一種治療腫瘤的藥物及其應用的制作方法

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專利名稱：一種治療腫瘤的藥物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種具有生物活性和代謝穩(wěn)定性的含有血管內皮抑制素的復合物和緩釋制劑以及它的制備方法'本發(fā)明還提供含有這種血管內皮抑制素復合物和緩釋制劑的藥物組合物以及含有這種血管內皮抑制素復合物的試劑盒。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明中的血管內皮抑制素復合物、緩釋制劑、藥物紐合和試劑盒來預防、診斷、治療肝瘤，及制備抗腫瘤藥物的方法。
背景技術：
新生血管形成是指新的毛細血管在原有的血管上的生成。腫瘤的生長和遷移依賴于新生血管的生成，將腫瘤中的微血管內皮細胞作為癌癥治療的靶點為治療腫瘤提供了一種治療方式(Folkman J. N Engl J Med 1971; 285:182-186)。
血管內皮抑制素(Endostatin)是膠原XVDI羧基端的一段分子量大小為20 kDa的酶切產物。1997年美國哈佛大學Judah Fo!kman教授等人在血管內皮瘤細胞的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)此蛋白，它具有抑制血管內皮細胞增殖、遷移，和體內血管生成的活性。進一步實驗發(fā)現(xiàn)重組血管內皮抑制素可以抑制老鼠體內多種胂瘤的生長、轉移，甚至能完全治愈腫瘤，而且不產生耐藥性。其發(fā)揮活性的機理在于它通過抑制血管內皮細胞的生長，抑制了腫瘤組織附近的新生血管的生成，使得腫瘤組織得不到生長所必需的大量營養(yǎng)和氧氣，最后停止生長或壞死(Folkman丄et al. Cell 1997; 88:277-285; Folkman J. et al. Nature 1997; 390:404-407)。通過基因工程制備的重組人血管內皮抑制素可以作為腫瘤治療藥物，其臨床試-瞼表明它可以有效的抑制肝瘤生長。在中國，以非小細胞肺癌為主要適應癥的臨床試驗表明它對于腫謝的治療效果比較突出。
發(fā)明概述多肽和蛋白質類藥物相比于化學藥具有毒副作用小，不產生耐藥性等優(yōu) 點。為了達到最高的體內活性，提高生物利用度，減少藥物體內降解，通常蛋白藥物采用靜脈給藥方式。但是對于分子量小的蛋白來說，通常靜脈給藥以后的體內半衰期4艮短。除了體內的蛋白降解過程以外，一個重要的方面是小分子蛋白能夠通過腎過濾的途徑從體內很快的被消除。在血液中，
水力半徑超過白蛋白或是分子量大于約66,000道爾頓(66 kDa)的蛋白通 ?？梢苑€(wěn)定的保留在循環(huán)系統(tǒng)中.但是小分子卻會通過腎小球過濾被很快的從血液中消除。所以，為了維持小分子量蛋白在血液中的有效治療濃度，需要進行頻繁的注射或點滴。這種治療方式雖然能達到治療的目的，但是卻給病人帶來了嚴重的不便與痛苦，提高了用藥成本，對某些藥物長期的使用還有可能產生一些副作用，例如免疫反應。
作為蛋白藥物的血管內皮抑制素同樣存在半衰期短，體內清除率高的缺點。目前的臨床用藥手段主要為頻繁的靜脈注射或點滴，通常為每天給藥，而且需要長期用藥，這使得病人的精神和經濟負擔都比較大。本發(fā)明的目的就在于改善該蛋白的體內代謝特征，使其具有更高的穩(wěn)定性和較長的體內半衰期，甚至具有更高療效，從而達到可以減少用藥頻率，降低用藥成本，減輕病人的經濟負擔的目的。
用高分子聚合物對蛋白進行修飾，它是改變和控制藥物的動力學特性如半衰期、免疫學特征、毒理特性的常用方法。用來修飾蛋白的高分子聚合物具有水溶性好、生物相容性好、無或弱免疫原性等特征。其中聚乙二醇 (polyethyleneglycol, PEG)是應用最為普遍的一種蛋白修飾分子。聚乙二醇分子具有兩親性，既可以溶解于水，又可以溶解于大多數(shù)的有機溶劑，具有無毒、無免疫原性、在水溶液中有高溶解性等性質，是被包括美國FDA、中國SFDA在內的很多國家的藥品管理機構批準的可用于藥物制備的高分子。將蛋白質與親水性的高分子如聚乙二醇偶聯(lián)，可增加蛋白穩(wěn)定性、減少非特異性吸附和抗原性。當偶聯(lián)物達到一定分子量時，可大大降低腎臟的排除效率，是延長蛋白質藥物體內半衰期的有效方法(Frokjaer S. et al. Nat. Rev. Drug Discov. 2005 Apr 4(4): 298-306; Harris JM. et al, Nat. Rev. Drug Discov. 2003 Mar 2(3): 214-21)。最初的聚乙二醇修飾都是以氨基作為反應位點，主要包括蛋白的N端a-氨基和賴氨酸殘基側鏈上的s-氨基。這一類反應的產物是一個蛋白分子與一個或多個PEG分子偶聯(lián)。對于賴氨酸殘基側鏈e-氨基上的修飾也往往因為反應位點不特異而產生修飾后的同分異構體。目前，針對蛋白N端a-氨基和賴氨酸殘基側鏈e-氨基的等電點差異，又新開發(fā)出了只針對蛋白N端修飾的聚乙二醇修"飾試劑，^使得修飾位點一致，修飾產物組成均一.另一種可用于聚乙二醇修飾的蛋白位點是半胱氨酸的巰基。由于巰基在蛋白中的數(shù)目通常少于氨基，所以這類修飾的位點更加特異。利用基因工程技術，現(xiàn)在可以在蛋白任何部位引入半胱氨酸作為特異的修飾位點。但是此類引入半胱氨酸作為修飾位點也是有一定的局限性，因為對某些本身帶有半胱氨酸的蛋白可能會造成二硫鍵的錯配或無法復性。另外蛋白的羧基也是一種常用的修飾位點(Veronese FM et al. Drug Discov. Today. 2005 Nov 1;10(21):1451-8.)。聚乙二醇修飾技術已經成功地運用在許多蛋白類藥物上，比較成功的包括PEG-天冬酰胺酶(PEG-asparaginase)(Graham ML Adv. Drug Ddiv. Rev. 55， 1293—1302 Avramis Vassilios I. et al. W09939732 and US6689762)、 PEG-腺酐脫氨酶(PEG-adenosine deaminase)( Levy Y et al. J. Pediatr. 113， 312—317; Davis S et al. ClinExp. Immunol, 46: 649-652; Hershfield MS et al. N Engl J Med 316: 589-596)和PEG-干擾素(PEG-interferon a2a、 PEG-interferon a2b等)(Bailon P et al. C. Bioconjug. Chem. 12， 195—202， Wang YS et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 54， 547—570, Meng Xiantai et al. WO2005077421, Van Vlasselaer Peter et al. WO2004076474, Ballon Pascal Sebastian et al. US2004030101, Karasiewicz Robert etal.EP0593868)等等。
其他代表性的高分子修飾劑有葡聚糖、聚蔗糖、淀粉、聚丙氨酸、乙二酸和丙二酸的共聚物、羧曱基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚l，3-乙二醇次甲基醚、乙烯和順丁烯二酰肼的共聚物、多聚唾液酸、環(huán)糊精等。
將血液蛋白或其片段作為載體，與藥用蛋白偶聯(lián)或融合表達，從而起到增加蛋白分子量的目的，是另一種延長藥用半衰期的方法，例如用免疫球蛋白的Fc片段和目的蛋白偶聯(lián)以延長其半衰期，例如將此方法用在Notch 1 受體蛋白(Kitajewsky Jan et al. WO2005U1072)、促紅細胞生成素(EPO) (Gillies Stephen D et al. WO2005063808)、人生長激素(Kim Young Min et al. WO2005047337)等蛋白上。血漿白蛋白也是一種常用的偶聯(lián)載體，可以運用在抗生素類，消炎類，抗氧化物等蛋白上(EzrinAlanMetal. WO0117568, Otagiri Masaki et al. EP1571212)。
10對于某些血液栽體蛋白除了在體外將其與藥物蛋白偶聯(lián)在一起外，還可以先將蛋白藥物在體外進行修飾，使之具有化學反應的活性或是對體內其他分子具有較高的親和力，能夠在進入體內以后和血液某些成分進行反應，形成半衰期較長的大分子或是復合物。一個實例是將此技術運用在抗病毒
的小肽分子anti-RSV上，將其修飾上帶有馬來酰亞胺的活性基團，它可以和血液蛋白或是細月包表面蛋白中的巰基反應(Bridon Dominique P et al. WO0069卯2)。另一個實例是利用?；磻?，在蛋白表面的氨基酸殘基上引入脂肪酸，增加蛋白對體內白蛋白的親和力，使得蛋白進入血液后可以和白蛋白形成較大的復合物，從而達到延長半衰期的目的，這一方法曾用于長效胰島素上(Kurtzhals P et al. Biochem. J. (1995) 312, 725-731; Frokjaer S et al. Nat Rev Drug Discov. 2005 Apr;4(4):298-306)。
另一種延長蛋白體內半衰期的方法是將蛋白做成緩釋劑型。將蛋白藥物放入一種藥用栽體中，使得蛋白從栽體中緩慢釋放，在體內維持一種穩(wěn)定的藥物濃度。常用的方法有水凝膠、微膠囊、微球、微型滲透泵、脂質體等(Peppas NA et al. Eur.丄Pharm. Bioph咖.50， 27~46 (2000); Packhaeuser CB et al. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58， 445~455 (2004); Metselaar JM et al. Mini Rev. Med. Chem. 4， 319~329 (2002))。脂質體是一種具有雙層膜結構的空球形態(tài)的超顯微粒子。該雙層膜由兩親分子多為磷脂構成并有水性的內腔。將親水性的蛋白藥物包裹在脂質體的內腔中，在體內緩'It釋放，可以維持蛋白的血藥濃度，達到增加半衰期的作用，一些實例包括用在神經生長因子 (Hou Xinpu et al. CN1616087)、血紅蛋白(Farmer Martha C et al. US4911929) 等。
本發(fā)明結合現(xiàn)有的一些主要藥物修飾技術，提供一種具有較長半衰期的血管內皮抑制素產品，其在保持抑制血管生成的活性的同時，比未修飾的血管內皮抑制素在代謝上具有更高的穩(wěn)定性和更長的體內半衰期，本發(fā)明中的血管內皮抑制素優(yōu)選人血管內皮抑制素。
本發(fā)明的一個具體實施方案涉及一種修飾物與血管內皮抑制素形成的復合物。血管內皮抑制素與修飾物通過共價鍵相連，或是通過非共價鍵相互作用形成穩(wěn)定的復合物。修飾物可以是通過化學偶聯(lián)的方法連接到血管內皮抑制素上的，也可以是通過融合表達的方式和血管內皮抑制素連接到一起的。優(yōu)選的方案中這種修飾是位點特異性的，不會影響血管內皮抑制素的生物活性，例如與受體的結合。該修飾產物具有抗新生血管生成的活性但相比于未修飾的血管內皮抑制素在代謝上更穩(wěn)定，具有更長的血液半衰期，可以作為抗新生血管生成或抗腫瘤的藥物。用于修飾的分子可以是一種或多種生物相容，能增加血管內皮抑制素的血液半表期的高分于聚合物、蛋白質分子或其片段、肽鏈、或者是其他任何形式的化學物質。
這里的高分子聚合物，可以有它自己的生物活性，也可以沒有生物活性。合適的聚合物包括，但不僅限于聚烯醇類化合物、聚醚類化合物、聚乙烯
吡咯烷酮、聚氨基酸、二乙烯基醚與馬來酸酐的共聚物、N-(2-幾丙基-甲基丙烯酰胺(N- (2-Hydroxypropyiymethacrylamide)、多聚糖類、聚氧乙基多醇 (polyoxyethylatedpolyol)、肝素或肝素片段、聚烴基乙二醇及其衍生物、聚烴基乙二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚、聚羥乙基天冬酰胺 (a，P-Poly ((2勿droxyethyl)"DL-aspartamide))、聚羧酸月旨(polycarboxylates)、氧化乙烯和曱醛的共聚物(poly oxyethylene"oxymethylenes)、聚丙烯酰嗎啉 (polyacryloyl morpholines)、氨基化合物與氧化烯烴的共聚物、聚透明質酸、聚環(huán)氧化物(polyoxiranes)、乙二酸與丙二酸的共聚物、聚1,3-乙二醇次甲基醚、乙烯/順丁烯二酰肼共聚物、多聚唾液酸、環(huán)糊精等。
上述的聚烯醇類化合物包括，但不僅限于聚乙二醇(包括單甲基聚乙二醇、單羥基聚乙二醇等)、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚丁烯醇等以及它們的衍生物。在一個優(yōu)選的方案中，修飾物是聚乙二醇，一個更優(yōu)選的方案中，聚乙二醇選用單甲基聚乙二醇。
上述的聚醚類化合物包括，但不僅限于聚烷撐二醇(HO((CH2)xO)。H)、聚
丙二醇、聚氧化乙烯(HO((CH2)20)nH)、聚乙烯醇((CH2CHOH)n)等以及它們
的4汙生物。
上述的聚氨基酸包括，但不僅限于同種氨基酸的聚合物，兩種或兩種以上的氨基酸的共聚物，例如聚丙氨酸。
上述的多聚糖類包括，但不僅限于葡聚糖及葡聚糖衍生物如硫酸葡聚糖、纖維素及纖維素的衍生物(包括曱基纖維素和羧曱基纖維素)、淀粉及淀粉衍生物、聚蔗糖等。
這里適合用作修飾栽體的蛋白分子優(yōu)選天然存在的蛋白或是其片段，包括但不僅限于甲狀腺結合蛋白(thyroxine-binding protein )、轉甲狀腺蛋白 (transthyretin)、轉鐵蛋白(transferring纖維蛋白原、免疫球蛋白、白蛋白等以及它們的片段。上述的栽體蛋白優(yōu)選為人源的。上述蛋白的片段是指任何比該蛋白小但是保持了栽體功能的部分。
血管內皮抑制素與上述修飾物直接或間接共價相連，直接連接指的是血管內皮抑制素的某一個氨基酸和栽體蛋白的某一氨基酸直接相連，可以通過肽鍵或二石克鍵。間接相連指的血管內皮抑制素和載體蛋白通過一定的化學基團或幾個基團的組合連接。
本發(fā)明的一個具體實施方案涉及聚乙二醇修飾的血管內皮抑制素，其特征為一個血管內皮抑制素分子和一個或多個聚乙二醇分子偶聯(lián)。偶聯(lián)的位
點是蛋白的N端a-氨基、賴氨酸殘基側鏈的e-氨基、半胱氨酸的巰基、天冬氨酸殘基側鏈的羧基、谷氨酸殘基側鏈的羧基中的一種或是他們的組合。所有用于偶聯(lián)的聚乙二醇分子可以是線性的，也可以是分叉的，分子量位于1,000到100,000道爾頓之間，優(yōu)選5,000到40,000道爾頓。本發(fā)明中所述的聚乙二醇的分子量是指大約的平均的分子量. 一個優(yōu)選的方案是用聚乙二醇特異的修飾血管內皮抑制素N端的a-氨基，形成單一位點修飾的產物。
本發(fā)明的一個具體實施方案涉及血管內皮抑制素和蛋白或肽鏈的偶聯(lián)，其特征為血管內皮抑制素與一個或多個蛋白或肽鏈直接或間接相連，當與多個栽體蛋白相連時，所選的栽體蛋白之間可以相同也可以是不同的。其中的栽體蛋白優(yōu)選天然存在的蛋白或是其片段。一個優(yōu)選的方案中用于修飾的栽體蛋白為人血清白蛋白或其片段，在另一個優(yōu)選的方案中的栽體蛋白為人免疫球蛋白IgG的Fc片段.
本發(fā)明的另一個具體實施方案中的修飾物為小分子或是小肽或是其他化合物，其特征為能使含有內皮抑制素的復合物具有和血液某些成分反應的能力或是和血液某些成分有較強的親和力. 一種具體化的產物是它具有一個反應活性的基團，可以和血液成分的氨基、羥基、巰基反應形成共價鍵，另一個具體化產物的活性基團是一個馬來酰亞胺，它可以和血液蛋白，例
如白蛋白中的巰基反應.另一個具體化產物是具有和血液某些成分，例如白蛋白、免疫球蛋白等有較強的親和力，可以與之形成一種更大的復合體。本發(fā)明的另一個具體實施方案中的復合物，是其他小分子或是小肽修飾的血管內皮抑制素，可以是血管內皮抑制素被糖基化、磷酸化、?；?后的產物。其中修飾的位點可以是原來蛋白序列中存在的氨基酸，也可以是通過突變產生的氨基酸殘基。該復合物雖然沒有很大的分子量，但是因為修飾改變了血管內皮抑制素的性質從而延長了其半衰期。
本發(fā)明的另一個具體的實施方案涉及一種含有內皮抑制素的復合物，它是由血管內皮抑制素和其他分子通過非共價鍵形成的具有特定組成的復合物分子，其中的修飾物可以是蛋白，小分子等。該復合物具有抑制血管生成的活性，并且在體內有比血管內皮抑制素更長的半衰期。
本發(fā)明的另一個具體的實施方案涉及一種含有血管內皮抑制素的緩釋制刑，它是由血管內皮抑制素或上迷的任一復合物和生物相容的物質形成的。該組合物中的血管內皮抑制素仍然具有生物活性，但是卻可以依靠該載體改變藥物代謝特征達到延長體內保留時間的目的。所述的緩釋制劑為但不僅限于微膠囊、水凝膠、微球、微型滲透泵、脂質體等。
本發(fā)明還提供一種上述含有血管內皮抑制素的復合物或緩釋制劑與藥學上可接受的栽體形成的藥物組合物。本發(fā)明還提供一種上述含有血管內皮抑制素的復合物或緩釋制劑和使用說明組成的試劑盒。
本文4吏用的藥學上可接受的栽體包括對于以所用劑量和濃度與其接觸的細胞或哺乳動物無毒的藥用上可接受的栽體、賦形劑、或穩(wěn)定劑。通常生
理學上可接受的栽體是含水的pH緩沖溶液。生理學上可接受的栽體的例子包括諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、和其他有;f幾酸在內的緩沖液；包括抗壞血酸在內的抗氧化劑；低分子量(不超過10個殘基)多肽；諸如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白等蛋白質；諸如聚乙烯吡咯烷酮等親水性多聚體；諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸等氨基酸；單糖、二糖和包括葡萄糖、甘露糖、或糊精等其他糖類；諸如EDTA等螯合劑；諸如甘露醇或山梨醇等糖醇；諸如鈉等成鹽反離子；和/或諸如TWEEN^、聚乙二醇(PEG)、和？0;110> 05*等非離子表面活性劑.賦形劑優(yōu)選是無菌的且一般不含不良物質.這些組合物可通過常規(guī)的熟知滅菌技術進行滅菌.
本發(fā)明還涉及到制備上述血管內皮抑制素產品的方法。特別的，制備聚乙二醇^^飾的血管內皮抑制素的方法，即將活化的聚乙二醇與血管內皮抑
制素混合，在適當?shù)娜芤?、溫度、pH、摩爾比下反應，并用陽離子柱或是分子篩純化偶聯(lián)產物.其中反應的pH優(yōu)選pH 3-10之間。
本發(fā)明還提供一種上述含有血管內皮抑制素的復合物、緩釋制劑、藥物組合物或試劑盒在預防、診斷或治療腫瘤中的用途。本方法適合的癌癥包說明書第8/19頁
括但不僅限于肺癌、神經內分泌瘤、結腸癌、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、食道癌、口腔癌、鼻咽癌、宮頸癌、肉瘤、腎癌、膽癌、惡性黑色素腫瘤等.
本發(fā)明還提供一種上述含有血管內皮抑制素的復合物、藥物組合物或緩釋制劑在制備抗腫瘤藥物中的用途，
本發(fā)明還提供一種上述含有血管內皮抑制素的復合物、緩釋制劑、藥物組合物或試劑盒在預防、診斷或治療其他疾病和制備治療這些疾病的藥物中的用途，所述疾病的特征為但不限于新生血管異常生成而導致人的組織或器官病變。
在上述的治療腫瘤或其他疾病的用途中，其中的給藥方式選自靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、透皮吸收、皮下包埋、肝動脈注射、口服、鼻粘膜給藥、口腔粘膜給藥、眼部給藥、直腸給藥、陰道給藥或其他臨床給藥方式.
本發(fā)明還提供一種延長血管內皮抑制素半衰期的方法，所述方法包含將修飾物與血管內皮抑制素形成復合物的步驟和制備含有血管內皮抑制素的緩釋制劑的步驟。
實驗表明，本發(fā)明中的一個產品聚乙二醇與重組人血管內皮抑制素N端偶聯(lián)的復合物，具有抑制血管內皮細胞遷移和小鼠腫瘤生長的活性，與未修飾的人血管內皮抑制素相比，活性明顯提高，并且體內藥代學研究表明修飾產物能有效的減緩藥物在體內的代謝，延長體內半衰期.
本發(fā)明中提到的血管內皮抑制素，除了特別說明以外，其來源可以是人，鼠，或其他哺乳動物，其中的優(yōu)選方案是人血管內皮抑制素.發(fā)明中提到的血管內皮抑制素，除特殊說明以外，包括野生型的血管內皮抑制素，即體內自然存在的形式，或是其具有活性的突變體、片^:、異構體、衍生物等或是它們的組合.血管內皮抑制素的來源可以是但不僅限于動物細胞表達的，也可以是從酵母或大腸肝菌中發(fā)酵純化而來的。其中來源于動物細胞表達的野生型的人血管內皮抑制素的氨基酸序列如SEQ ID NO.l所示；來源于酵母表達的重組人血管抑制素具有SEQ ID NO.l的序列，或是在此序列的N端有IO個氨基酸以內的增加或缺失；來源于大腸肝菌表達的重組人血管內皮抑制素具有SEQ ID NO.2的序列，但其N末端的Met在表達后有時會-皮部分刪除，若此情況發(fā)生，N末端的Met刪除后的重組人血管內
15皮抑制素將具有SEQIDNO.l的序列。
血管內皮抑制素的突變體指的是通過氨基酸的取代、缺失、增加而得到的血管內皮抑制素分子。血管內皮抑制素的片段是指序列屬于SEQ ID NO.l 或SEQ ID NO.2的任何更小的部分，可以是但不限于通過酶切得到的，或是基因工程表達的，或是通過多肽合成的方法得到的。例如具有SEQ ID N0.3、 SEQIDN0.4、 SEQIDNO.5序列的片段曾被報道具有抑制小鼠實體瘤的活性(Cattaneo MG et al. Experimental Cell Research 283 (2003) 230~236; Tjin Tham Sjin RM et al. Cancer Research (2005) 65(9) 3656-3663 )。血管內皮抑制素的異構體是指具有和野生型血管內皮抑制素相同的氨基酸序列或分子式，但是卻有不一樣的構象，包括蛋白二級或三級結構的不同或是局部氨基酸旋光性的改變，異構體的來源可以是天然存在的突變或是通過人為設計而得到的.血管內皮抑制素的衍生物是指在野生型血管內皮抑制素的基礎上進行修飾的產物，其中的修飾是指在蛋白上共價連接一個或多個其他小分子，例如磷酸分子、糖分子等，或是20個氨基酸以內的小肽鏈，連接位點可以是蛋白內的任意一個氨基酸.在一個優(yōu)選的方案中，可以是N 端附加一段9個氨基酸組成的含有His-tag的肽鏈MGGSHHHHH的人血管內皮抑制素，其具有SEQ ID N0.6的序歹'J (Luo Yongzhang et al. US2004110671)，當由大腸桿菌表達時其N末端的Met在表達后有時會被部分刪除。血管內皮抑制素具有活性的突變體、片段、異構體、衍生物的組合是指同時具有兩種或兩種以上上述特征的變化的產物，例如但不僅限于片段的突變體、突變體的修飾產物等.
附圍說明

圖1:顯示野生型人血管內皮抑制素的氨基酸序列SEQIDNO.l, 圖2:顯示一種大腸桿菌表達的野生型重組人血管內皮抑制素的氨基酸序列SEQIDN0.2。這里N末端的Met在表達后有時會被部分刪除'若此情況發(fā)生，N末端的Met刪除后的重組人血管內皮抑制素將具有SEQ ID NO.l的序列。
圖3:顯示一種具有活性的血管內皮抑制素片段的序列SEQIDNO.3. 圖4:顯示一種具有活性的血管內皮抑制素片段的序列SEQIDNO.4. 圖5:顯示一種具有活性的血管內皮抑制素片段的序列SEQIDNO.5,圖6:顯示一種具有活性的N端附加氨基酸的重組人血管內皮抑制素的氨基酸序列SEQ ID NO. 6。這里N末端的Met在表達后有時會被部分刪除.
圖7: 20 kDa聚乙二醇與具有SEQ ID N0.2序列的重組人血管內皮抑制素的N端的偶聯(lián)。反應前后溶液用SDS-PAGE檢測，泳道l: 20kDa聚乙二醇修飾的血管內皮抑制素；泳道2:未修飾的血管內皮抑制素；泳道3: 蛋白分子量標準.
圖8: 20 kDa聚乙二醇與具有SEQ ID NO.6序列的重組人血管內皮抑制素的N端的偶聯(lián)。修飾前后溶液用SDS-PAGE檢測，泳道1:未修飾血管內皮抑制素；泳道2: 20kDa聚乙二醇修飾的血管內皮抑制素；泳道3: 蛋白分子量標準.
圖9: 20 kDa聚乙二醇修飾具有SEQ ID NO.2序列的重組人血管內皮抑制素的N端后用陽離子柱SP純化，使用陽離子柱SP吸附蛋白，再用氯化鈉梯度溶液洗脫，最后用還原SDS-PAGE檢測純化效果。泳道1:純化前；泳道2:上樣穿透的溶液；泳道3 10:分布收集的洗脫液。
圖10: 20kDa聚乙二醇修飾具有SEQIDNO.6序列的重組人血管內皮抑制素的N端后用陽離子柱SP純化，使用陽離子柱SP吸附蛋白，再用氯化鈉梯度溶液洗脫，最后用還原SDS-PAGE檢測純化效果，泳道1:純化前；泳道2:上樣穿透的溶液；泳道3 8:分布收集的洗脫液，
圖11: 40kDa聚乙二醇修飾具有SEQIDNO.2序列的重組人血管內皮抑制素的N端后用陽離子柱SP純化.使用陽離子柱SP吸附蛋白，再用氯化鈉梯度溶液洗脫，最后用還原SDS-PAGE檢測純化效果。泳道1:純化前；泳道2:上樣穿透的溶液；泳道3 10:分布收集的洗脫液.
圖12: 20kDa聚乙二醇與重組Ajk管內皮抑制素N端偶聯(lián)的產物抑制血管內皮細胞遷移的活性.SEQ2:具有SEQIDN0.2的血管內皮抑制素； PEG-SEQ 2: 20 kDa聚乙二醇修飾的具有SEQ ID NO.2的血管內皮抑制素； SEQ6:具有SEQIDNO,6的血管內皮抑制素；PEG-SEQ6: 20kDa聚乙二醇修飾的具有SEQIDNO.6的血管內皮抑制素。
圖13: 20kDa聚乙二醇與重組人血管內皮抑制素N端偶聯(lián)的產物抑制小鼠S180肉瘤的活性.SEQ2:具有SEQ ID NO.2的血管內皮抑制素每天給藥；PEG-SEQ2-1: 20kDa聚乙二醇修飾的具有SEQIDN0.2序列的血管內皮抑制素每天給藥；PEG-SEQ 2-2: 20 kDa聚乙二醇修飾的具有SEQ ID N0.2序列的血管內皮抑制素每兩天給藥；PEG-SEQ2-3: 20kDa聚乙二醇修飾的具有SEQIDN0.2序列的血管內皮抑制素每三天給藥；SEQ6:具有 SEQIDN0.6的血管內皮抑制素每天給藥；PEG-SEQ6-1: 20kDa聚乙二醇修飾的具有SEQIDN0.6序列的血管內皮抑制素每天給藥；PEG-SEQ6-2: 20 kDa聚乙二醇^^飾的具有SEQ ID NO.6序列的血管內皮抑制素每兩天給藥；PEG-SEQ6-3: 20kDa聚乙二醇修飾的具有SEQIDN0.6序列的血管內皮抑制素每三天給藥。
圖14: 20 kDa聚乙二醇修飾具有SEQ ID NO.6序列的重組人血管內皮抑制素賴氨酸殘基側鏈的e-氨基后用分子篩純化，泳道1:上樣；泳道2 10: 分布收集的洗脫液.
圖15: 20kDa聚乙二醇修飾具有SEQIDN0.6序列的重組人血管內皮抑制素賴氨酸殘基側鏈的e-氨基后用陽離子柱CM純化。泳道l:上樣；泳道2:穿透；泳道3 8:分布收集的洗脫液。
具體實施例方式
實施例l、 20kDa聚乙二醇與重組人血管內皮抑制素N端的偶聯(lián)。
本實施例涉及的重組人血管內皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQ IDN0.6序列的重組人血管內皮抑制素，具體實施方式
為將重組人血管內皮抑制素透析到pH 5.5的30 mM醋酸鈉溶液中。用紫外分光光度計在280 nm 波長下測量蛋白濃度，然后將濃度調節(jié)到2 mg/ml。與20 kDa的特異修飾蛋白N端的聚乙二醇偶聯(lián)時，取20ml上述蛋白溶液(含蛋白40 mg)，加入20 kDa聚乙二醇固體80 mg，并室溫攪拌，直到完全溶解，使得聚乙二醇與血管內皮抑制素的摩爾比為2:1.加入還原劑CH3BNNa，濃度為20 mM，并最后調節(jié)溶液的pH值為5,室溫靜置10小時以后大于80%的血管內皮抑制素被單一聚乙二醇修飾，即一個聚乙二醇與一個血管內皮抑制素分子偶聯(lián)，并且偶聯(lián)的位點是血管內皮抑制素N端的a-氨基，少量血管內皮抑制素會被非特異性的多位點修飾。這時反應液可直接用于上柱純化。反應前后溶液電泳結果如附圖7和8所示.
實施例2、 20 kDa聚乙二醇修飾重組AA管內皮抑制素N端后用陽離子柱SP純化.本實施例涉及的重組人血管內皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管內皮抑制素。
具體實施方式
為將20 kDa聚乙二醇修飾的血管內皮抑制素用SP層析柱(Amersham)純化。將反應后的混合液調節(jié)pH為6,層析柱用含有10 mM磷酸鹽，pH值為6.0的平衡緩沖液平衡后上樣。上樣后再用含有10mM磷酸鹽，1M氯化鈉，pH6.0的洗脫緩沖液梯度洗脫，未反應的聚乙二醇由于帶電荷極少，所以在穿透和沖洗的過程中出現(xiàn)，洗脫出峰的順序為多修飾的血管內皮抑制素、單修飾的血管內皮抑制素、未修飾的血管內皮抑制素.根據280nm的紫外檢測可以收集不同的分離組分。純化結果如附圖9和IO所示。
實施例3、 40kDa聚乙二酵與重組人血管內皮抑制素N端的偶聯(lián)，
本實施例涉及的重組人血管內皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管內皮抑制素.具體實施方式
為將重組人血管內皮抑制素透析到pH 5.5的30 mM醋酸鈉溶液中。用紫外分光光度計在280 nm 波長下測量蛋白濃度，然后將濃度調節(jié)到2.5mg/m1.與40kDa的特異修飾蛋白N端的聚乙二醇偶聯(lián)時，取20 ml上述蛋白溶液(含蛋白40 mg),加入40kDa聚乙二醇固體160mg,并室溫攪拌，直到完全溶解，使得聚乙二醇與血管內皮抑制素的摩爾比為2:1.加入還原劑CH3BNNa,濃度為20 mM，并最后調節(jié)溶液的pH值為5.室溫靜置10小時以后大于80%的血管內皮抑制素被單一聚乙二醇修飾，即一個聚乙二醇與一個血管內皮抑制素分子偶聯(lián)，并且偶聯(lián)的位點是蛋白N端的a-氨基，少量血管內皮抑制素會被非特異性的多位點修飾.這時反應液可直接用于上柱純化。
實施例4、 40kDa聚乙二醉修飾重組人血管內皮抑制素N端后用陽離子柱SP純化.
本實施例涉及的重組人血管內皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管內皮抑制素.具體實施方式
為將40kDa聚乙二醇血管內皮抑制素偶聯(lián)物用SP層析柱(Amersham)純化.將反應后的混合液調節(jié)pH為6.層析柱用含有10 mM磷酸鹽，pH值為6.0的平衡緩沖液平衡后上樣。上樣后再用含有10mM磷酸鹽，1M氯化鈉，pH6.0的洗脫緩沖液梯度洗脫，未反應的聚乙二醇由于帶電荷極少，所以在穿透和沖洗的過程中出現(xiàn)，洗脫出峰的順序為多修飾的血管內皮抑制素、單修飾的血管內皮抑制素、未修飾的血管內皮抑制素.根據280nm的紫外檢測可以收集不同的分離組分。具有SEQ ID N0.2序列的重組人血管內皮抑制素純化結果如附圖11所示，具有SEQIDN0.6序列的純化結果與SEQIDNO,2序列的純化結果類似，在此省略。
實施例5、 20 kDa聚乙二醇與重組人血管內皮抑制素N端偶聯(lián)的產物在血液中的長效效應。
本實施例涉及的重組人血管內皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和 SEQ ID N0.6序列的重組人血管內皮抑制素.測量聚乙二醇修飾和未修飾的重組人血管內皮抑制素在小鼠體內的半衰期來檢驗聚乙二醇修飾后的長效效益。選用6只25g左右體重的健康昆明種小鼠，分為兩組，每組3只，分別尾靜脈注射未修飾的重組人血管內皮抑制素和20 kDa聚乙二醇與重組人血管內皮抑制素N端偶聯(lián)的產物，劑量為15mg/kg體重。按照2、 10、 30分鐘、1、 2、 4、 8、 16、 24、 36、 48、 72小時的時間間隔尾靜脈取血. 收集血漿，用夾心法ELISA分別測血管內皮抑制素和聚乙二醇修飾的血管內皮抑制素的濃度。體內藥代動力學顯示20 kD聚乙二醇修飾后，具有SEQ IDNO,2序列的重組人血管內皮抑制素在小鼠體內的半衰期從平均4.8小時增加到平均16小時.具有犯QIDN0.6序列的重組人血管內皮抑制素經修飾以后在小鼠體內的半衰期從平均7.5小時增加到平均16小時這表明偶聯(lián) 高分子量的聚乙二醇能有效的增加重組人血管內皮抑制素的體內代謝的半衰期，達到長效的目的.
實施例6、 20 kDa聚乙二醇與重組人血管內皮抑制素N端偶聯(lián)的產物抑制血管內皮細胞遷移的活性.
本實施例涉及的重組人血管內皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.6序列的重組人血管內皮抑制素.具體實施方案為將人血管內皮細胞 (HMEC )在含10%血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期.然后饑餓細胞12小時，將細胞用胰酶消化以后，加入測細胞遷移的Jtt中，每孔細胞數(shù)10000個.遷移條件為DMEM培養(yǎng)基、1%血清、10ng/ml bFGF和雙抗，對于加藥組分別加入血管內皮抑制.素和修飾后的血管內皮抑制素，濃度為30ug/ml。 37。C培養(yǎng)8小時以后，取出小皿，用1%戊二醛固定細胞，刮掉膜上層的未遷移細胞，用蘇木精對下層細胞染色.最后在顯微鏡下，取相同大小視野數(shù)細胞數(shù)，同一塊皿中選取三個不同視野，最后算出抑制率。結果顯示具有SEQ ID NO,2序列的重組人血管內皮抑制素對細胞遷移的抑制率為42%, f斧飾后對細月包遷移的抑制率達到90%。具有SEQIDNO.6 序列的重組人血管內皮抑制素對細胞遷移的抑制率為45%,修飾后對細胞遷移的抑制率達到88%。以上結果表明經過聚乙二醇修飾后的血管內皮抑制素不僅保持而且還大大增強了生物活性。實驗結果如圖12所示。
實施例7、 20 kDa聚乙二酵與重組人血管內皮抑制素N端偶聯(lián)的產物在小鼠腫瘤模型治療中的活性.
本實施例涉及的重組人血管內皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和 SEQIDN0.6序列的重組人血管內皮抑制素。實驗觀察了 20kDa聚乙二醇修飾的血管內皮抑制素對小鼠S180腫瘤的體內抑制活性。實驗材料選用20 g體重的昆明小鼠，分別腋下接入S180肉瘤細胞，每只接入細胞數(shù)2xi06 個。第二天隨機分組，每組8只，分別設定陰性對照組(生理鹽水)、陽性對照組(血管內皮抑制素1.5mg/kg體重，每天給藥)、三組給藥組(聚乙二醇修飾的血管內皮細胞1.5mg/kg體重，分別為每天，每兩天，每三天給藥)。分組后開始給藥，給藥方式為尾靜脈注射.給藥周期為10天，第11 天處死小鼠，稱瘤重，以抑瘤率來評價藥效，計算方法為抑瘤率-(陰性對照組瘤重-給藥組瘤重)/陰性對照組瘤重x 100°/。.對于具有SEQ IDN0.2 序列的重組人血管內皮抑制素，實驗結果顯示陽性對照組的抑瘤率為 34%,給藥組每天，每兩天，每三天給藥的抑瘤率分別為47%, 53%， 40%. 對于具有SEQ ID NO.6序列的N端附加氨基酸的重組人血管內皮抑制素，實驗結果顯示陽性對照組的抑瘤率為40°/。，給藥組每天，每兩天，每三天給藥的抑瘤率分別為45%, 57°/。， 50%.表明修飾后的重組人血管內皮抑制素具有體內的抑瘤活性，而且由于其體內代謝速度減慢，使得藥效優(yōu) 于未修飾的重組人血管內皮抑制素，并且在延長給藥間隔的情況下仍能保持藥效優(yōu)于未修飾的重組人血管內皮抑制素。實驗結果如圖13所示。
實施例8、 20kDa聚乙二醇修飾重組人血管內皮抑制素賴氨酸殘基側鏈的e-氨基。
本實施例涉及的重組人血管內皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQ IDN0.6序列的重組人血管內皮抑制素。
具體實施方式
為將重組人血管內皮抑制素透析到pH 7.8的30 mM磷酸緩沖液中。用紫外分光光度計在280nm 波長下測量蛋白濃度，然后將濃度調節(jié)到2mg/ml。加入20kDa的修飾賴氨酸殘基側鏈e-氨基的聚乙二醇分子，使得聚乙二醇分子與蛋白的摩爾比分別為8: 1。室溫放置，重組人血管內皮抑制素能被較快的修飾，30分鐘以后80%的血管內皮抑制劑能被修飾，隨著反應時間增長，修飾物產量增多，但反應速度在1小時以后減慢。反應產物主要有單分子聚乙二醇修飾和多分子聚乙二醇修飾的血管內皮抑制素.這時反應液可直接用于上柱純化，
實施例9、 20kDa聚乙二酵修飾重組人血管內皮抑制素賴氨酸殘基側鏈的s-氨基后用分子篩純化.
本實施例涉及的重組人血管內皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6序列的重組人血管內皮抑制素.具體實施方式
為將20 kDa聚乙二醇血管內皮抑制素偶聯(lián)物用分子篩純化。將反應后的混合液調節(jié)pH為7.4, 層析柱用含有20 mM磷酸鹽，100 mM氯化鈉，pH值為7.4的平衡緩沖液平衡后上樣，根據280nrn的紫外檢測可以收集不同的分離組分。具有SEQ ID N0.6序列的血管內皮抑制素的修飾產物的純化結果如附圖14所示。
實施例10、 20 kDa聚乙二醇修飾重組人血管內皮抑制素賴氨酸殘基側鏈的E-氨基后用離子柱純化.
本實施例涉及的重組人血管內皮抑制素包括具有SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.6序列的重組人血管內皮抑制素。
具體實施方式
為將20 kDa聚乙二醇血管內皮抑制素偶聯(lián)物用CM層析柱純化。將反應后的混合液調節(jié)pH為 6.5。層析柱用含有10mM磷酸鹽，pH值為6.5的平衡緩沖液平衡后上樣。上樣后再用含有10mM磷酸鹽，1M氯化鈉，pH6.5的洗脫緩沖液梯度洗脫.未反應的聚乙二醇由于帶電荷極少，所以在穿透和沖洗的過程中出現(xiàn)，洗脫出峰的順序為多修飾的血管內皮抑制素，單修飾的血管內皮抑制素，未修飾的血管內皮抑制素.根據280nm的紫外檢測可以收集不同的分離組分.具有SEQ ID N0.6序列的血管內皮抑制素的修飾產物的純化結果如附圖15所示.
22序列表
<160> 6
<170〉 Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 183
<212> PRT
<213〉人(Homo sapiens)
<400> 1
His Ser His Arg Asp Phe Gin Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn
1 5 10
Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly lie Arg Gly 20 25
Cys Phe Gin Gin Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly 35 40
Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gin Asp Leu Tyr Ser lie 50 55 60
Asp Arg Ala Ala Val Pro lie Val Asn Leu Lys Asp 65 70 75
Pro Ser Ti:p Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly 85 90
Gly Ala Arg lie Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val 100 105
Ala Asp 30
Thr Phe 45
15
Phe Gin Arg Als
Val Arg Arg Ala
Glu Leu
Pro Leu
Leu Phe 80
Lys Pro 95
Leu Arg His Pro 110
Thr Trp Pro Gin Lys Ser Val Trp His Gljr Ser Asp Pro Asn Gly Arg
115 120
Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr 130 135
Ala Thr Gly Gin Ala Ser Ser Uu Leu 145 150
Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr 165
Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys 180
<210> 2
125
Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser 140
Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gin 155 160
lie Val Leu Cys lie Glu Asn 170 175<211〉 184 <212〉 PRT
<213〉人(Homo sapiens) < 2
Met His Ser His Arg Asp Phe Gin Pro Val Uu His Leu Val Ala Uu 15 10 15
Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly lie Arg Gly Ala Asp Phe 20 25 30
Gn Cys Phe Gin Gin Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg 35 40 45
Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gin Asp Leu Tyr Ser lie Val Arg Arg 50 55 60
Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro lie Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu 65 70 75 80
Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys 85 90 95
Pro Gly Ala Arg lie Phe Ser Phe、sp Gly Lys Asp Val Leu Arg His 100 105 110
Pro Thr T卬Pro Gin Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly 115 120 125
Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp—Arg Thr Glu Ala Pro 130 135 M0
Ser Ala Thr Gly Gin Ala Ser Ser Uu Leu Gly Gly Arg Uu Leu Gly 145 150 155 160
Gin Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr lie Val Leu Cys'lie Glu 165 170 175
Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys 180
<210> 3 <211> 44 <212> PRT
<213> 人(Homo sapiens) <400〉 3
Phe Glrv Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly 15 10 15Gly Met Arg Gly lie Arg Gly Ala Asp Phe Gin Cys Phe Gin Gin Ala
20 25 30
Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe 35 40
<210〉 4 <211〉 45 <212> PRT
<213〉人(Homo sapiens) <400〉 4
Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gin Ala 15 10 15
Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gin Ser Ala Ala Ser Cys 20 25 30
His His Ala Tyr lie Val Leu Cys lie Glu Asn Ser Phe 35 40 45
<210〉 5 <211〉 27 <212〉 PRT
<213〉人(Homo sapiens) <400> 5
His Ser His Arg Asp Phe Gin Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn 15 10 15
Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly lie Arg 20 25
<210> 6 <211> 192 <212> PRT
<213> 人(Homo sapiens) <德6
Met Gly Gly Ser His His His His His His Ser His Arg Asp Phe Gin 15 10 15
Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met 20 25 30Arg Gly lie Arg Gly Ala Asp Phe Gin Cys Phe Gin Gin Ala Arg Ala 35 40 45
Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe Uu Ser Ser Arg Leu Gin 50 55 60
Asp Leu Tyr Ser lie Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro lie 65 70 75 80
Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe 85 90 95
Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg lie Phe Ser Phe 100 105 110
Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gin Lys Ser Val 115 120 125
Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys 130 135 140
Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gin Ala Ser Ser 145 150 155 160
Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gin Ser Ala Ala Ser Cys His His 165 170 175
Ala Tyr lie Val Leu Cys lie Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys 180 185 190
2權利要求
1.一種修飾物與血管內皮抑制素形成的復合物，所述復合物具有比血管內皮抑制素更長的體內半衰期。
2. 權利要求l的復合物，所述修飾物與血管內皮抑制素通過共價鍵連接。
3. 權利要求2的復合物，所述修飾物選自高分子聚合物、蛋白質分子或其片段、肽鏈、小分子或其他任何形式的化學物質。
4. 權利要求3的復合物，所述高分子聚合物選自聚烯醇類化合物、聚醚類化合物、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸(包括聚丙氨酸)、二乙烯基醚與馬來酸酐的共聚物、N-(2-羥丙基)-甲基丙烯酰胺 (N-(2-Hydroxypropyl)-methacrylamide)、葡聚糖及葡聚糖衍生物如疏酸葡聚糖、纖維素及纖維素的衍生物(包括甲基纖維素和羧甲基纖維素)、淀粉及淀粉衍生物、聚蔗糖、聚氧乙基多醇(polyoxyethylated polyol)、肝素或肝素片段、聚烴基乙二醇及其衍生物、聚烴基乙二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚、聚羥乙基天冬酰胺 (a,P-Poly((2-hydroxyethyl)-DL-aspartamide))、聚羧酸月旨(polycarboxylates)、氧化乙烯和甲醛的共聚物(poly oxyethylene-oxymethylenes)、聚丙烯醜嗎淋(polyacryloyl morpholines)、氨基化合物與氧化烯烴的共聚物、聚透明質酸，聚環(huán)氧化物(polyoxiranes)、乙二酸與丙二酸的共聚物、聚l， 3-乙二醇次甲基醚、乙烯和順丁烯二酰肼的共聚物、多聚唾液酸、環(huán) 糊精或其他藥學上可接受的高分子聚合物。
5. 權利要求4的復合物，所迷聚醚類化合物選自聚烷撐二醇 (HO((CH2)xO)nH)、聚丙二醇、聚氧化乙烯(HO((CH2)20)nH)、聚乙烯醇((CH2CHOH) J或它們的衍生物。
6. 權利要求4的復合物，所述聚烯醇類化合物選自聚乙二醇(包括單甲基聚乙二醇、單羥基聚乙二醇)、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚丁烯醇或它們的衍生物。
7. 權利要求6的復合物，所述聚烯醇類化合物為聚乙二醇。
8. 權利要求7的復合物，所述聚乙二醇優(yōu)選單甲基聚乙二醇。
9. 權利要求7或8的復合物，其特征為一個血管內皮抑制素分子和一個或多個聚乙二醇分子偶聯(lián)。
10. 權利要求7-9任一項的復合物，血管內皮抑制素與聚乙二醇偶4笑的位點是血管內皮抑制素的N-末端oc-氨基、賴氨酸殘基側鏈的s-氨基、半胱氨酸殘基側鏈的巰基、天冬氨酸殘基側鏈的羧基、谷氨酸殘基側鏈的羧基、C-末端羧基中的一種或是它們的組合。
11. 權利要求7-IO任一項的復合物，其特征為一個血管內皮抑制素分予與一個聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)位點為血管內皮抑制素N-末端的a-氨基。
12. 權利要求7-IO任一項的復合物，其特征為血管內皮抑制素分子與一個或多個聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)的位點是血管內皮抑制素分子N-末端的a-氨基或野生型血管內皮抑制素75、 95、06、 117、 183位的賴氨酸殘基側鏈上的s-氨基或其組合。
13. 權利要求7-10任一項的復合物，其特征為血管內皮抑制素分子與一個或多個聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)方法為在血管內皮抑制素分子內部或其N-末端或C-末端附加半胱氨酸或是含有半胱氨酸的肽鏈，使得偶聯(lián)位點為附加的半胱氨酸殘基側鏈上的巰基。
14. 權利要求7-10任一項的復合物，其特征為血管內皮抑制素分子與一個或多個聚乙二醇分子偶聯(lián)，偶聯(lián)的位點是血管內皮抑制素天冬氨酸或谷氨酸殘基側鏈上的羧基或C-末端的羧基。
15. 權利要求7-14任一項的復合物，所述聚乙二醇分子是線性的或是分叉的。
16. 權利要求7-14任一項的復合物，所述聚乙二醇分子的平均分子量位于1,000到IOO，OOO道爾頓之間，優(yōu)選5，000到40,000道爾頓之間。
17. 權利要求3的復合物，所述蛋白選自血管內皮抑制素、白蛋白、免疫球蛋白、甲狀腺結合蛋白、轉甲狀腺蛋白、轉鐵蛋白、纖維蛋白原或它們的片段及其組合。
18. 權利要求17的復合物，所述復合物是血管內皮抑制素和一個或多個血管內皮抑制素偶聯(lián)形成二聚體或多聚體，該偶聯(lián)物可以是通過化學修飾得到的，或是通過融合表達得到的，或是通過其他方法得到的，其中的血管內皮抑制素優(yōu)選人血管內皮抑制素或其片段。
19. 權利要求17的復合物，所述復合物是白蛋白偶聯(lián)的血管內皮抑制素，其特征為一個血管內皮抑制素分子和一個或多個白蛋白偶聯(lián)，該偶聯(lián)物可以是通過化學修飾得到的，或是通過融合表達得到的，或是通過其他方法得到的，其中的白蛋白優(yōu)選人血清白蛋白或其片段。
20. 權利要求17的復合物，所述復合物是免疫球蛋白Fc片段偶聯(lián)的血管內皮抑制素，其特征為一個血管內皮抑制素分子和一個或多個免疫球蛋白Fc片段偶聯(lián)，該偶聯(lián)物可以是通過化學修飾得到的，或是通過融合表達得到的，或是通過其他方法得到的，其中的Fc片段優(yōu)選人免疫球蛋白IgG中的Fc區(qū)域的片段。
21. 權利要求3中的復合物，所述復合物是小分子或是小肽或是其他化合物修飾的血管內皮抑制素，其特征是該復合物具有同體內其他分子或成分反應或結合的活性，使得該聚合物可以在體內和其他成分形成更大的復合物。
22. 權利要求20中的復合物，所述復合物帶有具有反應活性的基團，可以和血液成分的氨基、羥基、巰基反應形成共價鍵。
23. 權利要求21中的復合物，所迷具有反應活性的基團是馬來酰亞胺，它可以和血液成分，例如白蛋白中的巰基反應。
24. 權利要求20中的復合物，和血液某些成分，例如白蛋白、免疫球蛋白有較強的親和力，能相互形成更大的復合物。
25. 權利要求3中的復合物，所迷復合物是其他分子或是小肽修飾的血管內皮抑制素，例如血管內皮抑制素被糖基化、磷酸化或酰基化的產物，其中修飾的位點是原來蛋白序列中存在的氧基酸殘基，或是通過突變產生的氨基酸殘基。
26. 權利要求l的復合物，所述修飾物與血管內皮抑制素通過非共價鍵相互作用，該復合物具有特定的組成式，其中的修飾物可以是蛋白、小分子或其他化學物質。
27. 血管內皮抑制素或4又利要求1 -26任一項的復合物和生物相容的物質形成的緩釋制劑。
28. 權利要求27的緩釋制劑，所述的緩釋制劑選自微膠嚢、水凝膠、徵球、微型滲透泵或脂質體。
29. 權利要求28的緩釋制劑，其中所述的水凝膠包括 P(MAA-g-EG)水凝膠(由甲基丙烯酸methacrylic add (MAA)和 poly (ethylene glycol) ether monomethacryiate (PEGMA)組成)或由水溶性聚合物chitosan與deacylated gellan gum組成的聚合物(DGG)形成的原位(yn"to)水凝膠，且該種水凝膠可在生物體內緩慢降解。
30. 權利要求28的緩釋制劑，其中所述的微膠嚢包括由納米材料及其他生物相容物組成的"f效膠囊，且該種微膠嚢可在生物體內緩慢
31. 權利要求28的緩釋制劑，其中所述的微球包括由 poly(ethylene glycol) (PEG)和生物可降解聚合物如polylactide (PLA)、 polyglycolide (PGA) 、 PLGA、 poly(-capi:olactone) (PCL) 、 poly oi:tho esters (POE)或poly(ethylene terephthakte) (PET)以任意組合方式形成的原位(hs/fti)共聚物微球體，且該種微球體可在生物體內緩慢降解。
32. 權利要求1-26任一項中的復合物以及4又利要求27-31任一項中的緩釋制劑，其中血管內皮抑制素是人、鼠、或其他哺乳動物來源的。
33. 權利要求1-26任一項中的復合物以及權利要求27-31任一項中的緩釋制劑，其中血管內皮抑制素是野生型的人血管內皮抑制素，其天然形式具有SEQIDNO. l所示的序列。
34. 權利要求1-26任一項中的復合物以及4又利要求2"7-31任一項中的緩釋制劑，其中所述血管內皮抑制素當由大腸肝菌表達時，其野生型的人血管內皮抑制素具有SEQ ID NO. 2的序列，其中N末端的Met在大腸肝菌表達時有時會被部分刪除。
35. 權利要求1-26任一項中的復合物以及4又利要求27-31任一項中的緩釋制劑，其中血管內皮抑制素可以是血管內皮抑制素的具有活性的片段、突變體、衍生物、異構體或是它們的組合。
36. 權利要求35中的復合物或緩釋制劑，其中血管內皮抑制素片,殳是具有SEQ ID NO. 3、 SEQ ID NO. 4、或SEQ ID NO. 5序列的肽鏈。
37. 權利要求35中的復合物或緩釋制劑，其中血管內皮抑制素衍生物是在野生型血管內皮抑制素的N端或C端附加一段長度為 1-15個氨基酸的肽鏈形成的。
38. 權利要求37中的復合物或緩釋制劑，其中血管內皮抑制素衍生物是在野生型人血管內皮抑制素的N端附加一段9個氦基酸組成的含有His-tag的肽鏈MGGSHHHHH ，該衍生物具有SEQ ID No. 6 的序列，當由大腸桿菌表達時其N末端的Met有時會被部分刪除。
39. 權利要求l-38中任一項的含有血管內皮抑制素的復合物或緩釋制劑與藥學上可接受的載體形成的藥物組合物。
40. 權利要求39的藥物組合物，其中的藥學上可接受的載體為含水的pH緩沖溶液，包括磷酸鹽、檸檬酸鹽、或其他有機酸的緩沖液、抗壞血酸或其他抗氧化劑，低分子量(不超過10個殘基)多肽、血清白蛋白、明膠、免疫球蛋白或其他蛋白質、聚乙烯吡咯烷酮或其他親水性多聚體、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、賴氨酸或其他氨基酸、單糖、二糖、葡萄糖、甘露糖、糊精或其他糖類、EDTA 或其他螯合荊、甘露醇、山梨醇或其他糖醇、鈉離子或其他成鹽反離子、TWEEN 、聚乙二醇(PEG)、 PLURONICS⑧或其他非離子表面活性劑。
41. 一種試劑盒，其包含權利要求l-40的含有血管內皮抑制素的復合物、緩釋制劑或藥物組合和使用說明。
42. —種試劑盒，其包含權利要求7-16的聚乙二醇修飾的血管內皮抑制素和使用說明。
43. 制備權利要求7-16中的含有血管內皮抑制素的復合物的方法，其特征是用活化的聚乙二醇與血管內皮抑制素混合，在適當?shù)娜?液、溫度、pH、摩爾比下反應。
44. 權利要求43的方法，其中pH為pH3-10。
45. 制備權利要求7-16中的含有血管內皮抑制素的復合物的方法，其特征是將偶聯(lián)產物用陽離子柱純化。
46. 制備權利要求7-16中的含有血管內皮抑制素的復合物的方法，其特征是將偶聯(lián)產物用分子篩純化.
47. 權利要求1-42的含有血管內皮抑制素的復合物、緩釋制齊'J、藥物組合物或試劑盒在預防、診斷或治療腫瘤中的用途。
48. 4又利要求47的用途，所述肺瘤選自肺癌、神經內分泌瘤、結腸癌、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、食道癌、口腔癌、鼻咽癌、宮頸癌、肉瘤、腎癌、膽癌、惡性黑色素胂瘤或其他胂瘤。
49. 權利要求1-42的含有血管內皮抑制素的復合物、緩釋制劑、藥物組合物或試劑盒在預防、it斷或治療其他疾病中的用途，所述疾病的特征為新生血管異常生成而導致人的組織或器官病變。
50. 權利要求47-49的用途，其中的給藥方式選自靜脈注射、靜脈滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下包埋、透皮吸收、肝動脈注射、口服、鼻粘膜給藥、口腔粘膜給藥、眼部給藥、直腸給藥、陰道給藥或其他臨床給藥方式。
51. 權利要求l-40的含有血管內皮抑制素的復合物、緩釋制劑或藥物組合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
52. 權利要求l-40的含有血管內皮抑制素的復合物、緩釋制劑或藥物組合物在制備治療其他疾病的藥物中的用途，所述疾病的特征為新生血管異常生成而導致人的組織或器官病變。
53. —種延長血管內皮抑制素半衰期的方法，所述方法包含將修飾物與血管內皮抑制素形成復合物的步驟。
54. —種延長血管內皮抑制素半衰期的方法，所述方法包含將血管內皮抑制素或含有血管內皮抑制素的復合物與生物相容的物質形成緩釋制劑的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗腫瘤藥物及含有這種藥物的藥物組合物和試劑盒，同時也公開了制備這種抗腫瘤藥物的方法。本發(fā)明中的抗腫瘤藥物具有體內代謝的穩(wěn)定性，可用于治療腫瘤或制備抗腫瘤藥物。
文檔編號A61K38/17GK101596320SQ20091013221
公開日2009年12月9日申請日期2006年1月20日優(yōu)先權日2006年1月20日
發(fā)明者彥付, 常國棟, 羅永章, 雷清新, 慶韓申請人:清華大學;北京普羅吉生物科技發(fā)展有限公司

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