基。這對(duì)于MenA[12]特別有用。來自血清組B的多糖可以是N-丙酰[13]。所述(任選修飾)多糖將典型的水解以形成寡糖。優(yōu)選的實(shí)施這個(gè)將產(chǎn)生少于30的寡糖的最終平均聚合度(DP)(例如對(duì)于血清組A來說在10和20之間，優(yōu)選的大概是10;對(duì)于血清組W135和Y在15和25之間，優(yōu)選的是15-20;等等)。在疫苗中應(yīng)用的多糖優(yōu)選的是寡糖。DP可以通過離子交換色譜法或比色測(cè)定方便的測(cè)定。如果進(jìn)行了水解，水解產(chǎn)物通常為了除去長(zhǎng)度短的寡糖而被篩選過。這個(gè)可以通過許多的方法來完成，例如在離子交換色譜法后進(jìn)行超濾。對(duì)于血清組A聚合度小于或等于大約6的寡糖優(yōu)選的被除去，對(duì)于W135和Y那些小于大約4的優(yōu)選的被除去。為了提高免疫原性，本發(fā)明的多糖或寡糖優(yōu)選的連接一載體(圖18)。連接到載體蛋白對(duì)于兒科(例如參考資料15)的疫苗特別有用，并且它是一項(xiàng)為人熟知的技術(shù)[例如參考資料16-24評(píng)述的那樣，等等]。優(yōu)選的載體蛋白是細(xì)菌毒素或類毒素，例如白喉或破傷風(fēng)類毒素。所述CRM197白喉類毒素[25，26，27]特別優(yōu)選。其它合適的載體蛋白包括腦膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白質(zhì)[28]，合成肽[29，30]，熱休克蛋白[31，32]，百日咳蛋白質(zhì)[33，34]，細(xì)胞活素[35]，淋巴因子[35]，激素[35]，生長(zhǎng)因子[35]，包含多種人類CD4+T細(xì)胞抗原決定簇的人工蛋白質(zhì)，這些抗原決定簇來自多種病菌衍化抗原[36]，來自流感嗜血菌的蛋白質(zhì)D[37]，來自彎曲桿菌[38]，等。也可能應(yīng)用載體蛋白的混合物。結(jié)合的糖蛋白比例(w/w)優(yōu)選的是在0.5:1(例如蛋白質(zhì)過量)和5:1(例如糖過量)，更優(yōu)選的是那些比例在1:1.25和1:2.5之間。一種單獨(dú)的載體蛋白可以運(yùn)載多種不同的糖類[39]。在和自由載體蛋白連接中可以運(yùn)用結(jié)合[40]。如果需要可以應(yīng)用任何合適的連接物來進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。所述糖類典型的在結(jié)合之前被激活或使之有功能。激活可包括，例如，氰化試劑(cyanylatingreagent)如CDAP(例如1-氰-4-二甲胺吡啶姆四氟硼酸鹽[41，42等])。其它合適的技術(shù)應(yīng)用碳化二亞胺、酰肼、活性酯、降莰垸、P-硝基苯酸、N-羥基琥珀酰胺、S-NHS、EDC、TSTU;也可以見參考22的介紹?？梢詰?yīng)用任何所知的操作通過連接基團(tuán)進(jìn)行連接，例如在參考43和44中描述的操作。一種類型的聯(lián)接包括所述多糖還原性的胺化作用，以脂肪酸連接基團(tuán)末端連接所得的氨基，然后蛋白質(zhì)連接到脂肪酸連接基團(tuán)的另外一個(gè)末端[20，45，46]。其它連接體包括B-丙胺[47]、硝基苯-乙胺[48]、鹵代酰基鹵化物[49]、糖苷連接[50]、6-氨基己酸[51]、ADH[52]、U至C,2部分[53]等等。作為應(yīng)用連接體的一種選擇，可以應(yīng)用直接連接。直接連接到蛋白質(zhì)包括在氧化多糖后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行還原性的胺化，正如例如參考54和55所述的那樣。一種方法也是優(yōu)選的，包括將氨基引入糖類(例如用-NH2替代末端的二0)，然后和脂肪酸酯衍化(例如脂肪酸N-羥基琥珀酰胺雙酯)，并和載體蛋白起反應(yīng)。在結(jié)合后，可以分離出自由并結(jié)合的糖類。有許多種合適的方法，包括疏水色譜法、切線超濾、完全過濾等等[也見參考資料56或57等]。齡麟游潔^激微^欽本發(fā)明的寡糖、多糖和結(jié)合物可和其它的生物分子相混合。來自多種而不是一種腦膜炎奈瑟氏球菌血清組的糖類混合物是優(yōu)選，例如包含來自血清組A+C、A+W135、A+Y、C十W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、C+W135+Y、A+C+W135+Y等等的組合物。優(yōu)選的是單獨(dú)的糖類抗原沒有因?yàn)榻M合而消除它們的保護(hù)效力，雖然實(shí)際的免疫原性(例如ELISA滴度)會(huì)降低。當(dāng)應(yīng)用來自血清組的糖類時(shí)，這優(yōu)選的有約12-約22重復(fù)單位。來自腦膜炎奈瑟氏球菌不同血清組的糖類可以和相同或不同的載體蛋白結(jié)合。當(dāng)一種混合物同時(shí)包含來自血清組A和C的莢膜糖類時(shí)，優(yōu)選的是MenA糖類:MenC糖類的比例(w/w)大于1(例如2:1，3:1，4:1，5:1，10:1或更高)。奇怪的是，當(dāng)MenC組分過量時(shí)(質(zhì)量/劑量)，觀察到MenA組分的免疫原性增加了。當(dāng)混合物包含的莢膜糖類(例如寡糖)來自血清組W135以及至少A、C、Y中的一組時(shí)，驚奇的發(fā)現(xiàn)MenW135糖類的免疫原性在和來自其它血清組的糖類聯(lián)合施用時(shí)比單獨(dú)施用時(shí)大(以相同的劑量，等)[參考資料58]。因此，MenW135抗原引起免疫應(yīng)答的能力要比不和其它血清組抗原聯(lián)合輸入時(shí)，相同等量抗原引起免疫應(yīng)答大。這樣增加的免疫原性的測(cè)定可以通過給照動(dòng)物施用MenW135抗原以及給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物施用混合物，并應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法如殺菌滴度、放射免疫測(cè)定和ELISA等來比較抗體滴度和上述兩種抗原來進(jìn)行。包含血清組W135糖類和其它血清組糖類的協(xié)同組合物疫苗是免疫有效的。它們使得抗-W135的反應(yīng)增加和/或降低了W135的劑量。當(dāng)混合物包含血清組Y和C與W135中的一或兩者的莢膜糖類時(shí)，優(yōu)選的是MenY糖類MenW135糖類的比例(w/w)大于l(例如2:1，3:1，4:1，5:1，10:1或更高)和/或MenY糖類:MenC糖類的比例(w/w)小于l(例如1:2，1:3，1:4，l:5或更低)。來自血清組A:C:W135:Y糖類的優(yōu)選比例是l:l:l:l，1:1:1:2，2:1:1:1，4:2:1:1，8:4:2:1，4:2:1:2，8:4:1:2，4:2:2:1，2:2:1:1，4:4:2:1，2:2:1:2，4:4:1:2和2:2:2:1。所述混合物也包含蛋白質(zhì)。優(yōu)選的包含來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B的蛋白質(zhì)[例如參考資料59-64]或0MV制劑[例如參考資料65-68等]。非腦膜和非奈瑟氏菌抗原，優(yōu)選的是那些不降低對(duì)腦膜組分免疫應(yīng)答的，也包括在內(nèi)。例如參考資料69揭示了來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組B和C的寡糖和Hib糖的組合物。來自肺炎球菌、甲肝病毒、乙肝病毒、百日咳博德特氏菌、白喉、破傷風(fēng)桿菌、幽門彎曲桿菌(Weh'co/A3"erAWor力、脊髓灰質(zhì)炎和/或流感嗜血菌的抗原是優(yōu)選的。特別優(yōu)選的非奈瑟氏菌抗原包括—來自幽門彎曲桿菌如CagA[70-73]、VacA[74，75]、NAP[76，77，78]，HopX[例如79]、HopY[例如79]和/或尿素酶的抗原。一來自肺炎鏈球菌(5Yr印"cocc"s/we咖o/w'3e)的糖類抗原[例如80，81，82]。一來自甲肝病毒，例如無活性病毒的抗原[例如83，84]。一來自乙肝病毒，例如表面和/或核心抗原[例如84，85]，表面抗原優(yōu)選的被吸附到磷酸鋁上[86]。一來自流感嗜血菌B的糖類抗原[例如87]，優(yōu)選的不吸附或吸附到磷酸鋁上[88]?！獊碜员尾《镜目乖璠例如89]?！獊碜粤懿∧紊锨蚓?A^worr力o朋e)的抗原[例如59-62]。一來自肺炎衣原體(6M柳7力'sp"e咖朋"e)的抗原[例如參考資料90-96]。一來自砂眼衣原體(6T^aT^力'strsc力o邁3"'》的抗原[例如97]?！獊碜匝例lP卜啉單胞菌(Forp力7r，o朋s^V^irah's)的抗原[例如98]?！顾杌屹|(zhì)炎抗原[例如99，100]如IPV。一狂犬病抗原[例如101]例如凍干無活性的病毒[例如102，RabAVert]。一麻疹、腮腺炎和/或風(fēng)疹抗原[例如參考資料103的9，10和11章]。一流感抗原[例如參考資料103的19章]，例如血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶表面蛋白質(zhì)。一來自粘膜炎莫拉氏菌(勘raxe^3ca"rr力s7j、)的抗原[例如104]。一來自無乳鏈球菌(&re/&cocc"s^3"c^9e)(B族鏈球菌)的抗原[例如105，106]。一來自釀膿鏈球菌(5Yr印"cocc"sAK^e;7es)(A族鏈球菌)的抗原[例如106，107，108]。一來自金黃色葡萄球菌(6Y邵AWococczass"re"s)的抗原[例如109]。一來自副粘病毒如呼吸道合胞病毒(RSV[110，111])和/或副流感病毒(PIV3[112])的抗原?！獊碜蕴烤已挎邨U菌(^a"""s朋t力n^s)[例如113，114，115]的抗原。一來自B族蟲媒病毒家族(黃病毒屬)的抗原，例如黃熱病毒、日本腦炎病毒、四種血清型的登革熱病毒、蜱傳播的腦炎病毒、西尼羅河病毒。一黏膜疾病病毒抗原，如來自經(jīng)典的豬熱病毒、牛病毒性腹瀉病毒和/或邊緣疾病病毒。10一細(xì)小病毒抗原例如來自細(xì)小病毒B19。一破傷風(fēng)毒素[例如參考資料116]。一百日咳毒素(PT)和來自百日咳博德特氏菌的絲狀血凝素(FHA)，任選的也可以和pertactin禾卩/或凝集原2和3[例如參考資料117和118]聯(lián)合。一細(xì)胞百日咳抗原。所述混合物包含一種或多種這些多抗原，如果需要將它們?nèi)ザ拘?例如通過化學(xué)和/或遺傳方法來除去百日咳毒素的毒性)。當(dāng)白喉抗原包含在混合物中時(shí)，優(yōu)選的也包含破傷風(fēng)抗原和百日咳抗原。相似的當(dāng)破傷風(fēng)抗原包含在混合物中時(shí)，優(yōu)選的也包含白喉抗原和百日咳抗原。相似的當(dāng)百日咳抗原包含在混合物中時(shí)，優(yōu)選的也包含白喉抗原和破傷風(fēng)抗原?；旌衔镏械目乖瓕⒌湫偷母髯砸灾辽賚Pg/ml的濃度存在。通常，任何所述抗原的濃度將足夠產(chǎn)生針對(duì)那個(gè)抗原的免疫應(yīng)答。作為所述混合物中蛋白質(zhì)類抗原應(yīng)用的選擇，編碼抗原的核酸也可以應(yīng)用。所述混合物的蛋白質(zhì)組分就可以被編碼蛋白質(zhì)的核酸替代(優(yōu)選DNA例如以質(zhì)粒的形式)。多鍵微艱本發(fā)明提供了一種免疫原性組合物，它包含血清組A寡糖結(jié)合物和血清組C寡糖結(jié)合物，還包含(i)磷酸鋁或氫氧化鋁佐劑以及(ii)緩沖液。當(dāng)所述組合物包含磷酸鋁佐劑時(shí)，所述緩沖液優(yōu)選的是磷酸緩沖液；當(dāng)它包含氫氧化鋁佐劑時(shí)，所述緩沖液優(yōu)選的是組氨酸緩沖液。當(dāng)所述疫苗包含來自血清組A的莢膜糖類時(shí)，優(yōu)選的在應(yīng)用不久之前將血清組A糖類和其它糖類結(jié)合，這是為了使它的水解最小化(Hib糖)?？梢允寡褰MA組分為凍干形式，其它血清組組分為液體形式，以及在準(zhǔn)備應(yīng)用時(shí)可以用液體組分來重新合成凍干組分，通過這樣方便的達(dá)到目標(biāo)。所述液體組分優(yōu)選的包含一種鋁鹽佐劑，而凍干的血清組A組分可以包含或不包含一種鋁鹽佐劑。因此本發(fā)明提供了一種試劑盒包括(a)來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A凍干形式的莢膜糖類；(b)來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C、W135和Y中的一種或多種(例如l，2，3)的液體形式的莢膜糖類。所述糖類優(yōu)選的和載體蛋白和/或寡糖結(jié)合。所述試劑盒放在兩個(gè)小瓶中。本發(fā)明也提供了一種配制本發(fā)明疫苗組合物的方法，包括將來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A的凍干莢膜糖類和來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C、W135和Y中的一種或多種(例如l，2，3)的液體形式的莢膜糖類相混合。本發(fā)明也提供一種試劑盒包括(a)來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A凍干形式的軛合莢膜寡糖；(b)—種或多種液體形式的更多的抗原。所述更多的抗原可以是或不是來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C的軛合莢膜寡糖。^處微射激艦艱多糖、寡糖和本發(fā)明的結(jié)合物特別適合作為免疫原性組合物和疫苗中的內(nèi)容物。本發(fā)明的方法因此包括配制多糖、寡糖或結(jié)合物為免疫原性的組合物或疫苗的步驟。本發(fā)明提供的組合物或疫苗以這種方法獲得。本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗，除了包含腦膜糖類外，還典型的包含"藥學(xué)上可接受的載體"，它包含任何不會(huì)自己產(chǎn)生對(duì)接受組合物的個(gè)人有害抗體的載體。合適的載體典型的是大的，代謝緩慢的大分子如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、海藻糖[121]、脂質(zhì)聚集物(如油滴或脂質(zhì)體)，以及無活性的病毒微粒。這樣的載體對(duì)于文中那些普通的技術(shù)員來說是熟知的。所述疫苗也可包含稀釋液，如水、鹽水、甘油等等。另外，輔助物如潤(rùn)濕或乳化劑，PH緩沖物質(zhì)等等也可以存在。參考資料122中對(duì)藥學(xué)上可接受的賦形劑進(jìn)行了細(xì)致的討論。用作疫苗的免疫原性組合物包含一定免疫有效劑量的糖類抗原，以及任何上面提及的其它所需組分。"免疫有效劑量"是指以那個(gè)量施用給個(gè)人，要么以單劑量或一組劑量的一部分，它對(duì)治療或預(yù)防是有效的。這個(gè)劑量與以下因素相關(guān)，接受治療者的健康及生理狀況、年齡、接受治療個(gè)人的分類組(例如非人的靈長(zhǎng)類、靈長(zhǎng)類等等)，個(gè)人免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、希望受保護(hù)的程度、疫苗的配制、治療醫(yī)生對(duì)于醫(yī)療環(huán)境的評(píng)估以及其它相關(guān)因素。也期望所述的劑量將在相對(duì)較寬的范圍內(nèi)降下來，這個(gè)范圍可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)決定。用藥治療可以是單劑量表或多劑量表(例如包括加強(qiáng)劑量)。所述疫苗可和其它免疫調(diào)節(jié)劑結(jié)合施用。所述疫苗可和其它免疫調(diào)節(jié)劑結(jié)合施用。所述疫苗也可包括佐劑。提高組合物效果的優(yōu)選佐劑包括，但不局限于(l)鋁鹽(明礬)，如氫氧化鋁(包括氫氧化合物)，磷酸鋁(包括磷酸氫鹽)，硫酸鋁等等[參考資料123中的第8和第9章];(2)水中有油的乳化制劑(帶有或不帶有其它特定的免疫激活劑如胞壁酰肽[胞壁酰肽包括N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酸?；?D-異谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(N-acetyl-匿muramy1-L-alanyl-D-isoglutamine)(nor-MDP)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1，-2，-二棕櫚酰-st甘油-3-羥基磷酸氧基)-乙胺MTP-PE)等]或細(xì)菌細(xì)胞壁組分)，例如(a)MF59TM[參考資料123，124，125中的第10章]，包含5%的鯊烯，0.5%的吐溫80和0.5%的Span85(任選包含MTP-PE)應(yīng)用一種微流化劑將它們配制進(jìn)亞微細(xì)粒，(b)SAF，包含10%的鳘烯，0.4%的吐溫80，5y。聚醚閉塞的聚合物L(fēng)121，以及thr-MDP，它要么微流化入亞微細(xì)粒乳化劑或旋渦產(chǎn)生更大微粒的乳劑，(c)Ribi佐劑系統(tǒng)(RAS)，(RibiI翻露hem，Hamilton,MT)包含2。/。的鯊烯，0.2%的吐溫80，一種或多種細(xì)胞壁組分，它來自包含單磷脂A(MPL)，海藻糖二霉菌酸酯(trehalosedimycolate)(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選MPL+CWS(Detox)的基團(tuán)；(3)皂角甙佐劑[參考資料123的第22章]，如QS21或Sti腿lonTM(劍橋生物科學(xué)，Worcester,MA)，要么以簡(jiǎn)單的形式，要么以從如ISC0Ms產(chǎn)生的微粒形式(免疫刺激復(fù)合物；參考資料123的第23章)，其中ISC0Ms可缺乏另外的洗滌劑例如參考資料126;(4)完全Freund's佐劑(CFA)和不完全Freund's佐劑(IFA);(5)細(xì)胞活素，如白細(xì)胞介素(例如IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-12[127]等等)，干擾素(例如Y干擾素)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，腫瘤神經(jīng)因子(TNF)等等；(6)單磷脂A(MPL)或3-0-脫酰MPL(3dMPL)等，參考資料128和129;當(dāng)和肺炎球菌糖類例如參考資料130—起應(yīng)用時(shí)任選的存在于缺失明礬中；(7)3dMPL和例如QS21禾n/或水中油乳劑的組合物例如參考資料131，132和133;(8)包含CpG圖形的低聚核苷酸(Roman等，淑.#eA1997，3，849-854;Weiner等，/WAS"美國(guó)，1997，94，10833-10837;Davis等，///腳〃/7o厶1998，160，870-876;Chu等，，1997，186，1623-1631;Lipford等，fer.//腳,丄，1997，27，2340-2344;Moldoveanu等，^c"/e，1998，16，1216-1224，Krieg等，船化re，1995，374，546-549;Klinman等，/WAS美國(guó)，1996，93，2879-2883;Ballas等，//厠w/jo/，1996，157，1840-1845;Cowdery等，/7mz7朋o7.，1996，156，4570-4575;Halpern等，Ce2丄T/m"/o丄，1996，167，72-78;Yamamoto等，//w,/C朋cer7fes,，1988，79，866-873;Stacey等，/7/M朋o丄，1996，157，2116-2122;Messina等，//MH朋o丄，1991，147，1759-1764;Yi等，/i/z膽。丄，1996，157，4918-4925;Yi等，1996，157，5394-5402;Yi等，/.力鵬朋o丄，1998，160，4755-4761;以及Yi等，/T/M朋o丄，1998，160，5898-5906;國(guó)際專利申請(qǐng)W096/02555，W098/16247，W098/18810，W098/40100，W098/55495,W098/37919和W098/52581)包含至少一種CG二核苷酸，并且應(yīng)用5-甲基胞嘧啶任選取代胞嘧啶；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯例如參考資料134;(9)和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇[135]結(jié)合的聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性劑或和至少一種另外的非-離子表面活性劑如辛基苯氧基聚乙氧基乙醇結(jié)合的聚氧乙烯垸基醚或酯表面活性劑[136];(IO)—種皂角甙和一種免疫刺激低聚核酸(例如一種CpG低聚核酸)[137];(11)一種免疫刺激劑和一種金屬鹽微粒例如參考資料138;(12)一種皂角甙和一種水中油乳劑例如參考資料139;(13)—種皂角甙(例如QS2D+3dMPL+IL-12(優(yōu)選的+固醇)例如參考資料140;(l條.coli熱不穩(wěn)定內(nèi)毒素("LT")，或它們?nèi)チ硕拘缘耐蛔凅w，如K63或R72變異體[例如參考資料141的第5章；(16)脂質(zhì)體[參考資料123的第13和14章];(17)殼聚糖[例如參考資料124];(18)雙鏈RNA;(19)微粒(例如直徑是約100mn-約150mn的微粒，更優(yōu)選的是直徑是約200nm-約30tim，最優(yōu)選的是直徑約500咖-約10wm)，它們是由生物可降解和無毒性的材料形成的(例如一種聚合物(a-羥基酸)例如聚合物(丙交酯-共-乙交酯)、聚羥基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸內(nèi)酯等等)，它們優(yōu)選的被處理而擁有負(fù)電的表面(例如SDS)或正電表面(例如陽離子洗滌劑如CTAB);或(20)其它物質(zhì)起到免疫激活劑的作用而提高所述組合物的功效[例如參考資料123的第7章]。鋁鹽(尤其是磷酸鋁或氫氧化鋁)和MF59優(yōu)選和本發(fā)明的糖類抗原一起應(yīng)用。當(dāng)應(yīng)用了磷酸鋁，有可能吸附一或多種糖類到鋁鹽，但優(yōu)選的是不吸附糖類到所述鹽，這通過將自由磷酸根離子包含入溶液中而促成(例如通過應(yīng)用磷酸緩沖液)。當(dāng)應(yīng)用氫氧化鋁時(shí)，優(yōu)選的是將糖類吸附入鹽。將氫氧化鋁應(yīng)用為佐劑對(duì)于來自血清組A的糖類特別有用。也可能在本發(fā)明的組合物中吸附一些抗原入氫氧化鋁但由其它的抗原和磷酸鋁連接。對(duì)于四價(jià)腦膜炎奈瑟氏球菌血清組組合物，例如應(yīng)用下面的排列血清組<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>一旦配制好，本發(fā)明的組合物可以直接施用到受試者。接受治療的受試者可以是動(dòng)物；特別，人類受試者可接受治療。所述疫苗特別適合小孩和十幾歲的青少年的接種。它們可以通過系統(tǒng)和/或粘膜輸入。典型的，所述免疫原性組合物配制為可注射的，要么是溶液要么是懸浮液；溶液和懸浮液合適的固體形式以及在注射前的液態(tài)賦形劑也應(yīng)配制。所述制劑也可以乳化或裝入脂質(zhì)體來提高佐劑作用。直接輸入所述組合物通常是胃腸道外(例如通過皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射或輸入到組織的間質(zhì)部位)。所述組合物也可以施用到傷口。其它的給藥方式包括口服和肺部給藥，栓劑和經(jīng)真皮或經(jīng)表皮應(yīng)用(例如見參考資料143)，針和無痛皮下噴射器。藥物治療可以是單劑量計(jì)劃或多劑量計(jì)劃(例如包括激發(fā)劑量)。本發(fā)明的疫苗優(yōu)選是無菌的。它們優(yōu)選是無致熱原的。它們優(yōu)選是緩沖液例如在pH6-pH8之間，通常大約是7。當(dāng)疫苗包含一種氫氧化鋁鹽時(shí)，優(yōu)選的應(yīng)用組胺緩沖液[144]。本發(fā)明的疫苗包含低濃度的洗滌劑(例如吐溫，如吐溫80)(例如<0.01%)。本發(fā)明的疫苗包含糖醇(例如甘露醇)或海藻糖，例如濃度大約是15mg/ml，特別當(dāng)它們被凍干時(shí)。個(gè)體抗原最佳劑量可以經(jīng)驗(yàn)性的估計(jì)。通常，然而本發(fā)明的糖類抗原給藥的劑量為每劑量每種糖0.卜100ng，典型的劑量體積是0.5ffll。典型的劑量是每劑量每種糖5-20ug。這些值是作為糖類測(cè)定的。根據(jù)本發(fā)明，疫苗是預(yù)防性的(如防止感染)或治療性的(例如在感染后治療疾病)，但典型的是治療性的。本發(fā)明提供了一種增加病人免疫應(yīng)答的方法，包括對(duì)病人施用本發(fā)明的疫苗。所述免疫應(yīng)答優(yōu)選的預(yù)防腦膜疾病，包括體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。所述病人優(yōu)選的是兒童。所述方法會(huì)增加已經(jīng)預(yù)先準(zhǔn)備好抵御腦膜炎奈瑟氏球菌病人的回憶應(yīng)答。本發(fā)明也提供應(yīng)用本發(fā)明的多糖、寡糖或結(jié)合物來制造一種增加動(dòng)物免疫應(yīng)答的藥物。所述藥物優(yōu)選的是一種免疫原性組合物(例如疫苗)。所述藥物優(yōu)選的來預(yù)防和/或治療由奈瑟氏菌屬(例如腦膜炎、敗血病、淋病等)引起的疾病，由流感嗜血菌(例如中耳炎、氣管炎、肺炎、蜂窩織炎、心包炎、腦膜炎等)，或由肺炎鏈球菌(如腦膜炎、膿血癥、肺炎等)引起的疾病。因此所述預(yù)防和/或治療細(xì)菌性腦膜炎是優(yōu)選的。疫苗可以在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型中試驗(yàn)(例如見參考資料145)。本發(fā)明也提供了溶解沉淀的細(xì)菌莢膜多糖的方法，其中乙醇被用作溶劑。敘所述名詞"包含"的意思是"包括"也有"含有"的意思，例如一種"包含"X的組合物可以只含有X或包括其它的附加物例如X+Y。、所述名詞"大約"和數(shù)值x的關(guān)系是，例如x士10呢。蕭/微圖1顯示了各種乙醇的作用多糖溶解水的比例。圖2-4顯示了在小鼠中獲得的針對(duì)寡糖類抗原的IgG滴度圖2顯示了應(yīng)用血清組A寡糖的結(jié)果；圖3顯示了血清組Y的結(jié)果；圖4顯示了血清組W135的結(jié)果。圖5顯示了在有血清組A和C寡糖結(jié)合混合物的小鼠中獲得的后-IIIgG滴度圖5a顯示了抗血清組A反應(yīng)；圖5b顯示了抗血清組C反應(yīng)。圖6-8顯示了在有血清組C、W135和Y寡糖結(jié)合混合物的小鼠中獲得的IgG滴度圖6顯示了抗血清組W135反應(yīng)；圖7顯示了抗血清組Y反應(yīng)；圖8顯示了抗血清組C反應(yīng)。圖9-11顯示了在有血清組A、C、W135和Y寡糖結(jié)合混合物的小鼠中獲得的后-IIIgG滴度圖9顯示了抗血清組W135反應(yīng)；圖10顯示了抗血清組Y反應(yīng)；圖ll顯示了抗血清組A反應(yīng)。圖12是在不同的水解時(shí)間應(yīng)用試驗(yàn)MenA多糖標(biāo)本獲得的校準(zhǔn)曲線。所述曲線顯示聚合程度的倒數(shù)和旋光強(qiáng)度之間的直線關(guān)系。圖13是在不同的水解時(shí)間應(yīng)用試驗(yàn)MenY多糖標(biāo)本獲得的校準(zhǔn)曲線。所述曲線顯示聚合程度的對(duì)數(shù)和KD(分布系數(shù))之間的直線關(guān)系。圖14-16顯示了被IgG亞類分離的后-nIgG滴度，它在用血清組:(14)A;(15)C;(16)W135和(17)Y寡糖結(jié)合物接種的小鼠中獲得。圖17顯示了被IgG亞類分離的后-IIIgG滴度，它在用寡糖結(jié)合物四價(jià)混合物接種的小鼠中獲得。圖18闡述了配制寡糖結(jié)合物。圖19顯示了在幾內(nèi)亞豬模型中獲得(A)抗-MenA禾n(B)抗-MenCGMT(土95。/?？尚艆^(qū)間)。條圖上面的數(shù)值是血清殺菌測(cè)定(SBA)滴度，例如血清稀釋液的倒數(shù)導(dǎo)致殺死50%。200910128140.6說明書第13/35頁實(shí)施本發(fā)明的方式A麟多柳縦艦錄血清組A、W135和Y腦膜炎球菌在含有150mlFranzA介質(zhì)的500ml的燒瓶中，處于35土rC持續(xù)12小時(shí)生長(zhǎng)。應(yīng)用35mm的扳動(dòng)震蕩器(throwShaker)將攪動(dòng)設(shè)置在150rpm。然后將85ml的培養(yǎng)物接種在包含Watson介質(zhì)的20L發(fā)酵罐中。在18.5小時(shí)(W135和Y)或16.5小時(shí)(A)后，當(dāng)達(dá)到0D二10時(shí)，發(fā)酵罐加入300ml的福爾馬林，然后保溫2小時(shí)后，將發(fā)酵罐冷卻至1(TC。通過離心后過濾(0.22iim)并用30kDa的膜超濾來收集上清液。所述粗濃度多糖然后通過加入lOOmg/mlCTAB水溶液沉淀。下表顯示了所加入的體積。在室溫下12小時(shí)，通過離心將所述CTAB復(fù)合物恢復(fù)。所述CTAB復(fù)合物通過在室溫16-20個(gè)小時(shí)積極攪拌下加入95%的乙醇溶液來提取。下表顯示了加入的乙醇體積<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>所得懸浮液通過CUNO10SP深度過濾器過濾。所述濾液通過CUNOzatacarbon濾筒回流直至OD275<0.2。然后收集所述Z碳濾液并通過0.22ym的過濾器過濾。最終通過加入CaC122M水溶液(10-12ral/lEtOH終溶液)使得所述多糖從乙醇中沉淀出來。然后通過離心，用95%的乙醇洗滌并在真空中脫水而收集到所述提純了的多糖。在其它的實(shí)驗(yàn)中，用作提取的乙醇最終濃度是變化的(圖1)。對(duì)于血清組A多糖，在80%-95%范圍的乙醇是最有效的，更低的百分比時(shí)提取效率下降。對(duì)于血清組W135，較好的提取在乙醇濃度為75%-90%之間獲得，95%就會(huì)變的不那么有效。對(duì)于血清組Y，最好的結(jié)果在乙醇濃度為75%-85%之間獲得，更高的百分比(例如90%，95%)就不那么有效了。大體上，已經(jīng)注意到，如果乙醇濃度低于這里提及的那些，就容易導(dǎo)致同時(shí)提取雜質(zhì)如蛋白質(zhì)。本段給出的乙醇百分比表達(dá)為最終濃度(乙醇占乙醇+水總體積的百分比)，并依賴于通過大約50%離心(例如500gH20/kg濕糊劑)恢復(fù)的CTAB-多糖糊劑中水的含量。這個(gè)值在小型擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)中經(jīng)驗(yàn)性的測(cè)定。B.血清組A多糖的結(jié)合a)水解所述血清組A腦膜炎鏈球菌多糖在50mM醋酸鈉緩沖液中，pH為4.7在73。C持續(xù)3小時(shí)，發(fā)生水解。為了獲得聚合的平均程度(DP)大約是10的寡糖，控制水解過程，這個(gè)由總有機(jī)磷和磷酸單酯之間的比例(w/w)決定。(總有機(jī)磷)和(磷酸單酯)的DP比例反過來和旋光強(qiáng)度(a)成比例，如圖12所示。應(yīng)用這個(gè)關(guān)系監(jiān)測(cè)水解的程度要比直接磷的測(cè)定方便的多。b)篩分這個(gè)步驟除去了在水解過程中產(chǎn)生的短長(zhǎng)度的寡糖。上面獲得的水解物通過30kDa定點(diǎn)膜(12濾過體積的5mM醋酸鹽緩沖液，pH6.5)超濾。所述的包含高M(jìn)w物質(zhì)的殘留物被丟棄；濾過的物質(zhì)裝填到在pH6.55mM醋酸鹽緩沖液中平衡的Q-S印haroseFastFlow柱上。所述的柱然后用5柱體積(CV)的平衡緩沖溶液洗滌，再用10CVp朋.55mM醋酸緩沖溶液/125NaCl洗滌而除去寡糖使得DP《6。所述篩分的寡糖然后用5CVp朋.55mM醋酸緩沖溶液/125NaCl進(jìn)行洗脫。洗脫的寡糖的數(shù)量有大約15的平均DP。c)在還原末端引入伯氨基將銨鹽(醋酸鹽或氯化物)加入到篩分所得寡糖溶液中使得最終濃度的范圍是49-300g/L，然后加入鈉-氰基-硼氫化物使得最終濃度的范圍是12-73g/L。在將pH調(diào)整為6-7.3后，將混合物在37"條件下保溫5天。所述氨基-寡糖然后通過應(yīng)用lkDa或3kDa定點(diǎn)膜切向流超濾來提純，先應(yīng)用13濾過體積的0.5MNaCl然后應(yīng)用7濾過體積的20mMNaCl。通過參考資料146的步驟分析所述提純的氨基-寡糖溶液磷的含量(抗原的一種化學(xué)活性)，通過參考資料147的步驟分析引入的氨基數(shù)量。所述提純的寡糖然后用旋轉(zhuǎn)脫水器干燥除去水分。d)衍化為活性酯所述干燥的氨基-寡糖溶解在40mM氨基濃度的蒸餾水中，然后加入9體積DMSO再加入三乙基氨使得最終濃度為200mM。將脂肪酸N-羥基琥珀酰胺二酯加入到所得溶液中使得最終濃度為480Mm。所述反應(yīng)在室溫下持續(xù)攪拌2小時(shí)，然后用丙酮(80。/。v/v終濃度)沉淀活性寡糖。通過離心收集所述沉淀物，并用丙酮洗滌多次來除去沒反應(yīng)的脂肪酸N-羥基琥珀酰胺二酯和副產(chǎn)品。最后將寡糖在真空中脫水。引入所述寡糖結(jié)構(gòu)的活性酯基的數(shù)量由參考資料148中描述的比色法決定。e)和CRM197結(jié)合所述活性寡糖加入到45mg/mlCRM197的0.01MpH7.2的磷酸緩沖溶液中，使得活性酯和蛋白質(zhì)的(摩爾/摩爾)比是12:l。所述反應(yīng)在室溫下持續(xù)攪拌一整夜。這個(gè)時(shí)期過后，通過疏水色譜法或切向流超濾將結(jié)合物提純。所述純凈的MenA-CRM197結(jié)合物是在-2(TC或-6(TC下無菌過濾和存儲(chǔ)直至制造疫苗。分析所述結(jié)合物蛋白質(zhì)含量(微BCA蛋白質(zhì)測(cè)定)，MenA糖類含量(磷的比色分析)，自由糖的含量，HPLC的外觀(在TSK凝膠上，G4000SW7.5mmIDx30cm)以及SDS-PAGE。下表顯示了典型制劑的特點(diǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>a)水解W組腦膜炎鏈球菌糖在醋酸50mM醋酸鈉緩沖溶液中水解，pH為4.7在8(TC時(shí)持續(xù)大約3小時(shí)。這導(dǎo)致寡糖的平均DP大約為15至20，這是由唾液酸(SA)和還原的終末SA之間的比例所決定的。所述(總SA)和(還原的終末SA)的DP比例和由HPLC-SEC決定的KD相聯(lián)系，如圖13所示。應(yīng)用這個(gè)關(guān)系來監(jiān)測(cè)水解的程度要比直接SA測(cè)定方便的多。b)篩分所述水解物通過30kDa定點(diǎn)膜(12-20濾過體積的5mM醋酸鹽緩沖液/15-30mMNaClp服.5)超濾。所述的包含高M(jìn)w物質(zhì)的殘留物被丟棄；而濾過的物質(zhì)裝填到在5mM醋酸鹽緩沖液/15-30mMNaClp朋.5中平衡的Q-S印haroseFastFlow柱上。所述的柱然后用10CV平衡緩沖溶液洗滌，來除去寡糖使得DP《3-4并用3CV5mM的醋酸鹽緩沖液/500raMNaClp朋.5洗脫。c)在還原末端引入伯氨基氯化銨或醋酸銨加入大到篩分過的寡糖溶液中使得終濃度為300g/L，然后加入鈉-氰基-硼氫化物使得最終濃度達(dá)到49g/L或73g/L。所述混合物在50。C下保溫3天。所述氨基-寡糖然后通過對(duì)于血清組A所描述的切向流超濾來提純。分析所述提純材料的唾液酸(比色法，根據(jù)參考資料149)和/或半乳糖(HPLC)的含量(所述MenW135抗原的化學(xué)活性)。所述提純的寡糖然后用旋轉(zhuǎn)脫水器干燥除去水分。d)衍化為活性酯所述干燥的氨基-寡糖如上面對(duì)于血清組A的描述那樣衍化。e)和CRM斷結(jié)合結(jié)合如上面對(duì)于血清組A的描述那樣實(shí)施，但是為了提純結(jié)合物，應(yīng)用30kDa膜過濾(50濾過體積的lOmM磷酸緩沖液，pH7.2)。所述純凈的結(jié)合物是在-2(TC或-6(TC下無菌過濾和存儲(chǔ)直至制造疫苗。也分析所述結(jié)合物和上面描述的血清組A的相同參數(shù)。MenW糖的含量通過比色唾液酸測(cè)定來估計(jì)組號(hào)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>".i^籍資y多^^游潛合a)水解Y組腦膜炎鏈球菌糖如上面對(duì)于血清組W135描述的那樣水解。這使得寡糖的平均DP在大約15-20，這是由SA和還原的終末SA(如上面描述的在C(a)下方便的非直接測(cè)定)之間的比例所決定的。b)篩分，c)氨基的引入，d)衍化為活性酯，e)結(jié)合這些步驟如上面對(duì)于血清組W135那樣實(shí)施。所述純凈的結(jié)合物是在-2(TC或-60r下無菌過濾和存儲(chǔ)直至制造疫苗。所述結(jié)合物以上面對(duì)于血清組W135描述的相同方法分析:組號(hào)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>f.吝f錄^欽游應(yīng)資辰絲所述冷凍塊結(jié)合物解凍。在攪拌下各自稀釋，直至終濃度是20yg糖/ml，5mM磷酸，9mg/mlNaCl，磷酸鋁(產(chǎn)生Ar+的濃度為0.6rag/ml)，pH7.2。然后保存混合物，不攪拌在2-8'C下過夜，進(jìn)一步用4ng糖/ml稀釋來用作小鼠的免疫接種。用同樣的方法再為每個(gè)血清組配制第二組疫苗，但加入磷酸鋁被相同體積的水所替代。免疫接種組的10只Balb/c小鼠在周0和4分別注射兩次0.5ml的疫苗。在免疫接種前放血，在第二次劑量前一天以及第二次劑量后的2周。用(a)帶有或不帶有明礬的結(jié)合疫苗，(b)鹽水對(duì)照(c)未結(jié)合的多糖對(duì)照進(jìn)行免疫接種。正如參考資料150中描述的那樣測(cè)定免疫接種過的動(dòng)物血清中特殊的抗-多糖IgG抗體。每個(gè)小鼠的血清都通過滴度曲線進(jìn)行雙重分析，計(jì)算每個(gè)免疫接種組的GMT。應(yīng)用"Titerun"軟件(FDA)以小鼠Elisa單位(MEU)計(jì)算滴度?？?多糖滴度的特異性由競(jìng)爭(zhēng)性ELISA決定，其中相關(guān)的多糖為競(jìng)爭(zhēng)劑。如圖2所示，所述MenA結(jié)合物誘導(dǎo)動(dòng)物中產(chǎn)生高抗體。正如所預(yù)料的那樣，所述未結(jié)合的多糖是沒有免疫原性的。和單獨(dú)應(yīng)用結(jié)合物獲得的滴度相比，帶有磷酸鋁佐劑的結(jié)合物制劑誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的抗體。MenY(圖3)和MenW135(圖4)也能見到相似的結(jié)果。測(cè)定各組IgG亞類的后-II免疫應(yīng)答。應(yīng)用如上面E部分中測(cè)定總IgG滴度的相同ELISA方法來測(cè)定特定的亞類，但應(yīng)用堿性磷酸酶-抗小鼠-IgGl、-IgG2a、-IgG2b或-IgG3(酶)作為次級(jí)抗體。滴度表現(xiàn)為在應(yīng)用血清稀釋1:3200底物形成30分鐘后獲得的0D4。5nm，如圖14(MenA)，15(MenW135)和16(MenY)所示。反應(yīng)主要存在于亞類IgGl，它是小鼠中主要由T-依賴抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的亞類。因?yàn)槎嗵鞘遣荒芤鹈庖哂洃浀南忍斓腡-獨(dú)立抗原，這些數(shù)據(jù)顯示結(jié)合已經(jīng)有了理想的效應(yīng)。應(yīng)用活體外的測(cè)定來測(cè)定補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)菌溶解，通過這個(gè)來測(cè)試后-n血清的殺菌活性。后-II血清在應(yīng)用于測(cè)定之前在56。C下失活30分鐘，259d幼兔補(bǔ)體用作補(bǔ)體源。殺菌滴度表達(dá)為相應(yīng)的血清稀釋液導(dǎo)致50%細(xì)菌被殺死，針對(duì)以下株MenAG8238，Al，F(xiàn)6124;MenW1355554(0Ac+)以及(0Ac-);MenY242975(0Ac-)和240539(0Ac+)。MenA的結(jié)果包括:<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>,.ife/^教合激拔^^e/7C邀會(huì)激游免;^嚴(yán)絲CRM-MenC濃縮塊(來自Chiron疫苗，意大利)和CRM-MenA濃縮塊(如上面描述的獲得)混合，通過攪拌稀釋和混合。制造三種不同的制劑。每個(gè)都包含血清組A20ng糖Ail,但包含不同量的MenC結(jié)合物(i)20ug糖/ral(ii)10yg糖/ml(iii)5"g糖/ml。因此MenA:MenC(w/w)的比例為(i)1:1(ii)2:1(iii)4:1。每種制劑也包含5mM磷酸鈉，9呢/mlNaCl，磷酸鋁(使得Ar'+的濃度為0.6mg/ml)，pH7.2。每種混合物然后保存，不攪拌，在2-8'C下過夜，在小鼠免疫接種前用鹽溶液進(jìn)一步稀釋為1:5。以相同的方法配制第二組疫苗，但加入磷酸鋁被相同體積的水所替代。對(duì)丁6組疫苗的每一組，10只Balb/c小鼠按上面描述的方法接種。對(duì)照組單獨(dú)接受鹽或MenA結(jié)合物。MenA和MenC的抗-多糖抗體如上面描述的那樣測(cè)定。由MenA+MenC結(jié)合物混合獲得的結(jié)果清楚的顯示組分A和C之間的比例(w/w)對(duì)于MenA的免疫原性起到至關(guān)重要的作用。由MenA結(jié)合物對(duì)照組獲得的特定抗-MenApS滴度(帶有或不帶有鋁佐劑)要比相同劑量MenA+MenC組合物的高(圖5a)。如果在組合中應(yīng)用較少量的MenC結(jié)合物，MenA結(jié)合物組分就會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的抗-MenApS滴度。同時(shí)，所述抗-MenC滴度保持可接受的(圖5b)。也應(yīng)用幾內(nèi)亞豬模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用前面相同的磷酸鋁佐劑制造三種不同的制齊U(無定形的羥基磷酸鹽，P04/A1的摩爾比例在0.84-0.92之間，0.6ragAl'+ml):制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>這些制劑用鹽溶液稀釋為1:2，并應(yīng)用來免疫幾內(nèi)亞豬。對(duì)每個(gè)免疫接種組的5只豬(Hartelley系，雌性，450-500克)在第0天和第28天注射兩次0.5ml疫苗。在第一次免疫接種前放血，然后在第42天放血。血清在通過ELISA和血清殺菌測(cè)定(針對(duì)MenA系MK83/94或MenC系Cll)分析之前存儲(chǔ)在-70。C條件下。圖19顯示了結(jié)果。".^獰資C、^^浙r游資^iT艱按照上面描述的將來自血清組C、W135和Y的多糖結(jié)合物混合使得每種結(jié)合物的最終濃度為20ug糖/ml。所述疫苗包含最終濃度的5mM磷酸鈉和9mg/mlNaCl，pH為7.2。在一整夜的存儲(chǔ)過后，所述混合物被稀釋使得每種用來免疫接種的結(jié)合物包含4ug糖/ml。如前面那樣進(jìn)行免疫接種和分析。結(jié)果顯示和單獨(dú)應(yīng)用相比，當(dāng)和MenC和MenY結(jié)合物聯(lián)合施用時(shí)，MenW135結(jié)合物的免疫原性提高了(圖6)。MenY的免疫原性聯(lián)合應(yīng)用和單獨(dú)應(yīng)用相當(dāng)(圖7)，也和MenC結(jié)合物的免疫原性相當(dāng)(圖8)。T^微AC、n釘微激潛按照上面描述的將來自血清組A、C、W135和Y的多糖結(jié)合物混合使得血清組A、W135和Y結(jié)合物的最終濃度為20ug糖/ml，血清組C結(jié)合物的最終濃度為5ug糖/ml。所述疫苗最終包含5mM的磷酸鈉、9mg/ml的NaCl、磷酸鋁(使得Ar的濃度為0.6mg/ml)，pH7.2。所述混合物然后保存，不攪拌，在2-8。C下過夜，進(jìn)一步用鹽溶液稀釋使得A、W135、Y結(jié)合物的濃度為4wg糖/ml，C結(jié)合物的濃度為1yg糖/ml。這個(gè)稀釋混合物用來免疫接種。如前面那樣進(jìn)行免疫接種和分析，對(duì)照組包括單獨(dú)的結(jié)合物，除了血清組C。圖9顯示了，如前那樣，當(dāng)與MenA、MenC和MenY結(jié)合物聯(lián)合施用時(shí)，MenW135結(jié)合物的免疫原性提高了。圖10顯示了MenY結(jié)合物的免疫原性當(dāng)與MenA、MenC和MenW135結(jié)合物聯(lián)合輸入時(shí)沒有明顯的不同。圖11顯示了MenA結(jié)合物的免疫原性在甚至和較低劑量(l/4)的MenC結(jié)合物聯(lián)合施用時(shí)明顯下降了。這種抗原競(jìng)爭(zhēng)性沒有在非-結(jié)合的四價(jià)多糖疫苗(ACWY)中看到[5]。/.茶f游虛獰邀J拔嚴(yán)所述腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A莢膜多糖特別容易水解。MenA莢膜寡糖結(jié)合物所以以凍干的形式配制，準(zhǔn)備在給藥的時(shí)候重組。配制凍干形式使得在重組為單位劑量后有下面組合<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>*無定形的羥基磷酸鹽，P(VA1的摩爾比例在0.84-0.92之間當(dāng)和水重組用來注射時(shí)，所述糖類組分的穩(wěn)定性如下:時(shí)間沃)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>經(jīng)過相同4周時(shí)間的測(cè)定，在2-8。C和36-38°CpH都保持穩(wěn)定，蛋白質(zhì)含量穩(wěn)定在大約24.5yg/ml，水分的含量低于2.5%。當(dāng)和磷酸鋁佐劑溶液重組并在2-8。C下重組時(shí)，穩(wěn)定性如下<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>/虛籍資力、c、^^^r游凝^^^r茶f虛獰資力潛^欽乂MenC、W135和Y組分組成的三價(jià)混合物要么吸附到氫氧化鋁佐劑上(2mg/ml)，要么和磷酸鋁佐劑混合(無定形的羥基磷酸鹽，P04/A1的摩爾比例在0.84-0.92之間，0.6mgArml，存在于10mM的磷酸鹽緩沖液)而配制成。所述的兩種三價(jià)混合物的組成如下<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>*無定形的羥基磷酸鹽，P0VA1的摩爾比例在0.84-0.92之間對(duì)于氫氧化混合物，所述糖類組分的穩(wěn)定'<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>MenW135塊<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>經(jīng)過相同4周時(shí)間的測(cè)定，在2-8。C和36-38°CpH都穩(wěn)定保持在7.15±0.05。對(duì)于磷酸混合物，所述糖類組分的穩(wěn)定性如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>經(jīng)過相同4周時(shí)間的測(cè)定，在2-8。C和36-38。CpH都穩(wěn)定保持在7.05±0.05。所述三價(jià)液態(tài)組合物被稀釋，用0.5ral重組凍干的MenA結(jié)合物。在第0天和28天對(duì)每組10只Balb/c小鼠(雌性6-8周)通過皮下注射所得三價(jià)混合物。所述混合物包含2ug單劑量的每種糖結(jié)合物，為單個(gè)人類劑量(SHD)的1/5。對(duì)照為鹽溶液或未結(jié)合的同源糖。在免疫接種前和在第42天放血，血清存儲(chǔ)在-7(TC。如上所述的那樣測(cè)定IgG。所有應(yīng)用的結(jié)合物在動(dòng)物中都是安全和有免疫原性的。GMT后-IIELISA滴度(95%可信區(qū)間)如下_<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>圖17顯示了IgG亞類分析的結(jié)果，分別對(duì)于(17A)MenA;(17B)MenC;(17C)MenW135;(17D)MenY。IgG明顯是最主要的亞類。血清殺菌滴度如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>僅通過所描述的實(shí)例就可以明白本發(fā)明，有時(shí)可在本發(fā)明的范圍和精神中進(jìn)行修正。參考資料(所述內(nèi)容這里完整引用)Frash(1990)pp.123—145，JoVay7ce51i/^/c^ec/wcJc^icsJiProcessesvol.13(Mizrahi和VanWezel編輯)A雇nd等(1982)/.腸丄10:335-339Cadoz等(1985)Kacche3:340-342MMWR(1997)46(RR-5)1-10Baklaic等(1983)T//ec^iffl邁朋.42:599-604Costantino等(1992)fecc眾e.10:691-698W002/00249Inzana(1987)T/Lfect55:1573-1579[9]W098/32873[10]美國(guó)專利4，753，796歐洲專利0072513[12]英國(guó)專利申請(qǐng)0207117.3[13]Pon等(1997)/^^ifet/185:1929-1938[14]Ravenscroft等(1999)Kgcci;e.17:2820-2816[15]Ra固y等(2001)Z露"357(9251):195-196[16]Lindberg(1999)Kacc^e.17Suppl2:S28-36Buttery和Moxon(2000)/TPCb^尸力yw'cia77sZot(/34:163-168Ahmad和Chapnick(1999)/"/e"Afert力^歷13:113-133，viiGoldblatt(1998)/必'crc^io義47:563-567歐洲專利0447508美國(guó)專利5，306，492W098/42721Dick等，C'卿te(^cci腳(Cruse等編輯)Karger，Basel,1989，巻10，頁48-114Hermansonjioco/u'卿te7ec力/2勿"e51，AcedemicPress,SanDiego(1996)ISBN:0123423368Anonymous(2002，1月)/e卿rc力Z^cJ歸re，453077Anderson(1983)/鵬肌39(1):233-238Anderson等(1985)/67hi77yeW76(1):52-59EP-A-0372501EP-A-0378881EP-A-0427347W093/17712W094/03208W098/59668EP-A-047imW091/01146Falugi等(2001)f"r//順MW31:3816-3824WO00/56360WO00/61761W099/42130W096/40242Lees等(1996)(^cc77e14:190-198WO/9508348美國(guó)專利4，882，317美國(guó)專利4，695，624ifo丄T/孤朋o丄，1985，22，907-919EP-A-0208375W000/10599Gever等，Med.Microbiol.Immunol，165:171-288(1979)[49]美國(guó)專利4，057，685美國(guó)專利4，637，574;4，761，283;4，808，700[51]美國(guó)專利4，459，286[52]美國(guó)專利4，965，338[53]美國(guó)專利4，663，160[54]美國(guó)專利4，761，283美國(guó)專利4，356，170Lei等(2000)"eK(Sase7力03:259-264W000/38711;美國(guó)專利6，146，902McLeodGriffiss等(1981)34:725-732W099/24578W099/36544W099/57280WO00/22430Tettelin等(2000)5""'置e287:1809-1815[64]Pizza等(2000)5b上朋ce287:1816-1820[65]W001/52885BJune等(1991)Z朋cet338(8775):1093-1096[67]Fukasawa等(1999)^cci"el7:2951-2985[68]Rosenqvist等(1998)"ey.Wa/^92:323-333[69]W096/14086Covacci和Rappuoli(2000)/i/ec/.19:587-592W093/18150Covacci等(1993)斤oc.tVs"Jc^/.5bi.,90:5791-5795Tummuru等(1994)fe/ect.7/7m/幾61:1799-1809Marchetti等(1998)Kacci/7e16:33-37Telford等(1994)/#ed179:1653-1658Evans等(1995)f朋el53:123-127W096/01272和W096/01273，尤其SEQIDN0:6W097/25429W098/04702Waston(2000)尸e力'a^"T/j/ect"is/19:331-332[81]Rubin(2000)尸eo7strC7i/7vVorz^47:269—285，v[82]Jedrzejas(2001)#icro^z'W#。7腸7化k65:187-207[83]Bell(2000)尸eJi^rT/7/ectZ^'s/19:1187-1188[84]Iwarson(1995)J/W/S103:321-326[85]Gerlich等(1990)Kacc^e8S卿1:S63-68禾口79-80[86]W093/24148Costantino等(1999)^c"7e17:1251-1263[88]W097/00697Hsu等(1999)C7i"^Ver■3:901-915[90]W002/02606Kalman等(1999)〃a"refe/2"j'cs21:385-389Read等(2000)7V""eic力c油Wes28:1397-406Shirai等(2000)/T//"ec^181(S叩pl3):S524-S527W099/27105WO00/27994W000/37494W099/28475Ross等(2001)rac"/e19:4135-4142Sutter等(2000)/WiMrC7i/7加47:287-308Zimmerman和Spann(1999)J/zFs/"尸力;^ici朋59:113-118，125-126Dreesen(1997)l^cci/w15Suppl:S2-6M/附iforts〗股"1998，1月16日；47(1):12，19[103]fecci臘(1998)Plot.kin和Mortimer編輯.ISBN0-7216-1946-0[104]McMichae1(2000)Kscw'/2e19S叩pl:S101-107[105]Schchat(1999)Lancet353(9146):51-6[106]W002/34771Dale(1999)fo/ect歷、C7i/13:227-43，viiiFerretti等(2001)尸愿,98:4658-4663Kuroda等(200lU朋c"357(9264):1225-1240;也見1218-1219頁Anderson(2000)K3c"V7e19Suppl:S59-65Kahn(2000)C釘加./7/Wj'*12:257-262Crowe(1995)^cci/e13:415-421/7"面W7bjo'co2(2001)39:85—100Demicheli等(1998)Kscci/e16:880-884St印anov等(1996)/歷'Mec力77^44:155—160Wassilak禾口Orenstein，Kgcci/7es第4章(Plotkin禾口Mortimer編輯)，1998[117]Gustafsson等(1996)A￡>7^7./#ed334:349-355[118]Rappuoli等(1991)7TW7H^9:232-238[U9]W097/28273Lieberman等(1996)//4湖275:1499-1503[121]WO00/56365Germaro(2000)yfe邁i/gto/,'7力e^cj'eycea^(/尸ractice尸力ar/H3cy.201edISBN:0683306472Facc眾e(1995)Powell禾卩Newman編輯.ISBN:030644867X.PlenumW090/14837美國(guó)專利6，299，884WO00/07621W099/44636GB-2220221EP-A-0689454W000/56358EP-A-0835318EP-A-0735898EP-A-0761231W099/52549W001/21207W001/21152WO00/628O0W000/23105W099/11241W098/57659DelGuidice等(1998)i/Wec〃"r^s/ec"#ev//c^7e，巻19，No.1W099/27960W098/20734英國(guó)專利申請(qǐng)0118249.2W001/30390Chen等(1956)^朋丄(1956)28:1756-1758[147]Habeeb等(1966)力朋丄A'o7c/e瓜14:328-336[148]Miron和Wilchek(1982)^朋丄腸7c力e瓜126:433-435[149]Svennerholm(1957)歷'o7c力e瓜Az'叩//s.//cfa24:604—611[150]Carlone等(1992)/67i/.必'crt^io義30:154-159權(quán)利要求1.一種將細(xì)菌莢膜多糖與載體蛋白結(jié)合的方法，該方法包括純化所述多糖，包括以下步驟(a)用一種或多種陽離子洗滌劑使所述多糖沉淀，然后(b)用醇使沉淀的多糖溶解；將所述多糖與載體蛋白結(jié)合，其中所述載體蛋白是細(xì)菌毒素或類毒素，其中所述結(jié)合采用連接物，其中所述細(xì)菌莢膜多糖來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、W135或Y，或來自流感嗜血菌，或來自肺炎鏈球菌。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其中陽離子洗滌劑包含十六烷基三甲基銨鹽、四丁銨鹽、十四烷基三甲銨鹽和/或海地美溴銨。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中用于步驟(b)的醇包括乙醇，其中所述乙醇的最終濃度為50-95%。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其中純化還包括步驟(c):處理步驟(b)得到的多糖，以除去雜質(zhì)。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中步驟(c)包括一步或多步過濾。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中步驟(c)包括深度過濾、通過活性碳的過濾、篩分過濾和/或超濾。7.如權(quán)利要求1或4所述的方法，其中使步驟(b)或步驟(c)得到的多糖沉淀。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中沉淀方法是加入鈣鹽或鈉鹽。9.如權(quán)利要求1或4所述的方法，其中所述糖在結(jié)合前被激活。10.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述糖在結(jié)合前被激活。11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中激活采用氰化試劑。12.如權(quán)利要求12所述的方法，其中激活采用氰化試劑。13.如權(quán)利要求1或4所述的方法，其中結(jié)合的糖的糖蛋白重量比為0.5:1至5:1。14.如權(quán)利要求7所述的方法，其中結(jié)合的糖的糖蛋白重量比為O.5:l至5:1。15.如權(quán)利要求9所述的方法，其中結(jié)合的糖的糖蛋白重量比為0.5:l至5:1。16.如權(quán)利要求1或4所述的方法，其中所述載體蛋白是白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素。17.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述載體蛋白是白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素。18.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述載體蛋白是白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素。19.如權(quán)利要求1或4所述的方法，其中在結(jié)合后，分離游離的和結(jié)合的糖類。20.如權(quán)利要求7所述的方法，其中在結(jié)合后，分離游離的和結(jié)合的糖類。21.如權(quán)利要求9所述的方法，其中在結(jié)合后，分離游離的和結(jié)合的糖類。22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中分離采用疏水色譜法、切線超濾或滲濾。23.如權(quán)利要求1或4所述的方法，它還包括將結(jié)合物與其它生物分子混合以得到來自多組腦膜炎奈瑟氏球菌血清組的糖混合物的步驟。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中將來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、C、W135和/或Y的糖抗原混合。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述混合得到一組合物，該組合物包含來自血清組A和血清組C的莢膜糖類，MenA糖與MenC糖的重量比為2:1。26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述混合得到一組合物，該組合物包含來自血清組Y的莢膜糖類以及來自血清組C和W135之一或兩者的莢膜糖類，其中MenY糖:MenW135糖的重量比大于1和/或MenY糖:MenC糖的重量比小于1。27.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述混合得到一組合物，該組合物包含來自血清組A、C、W135和Y的莢膜糖類，其中血清組A:C:W135:Y重量比為1:11:1，1:1:1:2，2:1:1:1,4:2:1:1,8:4:2:1,4:2:1:2,8:4:1:2,4:2:2:1，2:2:1:1，4:4:2:1，2:2:1:2，4:4:1:2或2:2:2:1。28.—種將細(xì)菌莢膜多糖與載體蛋白結(jié)合的方法，該方法包括純化所述多糖，包括以下步驟(a)用一種或多種陽離子洗滌劑使所述多糖沉淀，然后(b)用醇使沉淀的多糖溶解；將所述多糖與載體蛋白結(jié)合，其中所述載體蛋白是細(xì)菌毒素或類毒素，將與細(xì)菌毒素或類毒素結(jié)合的來自腦膜炎奈瑟氏球菌菌株A、C、W135和/或Y的糖抗原混合，其中所述細(xì)菌莢膜多糖來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A、W135或Y，或來自流感嗜血菌，或來自肺炎鏈球菌。29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中結(jié)合采用連接物。30.如權(quán)利要求28所述的方法，其中結(jié)合的糖的糖蛋白的重量比為0.5:1至5:1。31.如權(quán)利要求28所述的方法，其中載體蛋白是白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素。32.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述混合得到一組合物，該組合物包含多組腦膜炎奈瑟氏球菌血清組的糖的混合物，其中所述組合物包含來自血清組A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、C十W135+Y或A+C+W135+Y的糖。33.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述組合物包含來自血清組A和C的糖，且MenA糖MenC糖的重量比為2:1。34.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述組合物包含來自血清組Y的莢膜糖以及來自血清組C和W135之一或兩者的莢膜糖，其中MenY糖與enW135糖的重量比大于1,禾口/或MenY糖和MenC糖的重量比小于1。35.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述組合物包含來自血清組A、C、W135和Y的莢膜糖，其中血清組A:C:W135:Y重量比1:1:1:1，1:1:1:2，2:1:1:1,4:2:1:1,8:4:2:1，4:2:1:2，8:4:1:2,4:2:2:1，2:2:1:1，4:4:2:1,2:2:1:2，4:4:1:2或2:2:2:1。36.—種將細(xì)菌莢膜多糖與載體蛋白結(jié)合的方法，該方法包括純化所述多糖，包括以下步驟(a)用一種或多種陽離子洗滌劑使所述多糖沉淀，然后(b)用醇使沉淀的多糖溶解；將所述多糖與載體蛋白結(jié)合，其中所述載體蛋白是細(xì)菌毒素或類毒素，與來自腦膜炎奈瑟氏球菌菌株A、C、W135和/或Y的糖抗原混合，得到一混合物，其中MenY糖與MenW135糖的重量比大于1，和/或MenY糖與MenC糖的重量比小于1，其中所述細(xì)菌莢膜多糖來自腦膜炎奈瑟氏球菌，或來自流感嗜血菌，或來自肺炎鏈球菌。37.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，它還包括配制疫苗的步驟，該步驟包括將糖抗原與佐劑混合，所述佐劑是磷酸鋁和/或氫氧化鋁。全文摘要沉淀的細(xì)菌莢膜多糖可以通過應(yīng)用溶劑酒精而有效的再溶解。本發(fā)明提供了一種提純細(xì)菌莢膜多糖的方法，它包括的步驟有(a)沉淀所述多糖，接著(b)用乙醇使沉淀的多糖增溶。步驟(a)中可應(yīng)用CTAB。優(yōu)選經(jīng)水解和篩分后獲得的材料可以連接到載體蛋白上而制成疫苗。同樣，在包含來自血清組A和C的多糖的疫苗中，本發(fā)明指出MenA糖和MenC糖的比例(w/w)是＞1的。文檔編號(hào)A61K39/102GK101524534SQ200910128140公開日2009年9月9日申請(qǐng)日期2002年6月20日優(yōu)先權(quán)日2001年6月20日發(fā)明者P·科斯坦蒂諾申請(qǐng)人:諾華疫苗和診斷有限公司