專利名稱：一種氯法齊明用于治療結(jié)核病的藥物新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物的新用途，特別涉及一種氯法齊明的藥物新用途。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是結(jié)核桿菌引起的慢性傳染病，目前約有占世界1/3的人口感染 過結(jié)核菌。我國結(jié)核病疫情也呈蔓延趨勢，具有患病率高、耐藥率高等特點， 為全球結(jié)核病高負擔(dān)國家之一。
.氯法齊明是10-(對T氯苯基)-2， 10-二氫-3-(對-氯苯氨基)-2-異丙亞胺 基吩嗪，按干燥品計算，含(]2晶2(:1凡不得少于98.0%，曾用名為氯苯吩嗪， 氯法齊明為棕紅色或紅褐色的結(jié)晶或結(jié)晶性粉末；無臭。氯法劑明為抗麻風(fēng) 藥，對麻風(fēng)桿菌、潰瘍分枝桿菌有抑制和殺滅作用，此外還具有抗炎作用， 對治療和預(yù)防II型麻風(fēng)反應(yīng)結(jié)節(jié)性和多形性紅斑等均有效。其抗菌作用可 能通過干擾麻風(fēng)桿菌的核酸代謝，與其DNA結(jié)合，抑制依賴DNA的RNA聚合 酶，阻止RNA的合成，從而抑制細菌蛋白的合成，發(fā)揮其抗菌作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開一種藥物用于治療結(jié)核病的新用途。
.本發(fā)明目的是通過郊下技術(shù)方案實現(xiàn)
本發(fā)明藥物氯法齊明為10-(對-氯苯基)-2， 10-二氫-3-(對-氯苯氨
基)-2-異丙亞胺基吩嗪，按干燥品計算，含(:2晶2(:12仏不得少于98.0%。
按藥劑學(xué)方法，將本發(fā)明藥物氯法齊明制備成多種臨床藥物劑型作為治 療結(jié)核病的藥物，包括膠丸、片劑、膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸、蜜丸、丸齊" 顆粒劑、蜜煉膏劑、緩釋制劑、速釋制劑、控釋制劑、口服液體制劑或注射 制劑。
本發(fā)明藥物是一種吩嗪染料，通過與分支桿菌的DNA結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄而產(chǎn) 生抑制分支桿菌生長的效果；它的另外一個重要作用是與P-千擾素合用， 可以恢復(fù)細胞吞噬和殺萆活性的作用，從而成為吞噬細胞的激發(fā)劑，屬于免 疫治療的一部分。下面實驗例和實施例用于進一步說明但不限于本發(fā)明。 實驗例1 氯法齊明治療結(jié)核病的藥效學(xué)實驗
1、 實驗?zāi)康挠^察k法齊明(clofazimine, CLF)在體外及體內(nèi)抗結(jié)核分 枝桿菌的活性，為臨床應(yīng)用提供依據(jù).
2、 實驗材料
菌株結(jié)核分枝桿菌H37Rv (ATCC27294)本研究室保存菌株；30株耐多 藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株均為國家結(jié)核病參比實驗室保存菌株。
試劑培養(yǎng)基稱取7H9培養(yǎng)基(美國Difico公司)4.7g，溶于900ml 蒸餾水中，加入2. Oml甘油，121"C高壓10min，待使用前加入0. 1體積分數(shù) 的營養(yǎng)添加劑白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶(albumin dextrose catalase， ADC)。阿爾瑪藍(Alamar blue);英國Setotec公司產(chǎn)品，4。C避 光保存。二甲基亞砜(D'MSO)分析純，成都化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。
動物SPF級6-8周齡雌性BALB/C小鼠36只，體重為18-20g，購自首 都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。
藥物異煙肼(INH)、利福平(RFP)均為美國Sigma公司產(chǎn)品；氯法 齊明為南京立業(yè)制藥有限公司惠贈。
3、 實驗方法
(l)MIC測定；將200ul滅菌水加入無菌96孔板四周邊的各孔中，防止 培養(yǎng)過程中孔內(nèi)的成分蒸發(fā)。以DMSO或滅菌蒸餾水溶解藥物制成初濃度， 用7H9培養(yǎng)基(不含twecn80)稀釋成所需的濃度，加入無菌96孔板100 p 1，測定對H9 Rv MIC的4藥物終濃度分別為INH: 0.0125、 0.025、 0.05、 0.1、 0.2、 0.4yg/ml; RFP: 0.0125、 0.025、 0.05、 0.1、 0.2、 0. 4^lg/ml; CLF:0.03、 0.06、 0.12、 0.24、 0.48、 0.96、 1.92ug/ml。測定對耐多藥結(jié) 核分枝桿菌臨床分離株MIC的各藥物終濃度分別為INH:1、 5、 10、 20、 40 ug/ml; RFP: 1、 5、 10、 20、 40ug/ml; CLF: 0.06、 0.12、 0.24、 0.48、 0.96、 1.92、 3.84ug/ml。選取H37Rjn 30株耐多藥臨床分離菌株的培養(yǎng)物 制成菌懸液，接種到含0. 05% tween80、 10%ADC的7H9培養(yǎng)基中，37。C靜止 培養(yǎng)1-2周，生長至濁度為MoFarland 1.0 (相當(dāng)于107CFU/ml)時，1: 20 稀釋后加入各孔100ta，菌液的終濃度為106CFU/ml。每板均設(shè)2個不含抗菌藥的生長對照孔，96孔板于37'C孵育。7d后加入生長對照孔20ul 10X Alamar blue和5%tween80 50 u 1的混合液，37。C孵育24h，如果顏色從藍 色變?yōu)榉凵?，則在各實，藥物的孔內(nèi)加入上述量的Alamar blue和tween80 混合液，37'C孵育24h記錄各孔的顏色，藍色孔為無生長，粉紅色孔為有生 長。MIC定義為阻止顏色變化(從藍色變?yōu)榉奂t色)的最低藥物濃度。
(2) 小鼠結(jié)核病模型的建立及治療:選取結(jié)核分枝桿菌H37Rv2-3周的培養(yǎng) 物制成濃度為(5X105) CRJ/ml的菌懸液，36只雌性BALB/C小鼠尾靜脈注 射0.2ml/只，感染菌量105CFU/只。于感染后第2天解剖6只小鼠以提供脾 重、肺重及活菌數(shù)的基礎(chǔ)值。將其余小鼠隨機分成5組，每組6只。并于感 染后第2天開始給藥，空白對照組0.5%羥甲基纖維素鈉(CMC)， IMi組(陰 性對照組)25mg/kg，每周給藥5次;CLF-1組20mg/kg，每周給藥5次;CLF-2 組10mg/kg，每周給藥5次；CLF-3組20mg/kg，每周給藥2次；異煙肼和 氯法齊明均應(yīng)用0. 5%CMC制成混懸液灌胃給藥，給藥至感染后30d。最后1 次給藥后的次日，將各組小鼠處死，進行小鼠脾、肺活菌計數(shù)。活菌計數(shù)方 法記錄小鼠體重，無菌操作下解剖，取脾、肺分別勻漿，加入生理鹽水制 成組織混懸液，分別取小鼠脾、肺的組織混懸液系列10倍稀釋，取O. lml 接種于改良羅氏培養(yǎng)基，各樣品的各濃度接種3支，37'C培養(yǎng)4周。觀察細 菌生長情況，計算活菌數(shù)(CFU)。
(3) 統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以又士S表示，采用SPSS11.0軟件，組間比較采 用單因素方差分析，LSD方差分析法，P〈0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
4、實驗結(jié)果 (l)最低抑菌濃度結(jié)i
氯法齊明對結(jié)核分枝桿菌^Rv的MIC是0. 12-0. 24 u g/ml;異煙肼和利 福平的MIC分別是0. 025、 0. 05 u g/ml;氯法齊明對30株耐多藥結(jié)核分枝桿 菌臨床分離株的MIC范圍為0. 12-1. 92 u g/ml，具體數(shù)據(jù)見表1。表l氯法齊明對30耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的MIC (ug/ml)
菌株 氯法齊明 異煙肼 利福平
25031.92>40>40
24951.9240〉40
25070. 96>40>40
,24320. 96>4040
20321. 92〉40>40
24930. 96105
20620.48〉2010
21990. 48〉2020
21321.92>20>40
21930. 96>20〉40
21770. 48>20〉40
17770. 96>40>40
15750. 4810〉40
26140. 2410〉40
24570. 241010
20300. 1210〉40
24400. 2410>40
21540. 1210>40
23980. 1220〉40
24060. 1210〉40
22890. 1210>40
21630. 2410>40
30600. 1210〉40
25900. 2410>40
29310. 1220〉40
30090. 1210〉40
28570. 2410>40
26280. 2410〉40
26210. 4820>40
24450. 1210>40
(2)小鼠結(jié)核病治療實驗結(jié)果
① 小鼠皮膚黏膜著色情況治療7d左右CLF-1組小鼠雙耳及胸腹部皮 毛開始出現(xiàn)淡紅色，治療30d至結(jié)束實驗時CLF-1組(總劑量400mg/kg)、 CLF-2組(總劑量:200mg/kg)及CLF-3組(總劑量:160mg/kg)小鼠均出 現(xiàn)雙耳及胸腹部皮毛染色，CLF-l最明顯。解剖時可見3組小鼠胸、腹腔的 器官著色，CLF-1組最明顯。整個感染及治療期間小鼠未出現(xiàn)死亡。
② 體重、脾重和肺重情況小鼠感染的第2天，平均體重為(20.88± 0.17) g，平均脾重(0.07±0.01)，平均肺重(0. 15±0.05) g，脾重指數(shù)
60. 003±0. 002，肺重指數(shù)0. 007±0. 002。感染30d后未治療組的小鼠體重、 脾重、肺重分別為(24.09士1.84)g、 (0.46±0. 07) g、 (0.24±0.02) g。脾 重指數(shù)和肺重指數(shù)分別為0. 019±0. 002和0. 010±0. 001，均有明顯增加， 各治療組的小鼠體重與空白對照組無明顯差別，但在脾重、肺重及脾重指數(shù)、 肺重指數(shù)上均低于空白對照組，具有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為46. 64、 27. 57、 58.97、 34.56， p<0. Ol，'具體數(shù)據(jù)見表2。
表2結(jié)核病模型小鼠治療30d各組體重、脾重和肺重情況(X±S)
組別鼠數(shù)體重(g)脾重(g)肺重(g)脾重指數(shù)肺重指數(shù)
空白對照624. 09 ±1.840. 46 ±0. 070. 24 ±0. 020. 019±0. 0020. 010±0. 001
測623. 84±1. 310, 09 ±0. 02"0. 12±0. 01'0. 004 ±0. 001"0. 005±0. 001'
CLF-1623. 24±1.050.17±0. 04*0.13±0. 01'0. 007 ±0. 002'0. 006±0. 001"
CLF-2623. 92±1. 310. 13±0. 03'0. 16 ±0. 02'o. 005 士o. oo r0. 007±0. 0。r
CLF-3624.51±1.090. 24 ±0. 05"0. 18 ±0. 02"0. 010±0. 002"0. 007±0. 001'
F值0. 83746. 6427.5758,9734. 55
P值>0. 05<0.01<0.01<0.01<0. 01
注#P<0.01，與空白對照組相比 .③活菌計數(shù)情況感染的第2天，小鼠全脾活菌數(shù)為(5.61±0. 14) lg CFU,感染30d增加到(7. 14±0. 07) lgCFU。 INH組脾活菌數(shù)較空白對照組低
3. 561gCFU， CLF-1組低2. 251gCFU，而CLF-2組和CLF-3組均低1. 571gCFU。 各治療組與空白對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=130.58，p<0.01)。具體 數(shù)據(jù)見表3。感染的第2天，小鼠全肺活菌數(shù)為(5.24±0.23) log10CFU，感 染30d增至(8.07±0.01) lgCFU。 INH組肺活菌數(shù)較空白對照組低
4. 681gCFU， CLF-1組低2.921gCFU。 CLF-2組低1. 781g CFU， CLF-3組低 1. 391gCFU 。各治療組與空白對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義
(F=74.09，p〈0.01)。具體數(shù)據(jù)見表3
表3結(jié)核病模型小鼠治療30d各組的活菌計數(shù)情況(lg CFU)
組別 鼠數(shù) 全脾活菌數(shù) 全肺活菌數(shù)
空白對照67. 14±0. 078. 07±0. 01
服63. 58±0.15A3. 39±0. 64A
CLF-164. 89±0. 21厶5.15±0. 50A
CLF-265. 57±0. 29A'6.29±0.34A
CLF-365. 57±0. 30A6. 68 ±0, 23A
F值130. 5874. 09
P值<0.01<0. 01注Ap〈0.01，與空白對照組相比 5、實驗結(jié)論體外實驗結(jié)果顯示氯法齊明對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準株以及耐異煙肼和利 福平的耐多藥結(jié)核分枝桿菌有較強體外抗菌作用。其作用機制主要是干擾核 酸代謝及能量代謝，不琴產(chǎn)生耐藥性，與現(xiàn)有抗結(jié)核藥物無交叉耐藥，與細胞色素P450酶沒有內(nèi)在的相互作用。在小鼠結(jié)核病治療模型中顯示，氯法齊明可以將小鼠肺臟中的結(jié)核分枝 桿菌降低1. 8-2. 91gCFU，脾臟中降低1.5-2. 51gCFU，表明具有較好的體內(nèi)抗結(jié)核作用。實驗例2臨床實驗資料選入25位結(jié)核病人，讓其定期服用氯法齊明膠丸，結(jié)果見表4。表4本發(fā)明藥物治療結(jié)核病的臨床實驗資料入組病人有效病例顯效病例無效病例251771比例1 68%28%4%結(jié)果表明，本發(fā)明藥物氯法齊明治療結(jié)核病的有效率和顯效率近96%， 說明氯法齊明具有治療結(jié)核病的功效。下述實施例均能實現(xiàn)上述實驗例的效果。
具體實施方式
實施例l:氯法齊明膠丸氯法齊明加精煉食用植物油研磨成細粉并調(diào)整濃度，混懸制成。含氯法齊明(C27H22C12N4)為標(biāo)示量的90. 0% 110. 0%。 口服，一次50 100mg， 一 曰1-3次，治療結(jié)核病。 實施例2:氯法齊明片'加入常規(guī)輔料按常規(guī)方法制成片劑，口服， 一次50 100mg， 一日1-3 次，治療結(jié)核病。 實施例3:氯法齊明顆粒劑加入常規(guī)輔料按常規(guī)方法制成顆粒劑，口服， 一次50 100mg， 一日卜3 次，治療結(jié)核病。
權(quán)利要求
1、氯法齊明在制備治療結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種氯法齊明用于治療結(jié)核病的藥物新用途，氯法齊明為10-(對-氯苯基)-2，10-二氫-3-(對-氯苯氨基)-2-異丙亞胺基吩嗪，同時也公開了以氯法齊明為制藥原料制備成膠丸、片劑、膠囊劑、滴丸、注射劑等藥物制劑。大量試驗證明本發(fā)明藥物具有治療結(jié)核病的作用，臨床使用安全有效。
文檔編號A61K31/498GK101658523SQ200910131770
公開日2010年3月3日 申請日期2009年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月1日
發(fā)明者余述南 申請人:立業(yè)制藥股份有限公司