專利名稱：低分子量葡聚糖、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種低分子量葡聚糖、所述低分子量葡聚糖的制備方法及 其用途。
背景技術(shù)：
黃芪(i ^fe血^^"/M)是豆科植物膜莢黃芪或蒙古黃芪的干燥根， 味甘、性溫，歸肺、脾經(jīng)，是重要的益氣中藥。黃芪多糖是其主要有效成 分之一，現(xiàn)代藥理研究證明，黃芪多糖具有提高人體免疫功能、抗腫瘤、 抗輻射損傷、調(diào)節(jié)血糖、抗衰老等作用(張小梅.黃芪多糖的免疫調(diào)節(jié)作
用及抗腫瘤作用研究進展.大連大學學報，2003， 24(6): 101-104;包文 奇，呂美，王志祥.黃芪多糖的藥理研究進展.河南農(nóng)業(yè)科學，2005， (4): 78-80)。
目前對黃芪多糖的研究主要集中在分子量較大的多糖上(李鵬飛，杜 海燕，趙孟春.黃芪多糖的化學和免疫學研究.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2005， (5): 4-6;單俊杰，王順春，劉滌，胡之璧.黃芪多糖的化學和藥理研究 進展.上海中醫(yī)藥大學學報，2000， 14 (3) : 61-65)，而對低分子量多 糖的研究幾乎處于空白。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述的黃芪中低分子量多糖的研究處于空白的技術(shù)問題，本發(fā) 明從黃芪中分離純化獲得一種低分子量葡聚糖，經(jīng)化學分析和光譜分析相 結(jié)合的方法確定出其化學結(jié)構(gòu)，并通過藥理實驗證明該類結(jié)構(gòu)的葡聚糖具 有明顯的免疫增強活性，可應(yīng)用于藥品或保健食品中。
因此，本發(fā)明的第一個目的是提供一種低分子量葡聚糖，其特征在于， 其是從黃芪中分離得到的。
所述低分子量葡聚糖的重均分子量為1651，其僅由葡萄糖組成，不含
4蛋白質(zhì)和核酸。
發(fā)明人將該葡聚糖命名為MAPS-1-W2-1G。 MAPS-1-W2-1G具有如下通式(l)所示的重復(fù)單元:
a—D —Glc D—Glcl^>a—D—Gle-
et—D—Glc 1
丄6
分子量葡聚糖的制備方法，為采用柱
其中x+y=ll。
本發(fā)明的第二個目的是提供該 層析的分離純化方法制備。
所述方法可包括如下步驟
a. 取黃芪多糖，溶解、離心，上清液透析并濃縮，得到濃縮物；
b. 取濃縮物，溶解、離心，上清液用陰離子交換樹脂或離子交換凝膠
柱層析進行初步分離，將所得流分分別濃縮、透析并干燥，得到若干組分；
c. 繼續(xù)用凝膠柱反復(fù)層析上述組分，得到純化的低分子量葡聚糖。
其中，b步驟中所述的陰離子交換樹脂可以選自DEAE-Cellulose DE52、 DEAE-Cellulose DE32、 CM-Cellulose CM52或CM-Cellulose CM32， 優(yōu)選DEAE-Cellulose DE52;所述的離子交換凝膠柱可以選自DEAE Sepharose F.F. 、 CM Sepharose F.F. 、 DEAE Sepharose CL-6B或CM Sepharose CL-6B;而c步驟中所述的凝膠柱可以選自Sephadex G25、 Sephadex G50、 Sephadex G75、 Sephadex G100、 Sephacryl S-100 HR、 Sephacryl S-200 HR、 Sephacryl S-300 HR、 Sephacryl S-400 HR、 Toyopeal HW-40、 Toyopeal HW-50、 Toyopeal HW-55、 Superdex 30、 Superdex 75、 Superdex 200、 Superdex 6或Superdex 12，優(yōu)選自Sephadex G25、 Sephadex G50、 Sephadex G75或Sephadex G100，最優(yōu)選Sephadex G50。
由于通過藥理實驗證明本發(fā)明從黃芪中分離得到的低分子量葡聚糖 具有明顯的免疫增強活性，因此，本發(fā)明的第三個目的是提供所述的低分 子量葡聚糖在制備免疫增強及腫瘤輔助治療藥物或保健食品中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第四個目的是提供一種藥物組合物或保健食品組合物，其由
所述的低分-
'聚糖和藥學上或食品學上可接受的賦形劑組成,


圖1為低分子:
圖2為低分子: 圖3為低分子: 圖4為低分子: 圖5為低分子: 圖6為低分子:
復(fù)葡聚糖MAPS-1-W2-1G在高效凝膠色譜柱上的色譜
:葡聚糖MAPS-1-W2-1G的單糖組成分析結(jié)果； :葡聚糖MAPS-1-W2-1G的紫外掃描圖譜； :葡聚糖MAPS-1-W2-1G的^C-NMR譜圖； :葡聚糖MAPS-1-W2-1G的IR譜圖； :葡聚糖MAPS-1-W2-1G的甲基化分析結(jié)果；
具體實施例方式
實施例1:黃芪多糖分離純化
(1) 黃芪多糖(MAPS)按專利楊義芳，許海燕，黃春躍. 一種精 制黃芪多糖的方法.中國發(fā)明專利200610024178.5所述方法分離提取， 得率為8.37%，純度為85.74%。
(2) 取(1)中得到的MAPS 50g，溶于適量的蒸餾水，5000rpm離 心20min，上清液對水透析(截留分子量3500)，透析袋內(nèi)溶液濃縮得到 MAPS-1 C12.6g)。
(3) 取(2)中得到的MAPS-1 4.0g，分5次，加入10ml蒸餾水溶解， 離心，上清液用DEAE-Cdlulose DE52柱(OH-型，40^4.Ocm，填料高30cm) 層析進行初步分離。首先以蒸餾水作為洗脫液，然后用0.01mol/L和 O.lmol/L的NaCl溶液洗脫，自動部分收集儀分別收集各流分，示差儀和 苯酚-硫酸法平行跟蹤檢測，并且根據(jù)檢測的結(jié)果合并相同流分，經(jīng)濃縮， 蒸餾水透析及冷凍干燥得到5個組分MAPS-1-W1 (808.8mg)，MAPS-l-W2 (383.2mg) ， MAPS-1-W3 (341.8mg) ， MAPS陽1-0.01M (1477.4mg)， MAPS-1-0.1M (227.9mg)。
(4) 組分MAPS-1-0.1M多糖含量較低，棄去。MAPS-1-W1， MAPS-1-W2， MAPS-1-W3部分分別繼續(xù)用Sephadex G-50凝膠柱
(100x2.6cm，填料高90cm)反復(fù)層析，MAPS-1-0.01M繼續(xù)用Sephacryl S-400 HR凝膠柱(100x2.6cm，填料高90cm)反復(fù)層析，分別用蒸餾水洗 脫，示差儀和苯酚-硫酸法平行跟蹤檢觀U，合并流分，冷凍干燥。MAPS-1-W1部分純化得到一個純葡聚糖MAPS-1-W1-1G (1); MAPS-1-W2部分純化得 到兩個純多糖MAPS-1-W2-1G (2)和MAPS-1-W2-2G (3); MAPS-1-W3部 分純化得至l丄兩個純多糖MAPS-1-W2-2G(3)禾口 MAPS-1-W3-1G(4); MAPS-1-0.01M部分純化得到一個純多糖MAPS-1-0.01M-1S (5)。
實施例2:黃芪多糖分離純化
(1) 黃芪多糖(MAPS)按專利楊義芳，許海燕，黃春躍. 一種精 制黃芪多糖的方法.中國發(fā)明專利200610024178.5所述方法分離提取， 得率為8.37%，純度為85.74%。
(2) 取(1)中得到的MAPS 50g，溶于適量的蒸餾水，5000rpm離 心20min，上清液對水透析(截留分子量3500)，透析袋內(nèi)溶液濃縮得到 MAPS-1 (12.6g)。
(3) 取(2)中得到的MAPS-1 4.0g，分5次，加入10ml蒸餾水溶解， 離心，上清液用DEAE-Cellulose DE52柱(OH-型，40x4.Ocm，填料高30cm) 層析進行初步分離。首先以蒸餾水作為洗脫液，然后用0.01mol/L和 O.lmol/L的NaCl溶液洗脫，自動部分收集儀分別收集各流分，示差儀和 苯酚-硫酸法平行跟蹤檢測，并且根據(jù)檢測的結(jié)果合并相同流分，經(jīng)濃縮， 蒸餾水透析及冷凍干燥得到5個組分MAPS-1-W1 (808.8mg)，MAPS-l-W2 (383.2mg) ， MAPS-1-W3 (341.8mg) ， MAPS-1-0.01M (1477.4mg)， MAPS-1-0.1M (227.9mg)。
(4) 組分MAPS-1-0.1M多糖含量較低，棄去。MAPS-1-W1， MAPS-1-W2， MAPS-1-W3部分分別繼續(xù)用Toyopeal HW-40F凝膠柱
(100x2.6cm，填料高90cm)反復(fù)層析，MAPS-1-0.01M繼續(xù)用Toyopeal HW-50F凝膠柱(100x2.6cm，填料高90cm)反復(fù)層析，分別用蒸餾水洗 脫，示差儀和苯酚-硫酸法平行跟蹤檢測，合并流分，冷凍干燥。MAPS-1-W1 部分純化得到一個純葡聚糖MAPS-1-W1-1G (1); MAPS-1-W2部分純化得 到兩個純多糖MAPS-1-W2-1G (2)和MAPS-1-W2-2G (3); MAPS-1-W3部 分純化得到兩個純多糖MAPS-1-W2-2G(3)禾卩MAPS-1-W3-1G(4); MAPS-1-0.01M部分純化得到一個純多糖MAPS-1-0.01M-1S (5)。實施例3:黃芪多糖分離純化
(1) 黃芪多糖(MAPS)按專利楊義芳，許海燕，黃春躍. 一種精
制黃芪多糖的方法.中國發(fā)明專利200610024178.5所述方法分離提取， 得率為8.37%,純度為85.74%。
(2) 取(1)中得到的MAPS 50g，溶于適量的蒸餾水，5000rpm離 心20min，上清液對水透析(截留分子量3500)，透析袋內(nèi)溶液濃縮得到 MAPS-1 (12.6g)。
(3) 取(2)中得到的MAPS-1 4.0g，分5次，加入10ml蒸餾水溶解， 離心，上清液用DEAE Sepharose F.F.柱(40x4.0cm，填料高30cm)層析進行 初步分離。首先以蒸餾水作為洗脫液，然后用0.01mol/L的NaCl溶液洗脫， 自動部分收集儀分別收集各流分，示差儀和苯酚-硫酸法平行跟蹤檢測，并 且根據(jù)檢測的結(jié)果合并相同流分，經(jīng)濃縮，蒸餾水透析及冷凍干燥得到5 個組分。將水洗脫得到的四個組分繼續(xù)分別用Sephacryl S-100 HR凝膠柱
(100x2.6cm，填料高卯cm)反復(fù)層析，得到四個純多糖MAPS-1-W1-1G (1)、 MAPS-1-W2-1G(2) 、 MAPS-1-W2-2G(3)禾Q MAPS-1-W3-1G(4); 將 0.01mol/L NaCl溶液洗脫得到的組分繼續(xù)用Sephadex G-100凝膠柱
(100x2.6cm，填料高90cm)反復(fù)層析，得到一個純多糖MAPS-1-0,01M-1S (5)。
實施例4:黃芪多糖分離純化
(1) 黃芪多糖(MAPS)按專利楊義芳，許海燕，黃春躍. 一種精 制黃芪多糖的方法.中國發(fā)明專利200610024178.5所述方法分離提取， 得率為8.37%，純度為85.74%。
(2) 取(1)中得到的MAPS 50g，溶于適量的蒸餾水，5000rpm離 心20min，上清液對水透析(截留分子量3500)，透析袋內(nèi)溶液濃縮得到 MAPS-1 (12.6g)。
(3) 取(2)中得到的MAPS-1 4.0g，分5次，加入10ml蒸餾水溶解， 離心，上清液用DEAE Sepharose CL-6B柱(40x4.0cm，填料高30cm)層析 進行初步分離。首先以蒸餾水作為洗脫液，然后用0.01mol/L的NaCl溶液 洗脫，自動部分收集儀分別收集各流分，示差儀和苯酚-硫酸法平行跟蹤檢測，并且根據(jù)檢測的結(jié)果合并相同流分，經(jīng)濃縮，蒸餾水透析及冷凍干燥
得到5個組分。將水洗脫得到的四個組分繼續(xù)分別用Superdex 30凝膠柱 (100x2.6cm，填料高卯cm)反復(fù)層析，得到四個純多糖MAPS-1-W1-1G (1)、 MAPS-1-W2-1G(2)、 MAPS隱1-W2-2G(3)和MAPS-1-W3-1G(4);將 0.01mol/L NaCl溶液洗脫得到的組分繼續(xù)用Superdex6凝膠柱(100x2.6cm， 填料高90cm)反復(fù)層析，得到一個純多糖MAPS-1-0.01M-1S (5)。
實施例5:低分子量葡聚糖MAPS-1-W2-1G的化學結(jié)構(gòu)的鑒定 葡聚糖MAPS-1-W2-1G，經(jīng)高效凝膠色譜柱色譜(PolySep-GFC-P200， 300x7.8mm)，譜圖出現(xiàn)單一對稱峰(圖1)，表明純度已達到對其進行 結(jié)構(gòu)、藥理研究的要求，同時測定其重均分子量為1651，經(jīng)氣相色譜圖分 析(圖2) ， MAPS-1-W2-1G僅由葡萄糖組成，為一葡聚糖。經(jīng)紫外掃描 圖譜(圖3) ， MAPS-1-W2-1G在260nm和280nm附近均無蛋白質(zhì)和氨基 酸的特征吸收峰，同時茚三酮反應(yīng)、考馬斯亮藍反應(yīng)均呈陰性，表明其不 含蛋白質(zhì)和核酸。MAPS-1-W2-1G的"C-NMR譜圖中(圖4)，端基碳的 化學位移均在103ppm以下，其中94-103ppm信號峰為C-l信號，表明其 構(gòu)型為a構(gòu)型，這與IR譜圖(圖5)分析結(jié)果是一致的。根據(jù)NMR譜峰的 歸屬、甲基化分析(圖6)以及高碘酸氧化和Smith降解結(jié)果，證明多糖 MAPS-1-W2-1G的一級結(jié)構(gòu)是具有分支的(1—4)-a-葡聚糖，主鏈上平均 約每13個糖殘基中有2個糖殘基的C-6位被葡萄糖取代，其重復(fù)單元可
表示如下
a—D—Glc a — D — Glc
1 1
~ a—D —Glc、 、a—D—Glc1 (、a—D—Glc13~W —D —Glc1~
X 、
x+y=ll
實施例6
無菌條件下取低分子量葡聚糖MAPS-1-W2-1G 5g，加入注射用水 2000ml中，經(jīng)G4漏斗過濾后，分裝滅菌，制得1000支注射液。
實施例7
9取低分子量葡聚糖MAPS-1-W2-1G 10g，藥用淀粉60g，糊精60g， 50% 乙醇適量，將上述原料充分攪拌混合制成顆粒，在60-7(TC干燥2-4小時， 制成1000片。
實施例8
取低分子量葡聚糖MAPS-1-W2-1G 10g，藥用淀粉100g， 50%乙醇適 量，制粒，整粒，烘干，裝成1000個膠囊。
實驗例l:本發(fā)明化合物MAPS-l-W2-lG在體外對刀蛋白(Con A)或脂 多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細胞增殖的影響
對照物為黃芪多糖AG-l、AG-2和A2Nb，其中黃芪多糖AG-1和AG-2 按文獻黃喬書，呂歸寶，李雅臣，等.黃芪多糖的研究[J].藥學學報，1982， 17(3): 200-206所述方法分離純化得到。其中，AG-1為水溶性多糖， 結(jié)構(gòu)為a-(1—4)(1 —6)-葡聚糖，(1 —4)和(1 —6)糖苷鍵的糖基組成比例為 5:2; AG-2為水不溶性多糖，結(jié)構(gòu)為a-(1—4)-葡聚糖；黃芪多糖A2Nb按 文獻王瑩，趙毅民，張起鳳，等.黃芪中一種新葡聚糖的分離純化與化 學結(jié)構(gòu)研究[J].中草藥，2001， 32 (11): 962-964所述方法分離純化得 到。A2Nb的平均分子量為3.6X105，主要連接方式為a-(1 —4)-D-Glc，在 每25個葡萄糖中有一個C-6位上的分支。
按照文獻(徐叔云.藥理實驗方法學(第三版)[M].北京人民衛(wèi)生 出版社，2001， 1426-1427; Zhao C, Li M, Luo YF, et al. Isolation and structural characterization of an immunostimulating polysaccharide from Fuzi, Aconitum carmichael肌Carbohydrate Research, 2006, 341(4): 485-491)的 方法，將小鼠脾細胞懸液點于96孔培養(yǎng)板上，每孔100pL，設(shè)一個對照 組，再加入50(iL的Con A或LPS (終濃度為2.5嗎/mL或10嗎/mL)，最 后加入不同量的多糖樣品(終濃度為10, 50, 100嗎/mL)，每孔培養(yǎng)液補 足為200(iL。將細胞培養(yǎng)板置于含有5%C02， 37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72h后， 加入MTT溶液(5mg/mL) 1Q)iL，置于5%C02， 37。C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4h。取出反應(yīng)物，離心(2000rpm， 5min)，棄上清，每孔加入15QjaLDMSO， 充分振蕩，待凝塊完全溶解后在酶標測定儀上570nm讀出A值。
所得實驗數(shù)據(jù)用mean士S.D.表示，測試樣品與對照組的顯著性差異與否用t-檢驗來評價。結(jié)果如表l所示。
表1 MAPS-1-W2-1G在體外對Con A或LPS誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細胞 增殖的影響
樣品濃度(pg/mL)Con A (A57o)LPS (A570)
空白-0.185±0.0130.196±0.014
100.268±0.0940.146±0.034
MAPS500.328±0.039"0.182±0.053
1000.244±0.0480.157±0.017*
100.278±0.0670.189±0.041
MAPS-l-Wl-lG500.344±0.026"*0.191±0.030
1000.3I1±0.0880.139±0.030*
100.254 ±0.026*0.175±0.030
MAPS-1-W2-1G500.302±0.022"0.197±0.017
1000.335±0.034"0.168±0.017
100.345±0.014*"0.185±0.001
MAPS-1-W2-2G500.276±0.010"*0.180±0.030
1000.340±0.015***0.1卯±0.012
100.330±0.034**0.204±0.020
MAPS-1-W3-1G500.304±0.009,0.181 士O.032
1000.256±0.019**0.171±0.024
100.314±0.009***0.163±0.030
MAPS-1-0.01M-1500.335±0.015***0.204±0.028
S1000.281 ±0.023**0.190±0.013
100.163±0.0160.195±0.019
AG-1500.172±0.0120.190±0.0]5
1000.176±0.0220.257±0.037
100.193±0.0060.193±0.030
AG-2500.196±0.0210.212±0.021
1000.193±0.0130.189±0.016
100.188±0.000.226±0.035
A2Nb500.303±0.049*0.223±0.022100 0.189±0.013 0.194±0.012
注與空白比較，*P<0.05， **P<0.01， ***P<0.001。
從上表可以看出葡聚糖MAPS-1-W2-1G具有顯著的促進T淋巴細 胞增殖活性，且活性較未經(jīng)分離純化的黃芪多糖MAPS以及多糖AG-1、 AG-2和A2Nb活性好；而對于LPS誘導(dǎo)小鼠脾臟B淋巴細胞增殖反應(yīng)， 葡聚糖MAPS-1-W2-1G對細胞增殖沒有明顯的影響。
權(quán)利要求
1、低分子量葡聚糖，其特征在于，其是從黃芪中分離得到的。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的低分子量葡聚糖，其特征在于，其重均分子:為1651。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的低分子量葡聚糖，其特征在于，其具有 l下通式(l)所示的重復(fù)單元<formula>formula see original document page 2</formula>(1)其中x+y=ll。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的低分子量葡聚糖的制備方法，其 特征在于，該方法采用柱層析分離純化制得所述低分子量葡聚糖。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，該方法包括如下 步驟a. 取黃芪多糖，溶解、離心，上清液透析并濃縮，得到濃縮物；b. 取濃縮物，溶解、離心，上清液用陰離子交換樹脂或離子交換凝膠 柱層析進行初步分離，將所得流份分別濃縮、透析并干燥，得到若干組分；c. 繼續(xù)用凝膠柱反復(fù)層析上述組分，得到純化的低分子量葡聚糖。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，b步驟中所述的 陰離子交換樹脂選自DEAE-Cellulose DE52、 DEAE-Cellulose DE32、 CM-Cellulose CM52或CM-Cellulose CM32,單獨或混合使用。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，b步驟中所述的 陰離子交換樹脂選自DEAE-Cellulose DE52系列。
8、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，b步驟中所述的 離子交換凝膠柱選自DEAE Sepharose F.F.、 CM Sepharose F.F.、 DEAE Sepharose CL-6B或CM Sepharose CL-6B，單獨或混合使用。
9、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，c步驟中所述的 凝膠柱選自Sephadex G25、 Sephadex G50、 Sephadex G75、 Sephadex G100、Sephacryl S-100 HR、 Sephacryl S-200 HR、 Sephacryl S-300 HR、 Sephacryl S-楊HR、 Toyopeal HW-40、 Toyopeal HW-50、 Toyopeal HW-55、 Superdex 30、 Superdex 75、 Superdex 200、 Superdex 6或Superdex 12，單獨或混合 使用。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，c步驟中所述的 凝膠柱選自Sephadex G25、 Sephadex G50、 Sephadex G75或Sephadex G100。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，c步驟中所述 的凝膠柱是Sephadex G50。
12、 權(quán)利要求1至3任一所述的低分子量葡聚糖在制備免疫增強及腫 瘤輔助治療藥物或保健食品中的應(yīng)用。
13、 一種組合物，其由權(quán)利要求1至3任一所述的低分子量葡聚糖和 藥學上可接受的賦形劑組成。
全文摘要
本發(fā)明公開一種低分子量葡聚糖，其特征在于，其是從黃芪中分離得到的。本發(fā)明也公開上述低分子量葡聚糖的分離純化方法。本發(fā)明還公開所述低分子量葡聚糖在制備免疫增強及腫瘤輔助治療藥物或保健食品中的應(yīng)用。
文檔編號A61P37/00GK101676303SQ20091013325
公開日2010年3月24日 申請日期2009年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月16日
發(fā)明者楊義芳, 林夢感 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院