專利名稱：：白芷總香素提取物在制備5-羥色胺調(diào)節(jié)劑的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了白芷總香素提取物的用途，屬于藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：5-羥色胺(5-Hydroxytryplamine.5-HT)，5-羥色胺(5-HT)又稱血清素，含量為0.222.06umol/L，39361ug/L;主要來自胃腸道及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其余分布在血小板、肺、血清、唾液腺等組織中。當(dāng)體內(nèi)5-羥色胺升高時(shí)，會(huì)出現(xiàn)消化道、肝、腎、肺或腦類癌綜合征、慢性胰腺炎；5-羥色胺降低時(shí)，會(huì)出現(xiàn)震顫麻痹、偏頭痛、苯酮尿癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。偏頭痛的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)理至今仍是世界醫(yī)學(xué)研究的課題，眾多學(xué)者根據(jù)自己的研究成果提出了不同的解釋，都有一定的研究依據(jù)，但也存在相當(dāng)?shù)木窒扌?。到目前為止有關(guān)偏頭痛的發(fā)病機(jī)理主要有生化源學(xué)說、血管學(xué)說、神經(jīng)學(xué)說、神經(jīng)血管聯(lián)合學(xué)說等，其中，生化源學(xué)說指出5-羥色胺與偏頭痛的關(guān)系，早在上個(gè)世紀(jì)60年代，國外學(xué)者就發(fā)現(xiàn)偏頭痛發(fā)作期患者血漿中5-羥色胺(5-hydroxvtryptamine，5-HT)含量降低，5-HT可減輕偏頭痛的急性發(fā)作。該學(xué)說認(rèn)為5-HT的釋放在偏頭痛的病理過程中扮演了十分重要的角色。首先因某些原因偏頭痛患者血液中可特異性作用于血小板的5-HT釋放因子升高，使血小板釋放5-HT。釋放的5-HT使顱內(nèi)血管收縮，引起缺血的前驅(qū)癥狀，同時(shí)顱內(nèi)血管收縮導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)，興奮交感神經(jīng)，使血中腎上腺素和游離脂肪酸增加，作用于血小板，產(chǎn)生血栓素A2(ThromboxanA2，TXA2)，TXA2主要在血小板微粒體內(nèi)合成，具有很強(qiáng)的收縮血管作用，進(jìn)一步促進(jìn)5-HT對顱內(nèi)血管的收縮。升高的5-HT被單胺氧化酶A(Monoamineoxidasea，MAO-A)所不斷分解，變成五羥卩引哚乙酸(5-hydroxyindoleaceticacid，5-HIAA)由尿中排出，其結(jié)果使5-HT耗竭，繼發(fā)性地引起血管的過度擴(kuò)張，從而產(chǎn)生搏動(dòng)性頭痛。此外，5-HT能增加血管通透性，使緩激肽或組胺滲出，導(dǎo)致血管周圍腫脹，產(chǎn)生無菌性炎癥，使搏動(dòng)性頭痛不久后變成持續(xù)性頭痛。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療偏頭痛急性發(fā)作有效藥物，主要包括兩類非選擇性受體激動(dòng)劑和選擇性5-HT^受體激動(dòng)劑。麥角堿類，如麥角胺、二氫麥角胺(麥角胺的衍生物)等屬非選擇性5-HT,受體激動(dòng)劑，對5-HT,、5-HT2、去甲腎上腺素和多巴胺受體都有作用，導(dǎo)致外周血管收縮，從而緩解偏頭痛；曲坦類為選擇性5-HT,受體激動(dòng)劑，為新的一類急性偏頭痛治療藥；包括第一代曲坦類,藥物如:舒馬曲坦(sumatriptan),也稱英明格，5-HT1B/1D受體激動(dòng)劑，具收縮血管作用外，還能于三叉神經(jīng)軸索中存在的抑制性受體結(jié)合，抑制三叉神經(jīng)核的c-fos的產(chǎn)生，抑制神經(jīng)源性炎癥，降低導(dǎo)致P物質(zhì)(substanceP，SP)和降轉(zhuǎn)素基因相關(guān)肽(calcitoningene-relatedpeptide,CGRP)等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。第二代曲坦類藥物如:佐米曲坦(zolmitriptan)、那拉曲坦(naratriptan)、禾廿扎曲坦(rizatriptan)、氟伐曲坦(frovatriptan)、依立曲坦(eletriptan)、阿莫曲坦(almotriptan)等。該類藥物對大部分偏頭痛發(fā)作患者有效。白芷為一種常用中藥，具有驅(qū)風(fēng)散寒、燥濕排膿之功效，常用于治療風(fēng)寒感冒、鼻淵頭痛等癥?！吨袊幍洹?000年版收載的白芷為傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.exHoffin.)Benth.etHook.f.或杭白芷A.dahurica(Fisch.exHoffin.)Benth.etHook.f.var.formosana(Boiss.)ShanetYuan的干燥根，所含有效成分主要為氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素等香豆素類化合物。白芷香豆素有抗炎、抑制前列腺素E2的產(chǎn)生、抗組胺作用、光敏作用、對脂肪細(xì)胞的作用、對平滑肌的作用、抗微生物作用等(見杜興旭等，中藥白芷香豆素類成分的研究進(jìn)展，井岡山學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué))，第26巻第2期，2005年10月)；秦旭華等，川白芷總香豆素治療偏頭痛的部分藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，四川中醫(yī)，2008年06期，報(bào)道中藥白芷香豆素對硝酸甘油致實(shí)驗(yàn)性偏頭痛的藥效。目前尚無相關(guān)白芷總香素提取物作為5-羥色胺調(diào)節(jié)劑的藥物的文獻(xiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了白芷總香素提取物的新用途，具體地，是在制備5-羥色胺調(diào)節(jié)劑的藥物中的用途，本發(fā)明另一技術(shù)方案是提供了一種具有5-羥色胺調(diào)節(jié)劑的藥物組合物。本發(fā)明提供了白芷總香素提取物在制備5-羥色胺調(diào)節(jié)劑的藥物中的用途。其中，所述的藥物是治療偏頭痛的藥物。其中，所述的白芷總香素素提取物中總香豆素的含量應(yīng)不低于44.672mg/g，歐前胡素的含量應(yīng)不低于68.623mg/g。其中，所述的白芷總香素素提取物的HPLC色譜如圖1所示，含有14個(gè)共有指紋峰；其色譜條件為色譜柱AichromReliasilC18色譜柱(4.6mmx250mm，5)um)，流動(dòng)相甲醇、水和四氫呋喃梯度洗脫，柱溫40°C，流速lml/min，波長300nm，進(jìn)樣量5pl，甲醇、水及四氫呋喃梯度洗脫時(shí)間和比例為洗脫時(shí)間Omin，水、四氫呋喃、甲醇的重量百分比分別為水占60%，四氫呋喃8%，甲醇32%;洗脫時(shí)間10min，水、四氫呋喃、甲醇的重量百分比分別為水占60%，四氫呋喃8%，甲醇32%;洗脫時(shí)間50min，水、四氫呋喃、甲醇的重量百分比分別為水占20%，四氫呋喃16%，甲醇64%。其中，所述的共有峰的平均相對保留時(shí)間(min)為7.911、9.731、13.390、16.59、19.997、23.964、29.512、30.271、31.949、34.525、37.298、39,161、39.957、42.096。其中，所述的白芷香豆素的制備方法包括如下步驟a、白芷55-95%乙醇提取液減壓回收乙醇，濃縮；b、將a步驟濃縮，加入石油醚萃取，棄去石油醚萃取層；萃余相加入乙酸乙酯萃取，合并萃取相，減壓回收乙酸乙酯，即得。進(jìn)一步優(yōu)選地，a步驟所述的白芷藥材粒度為20目，乙醇提取為75%乙醇熱回流提取。本發(fā)明還提供了一種調(diào)節(jié)5-羥色胺的藥物組合物，它是由所述的白芷總香豆素提取物為活性成分，加入藥學(xué)上可接受的輔料制備而成的藥劑。其中，所述的藥劑是口服制劑或經(jīng)皮給藥制劑。其中，所述的經(jīng)皮給藥制劑中輔料促滲劑為氮酮、油酸和冰片。本發(fā)明藥物5-羥色胺調(diào)節(jié)劑，除了治療偏頭痛外，還可治療5-羥色胺降低引起的其它疾病，藥效明確，適應(yīng)癥針對性強(qiáng)，為臨床提供了一種新的選擇。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。圖l標(biāo)注共有峰的樣品HPLC色譜圖圖210批樣品的HPLC指紋圖譜具體實(shí)施例方式實(shí)施例l本發(fā)明白芷香豆素的制備稱取白芷藥材粗粉(20目)5000g，共10份，分別加入8倍量75%的乙醇提取3次，每次3小時(shí)，濾過，合并提取液，減壓回收乙醇，將藥液減壓濃縮至濃度為每ml相當(dāng)于2g藥材，放冷，分別加入2倍量石油醚萃取1次后，棄去石油醚層(即萃取相)，萃余相再分別加入乙酸乙酯萃取3次，每次加入2倍量乙酸乙酯，合并萃取相，減壓回收乙酸乙酯，將浸膏進(jìn)行真空濃縮干燥，即得川白芷香豆素有效部位提取物。上述川白芷香豆素有效部位提取物為活性成分，可制備成常用口服制劑及經(jīng)皮給藥制劑。除了采用上述方法制備的白芷香豆素外，還可以直接購買市售的白芷香豆素。實(shí)施例2本發(fā)明白芷香豆素的制備稱取白芷藥材粗粉(20目)5000g，共10份，分別加入8倍量55%的乙醇提取3次，每次3小時(shí)，濾過，合并提取液，減壓回收乙醇，將藥液減壓濃縮至濃度為每ml相當(dāng)于2g藥材，放冷，分別加入2倍量石油醚萃取1次后，棄去石油醚層(即萃取相)，萃余相再分別加入乙酸乙酯萃取3次，每次加入2倍量乙酸乙酯，合并萃取相，減壓回收乙酸乙酯，將浸膏進(jìn)行真空濃縮干燥，即得川白芷香豆素有效部位提取物。實(shí)施例3本發(fā)明白芷香豆素的制備稱取白芷藥材粗粉(20目)5000g，共10份，分別加入8倍量95%的乙醇提取3次，每次3小時(shí)，濾過，合并提取液，減壓回收乙醇，將藥液減壓濃縮至濃度為每ml相當(dāng)于2g藥材，放冷，分別加入2倍量石油醚萃取1次后，棄去石油醚層(即萃取相)，萃余相再分別加入乙酸乙酯萃取3次，每次加入2倍量乙酸乙酯，合并萃取相，減壓回收乙酸乙酯，將浸膏進(jìn)行真空濃縮干燥，即得川白芷香豆素有效部位提取物。實(shí)施例4本發(fā)明藥物的制備取實(shí)施例l制備的白芷香豆素10g，加入淀粉制粒，整粒，得顆粒劑。實(shí)施例5本發(fā)明經(jīng)皮給藥制劑的制備取實(shí)施例1的制備的白芷香豆素10g，加入氮酮、油酸和冰片中的一種或混合，作為促滲劑，可直接制備成外用透皮給藥制劑。白芷香豆素的透皮促進(jìn)作用試驗(yàn)皮膚表皮的角質(zhì)層對外用藥物形成了-道難以滲透的生理屏障，要使藥物在一定時(shí)間內(nèi)經(jīng)皮滲透并達(dá)到治療所需的血藥濃度，皮用透皮吸收促進(jìn)劑是增加藥物透皮吸收的首選方法。滲透促進(jìn)劑種類繁多，本實(shí)驗(yàn)分別選擇了有機(jī)溶劑類、有機(jī)酸脂類、氮酮類和天然產(chǎn)物四類滲透促進(jìn)劑中具有代表性的乙醇、油酸、氮酮和冰片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。稱取一定量川白芷香豆素類有效部位，用不同濃度乙醇溶液超聲處理制備成促滲劑為乙醇的供試品；用蒸餾水處理后加入各比例量的水溶性氮酮作為促滲劑為氮酮的供試品；油酸和冰片用少量乙醇溶解后，加入到白芷有效部位的混懸液中超聲處理作為促滲劑分別為油酸和冰片的供試液，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下。(1)乙醇乙醇的促滲機(jī)制一定程度上是通過對角質(zhì)層細(xì)胞的溶劑化(水化)作用，降低角質(zhì)層的界面張力。根據(jù)其常用劑量選擇10%、20%、40。/。濃度乙醇配制樣品溶液，按上述確定的透皮實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行篩選。結(jié)果見表l、2。表l不同比例乙醇對累積滲透量的影響(n=3)促滲劑Q(|ig/cm2)lh2h4h6h8h10h12h18h24h10%乙醇3.55017.856320.032733.856246.012453.206161.023476.5932109.032120。/o乙醇3.69638.021325.698340.231550.230260.231577.963291.1203120.321040%乙醇3.56938.123024.963242.751253.632066.032175.8210卯.8652125.4723表2不同比例乙醇的體外滲藥動(dòng)力學(xué)方程促滲劑方程J(pg/cm2h)10%乙醇Q=4.4291t+3.85454.42910.98920%乙醇Q=5.0228t+5.61945.02280.98540%乙醇Q=5.1554t+5.89155.15540.983上述結(jié)果表明單獨(dú)使用乙醇對川白芷香豆素有效部位中歐前胡素的促滲作用較弱。(2)油酸(OA)油酸屬于脂肪酸類滲透促進(jìn)劑，其與皮膚中的脂肪酸有相似的結(jié)構(gòu)，分子中存在的不飽和雙鍵使其具有不對稱的空間結(jié)構(gòu)。其作用機(jī)制主要是滲入角質(zhì)層脂質(zhì)雙分子層疏水結(jié)構(gòu)時(shí)，由于其不飽和疏水鏈的順式結(jié)構(gòu)，使雙分子層扭轉(zhuǎn)，形成微細(xì)的易于滲z透的流動(dòng)性通道，有效地影響了角質(zhì)層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的有序排列，影響其有序排列；降低角質(zhì)層脂質(zhì)雙分子層的相轉(zhuǎn)變溫度；引起角質(zhì)層脂質(zhì)固-液相分離和晶型轉(zhuǎn)變；增加藥物在角質(zhì)層的分布。油酸主要是影響非極性通道，由于它的不飽和疏水鏈的順式結(jié)構(gòu)，形成不對稱的空間構(gòu)型，增加了膜的運(yùn)動(dòng)自由度和流動(dòng)性。油酸常用量為5%，濃度過高(〉20%)則對皮膚有刺激性，故選擇加入2%、5%、8%三種不同濃度的油酸，測定其對白芷香豆素有效部位中歐前胡素體外滲透性的影響，結(jié)果見表3、表4。_表3不同比例油酸對累積滲透量的影響(n=3)_Q(jig/cm2)促滲劑-lh2h4h6h8h10h12h18h24h2%OA12.023130.212090.2300125.6354198.0325238.2305270.5862396.0235472.02355%OA10.365226.302362.350184.3210130.2563186.3201221.3560300.2354398.32018%OA10.247522.530245.230277.0231110.2365152.368201.4023256.3210302.7563表4不同比例油酸的體外滲藥動(dòng)力學(xué)方程(n==3)促滲劑方程J(i-ig/cm2h)2%OAQ=20.653t+8.613220.6530.9925%OAQ=17.165t-4.359917.1650.9968%OAQ=13.574t+2.705913.5740.986試驗(yàn)結(jié)果表明，白芷香豆素有效部位中加入2%的油酸作為滲透促進(jìn)劑時(shí)，其滲透速率最大。(3)氮酮(Azone)氮酮是近年來國內(nèi)外使用較多的促滲劑，由弱極性長鏈垸烴或烯烴組成，其性質(zhì)穩(wěn)定、無毒、無味、無刺激性。氮酮的作用機(jī)制是①與脂質(zhì)相互作用滲入皮膚角質(zhì)層和經(jīng)毛囊途徑滲入毛囊內(nèi)根鞘，與細(xì)胞間脂質(zhì)或生物膜類脂質(zhì)作用，溶解脂質(zhì)后形成間隙(表現(xiàn)為表皮裂隙增大和毛囊口孔徑拓寬)或使該層細(xì)胞間脂質(zhì)排列有序性下降，膜脂的流動(dòng)性增加，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)變得疏松，外層角質(zhì)易于脫落，降低藥物在角質(zhì)層和毛囊內(nèi)根鞘擴(kuò)散阻力，促進(jìn)藥物經(jīng)表皮細(xì)胞間隙和毛囊途徑吸收②與角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)相互作用，進(jìn)入角質(zhì)層內(nèi)的氮酮液化細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)使擴(kuò)散阻力減少③水化機(jī)制氮酮增加皮膚角質(zhì)層含水量，使該層細(xì)胞(尤其是基底角質(zhì)層的細(xì)胞)膨脹(體積增大)，藥物在該層形成儲庫，從而維持一定的藥物釋放和作用時(shí)間，促進(jìn)水溶性物質(zhì)經(jīng)水性通道滲透吸收。氮酮的常用濃度一般為1%10%，有文獻(xiàn)報(bào)道它的促滲作用往往不隨使用濃度的提高而增加。氮酮的最佳濃度與藥物的物理化學(xué)性質(zhì)及所用介質(zhì)有關(guān)，最佳用量須根據(jù)藥物及其劑型通過實(shí)驗(yàn)求出，用量過多，可能得到相反的效果。因此我們分別比較了2%、4%、6%三種不同濃度的氮酮對白芷香豆素有效部位中歐前胡素體外滲透性的影響，結(jié)果見表5、表6。表5不同比例氮酮對累積滲透量的影響(n=3)促滲劑Q(ng/cm2)lh2h4h6h8h10h12h18h24h2%Azotic4%AzoneG%Azonc8.230511.02305.032121.032532.052316.352060.325388.356240.253684.2365137.023563.3204142.0235220.3562115.0232172.3205263.5632132.0524203.2102304.2578163.0247245.3687401.2307198.6572302.3208485.0231256.3257表6不同比例氮酮的體外滲藥動(dòng)力學(xué)方程促滲劑方程J(pg/cm2h)r2%AzoneQ=13.121t+13.75113.1210.998斗o/oAzoneQ=21.231t+15.3621.2310.9846%Azone0=11.148t+4.716211.1480.983由以上數(shù)據(jù)可以看出，氮酮對歐前胡素的經(jīng)皮滲透具有明顯的促進(jìn)作用，在一定范圍內(nèi)，隨著氮酮濃度的增加促滲作用逐漸增大，當(dāng)濃度增大到4%時(shí)，促滲效果最好，但繼續(xù)提高氮酮的濃度，其促滲作用反而下降。有文獻(xiàn)報(bào)道，對一些藥物而言，氮酮的濃度與促滲作用之間呈拋物線的關(guān)系，即在一定的濃度范圍內(nèi)具有最佳的促滲作用，以后隨著氮酮濃度的增加其促滲作用反而降低，甚至有抑制藥物經(jīng)皮滲透的作用。(4)冰片冰片的促滲作用與氮酮類似，其常用劑量為1%3%，故選擇1%、2%、3%三個(gè)濃度進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表7、表8。表7不同比例冰片對累積滲透量的影響(n=3)促滲劑Q(ng/cm2)lh2h4h6h8h10h12h18h24h1%冰片2%冰片3%冰片9.365418.320112.302414.250330.230520.321570.3656150.2304120.3214102.3210200.3201153.0254135.6853256.3214203.4527182.0452336.0258256.3254200.8563410.2356312.0547224.0245463.3201352.7856342.0235652.3214503.2546表8不同比例冰片的體外滲藥動(dòng)力學(xué)方程促滲劑方程J((ig/cm2h)r1%冰片Q=13.83X+11.70613.830.9782%冰片Q:26.卯5t十25.60226.9050.9823%冰片Q=20.666t+19.69720.6660.981測定結(jié)果表明冰片對歐前胡素有較強(qiáng)的促滲作用，其中加入2%的冰片后滲透速率J值最大。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果①除乙醇外，氮酮、油酸和冰片均具有促進(jìn)白芷香豆素類有效部位滲透的作用，其中濃度為2%的冰片促透作用最強(qiáng)。這是由于冰片為雙環(huán)單萜類化合物，可不同程度地改變皮膚的理化性質(zhì)，從而改變了藥物在皮膚和介質(zhì)間的分配特性，增加了藥物的透過性。②促滲劑濃度大小同樣影響對白芷香豆素類有效部位的滲透作用，3種促滲劑中以濃度為2%的促透作用最強(qiáng)。這與促滲劑的作用機(jī)理、在接受介質(zhì)中的溶解性以及藥物的性質(zhì)有關(guān)。@加入2%的氮酮或冰片后，以歐前胡素為定量指標(biāo)的滲透系數(shù)與未加前相比分別增加了5.2和6.6倍。實(shí)施例4本發(fā)明白芷香豆素提取物的含量測定①色譜條件色譜柱AichromReliasilC18色譜柱(4.6mmx250mm，5fim);流動(dòng)相甲醇-水(70:30);流速l.OmLmin—1;檢測波長300nm;柱溫35°C。②溶液的制備A對照品溶液的制備精密稱取歐前胡素對照品適量，加甲醇制成每lml含0.0521mg的溶液作為對照品溶液。B樣品供試液的制備稱取實(shí)施例1川白芷香豆素有效部位樣品0.101g(批號061008)置50ml量瓶中，用甲醇溶解并定至刻度，精密量取2ml至10ml量瓶中，用甲醇稀釋并定至刻度，搖勻，用0.45Wn微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得樣品供試液。③系統(tǒng)適用性試驗(yàn)分別吸取對照品溶液7pL、樣品溶液10pL，按以上色譜條件注入液相色譜儀測定，記錄色譜圖。采用上述色譜條件，歐前胡素的保留時(shí)間為。1.5min，分離度大于1.5，可見歐前胡素的分離效果較好。重現(xiàn)性試驗(yàn)按上述含量測定方法，對同一批樣品(批號061008)平行實(shí)驗(yàn)5次，測定樣品中歐前胡素的含量，其結(jié)果見表9。表9樣品重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>上述結(jié)果表明相對偏差RSD為0.52%<2%，說明測定時(shí)樣品供試液重現(xiàn)性良好。⑤白芷有效部位中總香豆素及歐前胡素的含量測定取10批樣品(批號:061006、061008、061010、061012、061014、061016、061018、061020、061022、061024)，按UV含量測定方法和上述HPLC含量測定方法對川白芷香豆素提取物進(jìn)行總香豆素和歐前胡素含量測定，結(jié)果見表10。表io白芷有效部位提取物含量測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>以上結(jié)果表明制備工藝條件較穩(wěn)定，各批川白芷香豆素有效部位含量變化較小，總香豆素含量平均值為55.849%，歐前胡素的平均值為85.779%，以上述平均值的80%計(jì)，暫定川白芷藥材中總香豆素的含量應(yīng)不低于44.672mg/g，歐前胡素的含量應(yīng)不低于68.623mg/g。實(shí)施例5川白芷香豆素有效部位的HPLC指紋圖譜(1)溶液制備①對照品溶液的制備，精密稱取歐前胡素對照品適量，加甲醇制成每lml含歐前胡素O.0521mg的溶液作為對照品溶液。②樣品供試液的制備取川白芷香豆素有效部位樣品(批號061008)0.lg置50ml量瓶中，加甲醇溶解并定至刻度，用0.45Mm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得樣品供試液。(2)色譜方法的建立川白芷香豆素有效部位HPLC指紋圖譜研究的最佳色譜條件為色譜柱AichromReliasilC^色譜柱(4.6mmx250mm，5nm)，流動(dòng)相甲醇、水和四氫呋喃梯度洗脫，柱溫40°C，流速lml/min，波長300nm，進(jìn)樣量5^1。(3)川白芷香豆素有效部位HPLC指紋圖譜的建立與分析①供試品溶液的制備取川白芷香豆素有效部位樣品(批號:061006、061008、061010、061012、061014、061016、061018、061020、061022、061024)各約0.lg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并定至刻度，搖勻，用0.45Mm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得樣品供試液。②川白芷香豆素有效部位指紋圖譜的建立和相似度評價(jià)a參照物選擇歐前胡素為香豆素類成分，同時(shí)也是白芷中主要藥效成分之一，含量較大，結(jié)構(gòu)明確，在樣品HPLC色譜圖中，歐前胡素的色譜峰與相鄰色譜峰分離度良好，峰位較居中，同時(shí)是所有樣品所共有的色譜峰，因此選擇香豆素的主要指標(biāo)成分歐前胡素(9號色譜峰)為白芷有效部位指紋圖譜的參照物。b共有峰的確定按上述實(shí)驗(yàn)方法及色譜條件對10批樣品進(jìn)行測定，比較各樣品的色譜圖，找出其相對穩(wěn)定的共有峰，以歐前胡素為參照峰(9號峰)，其它峰以阿拉伯?dāng)?shù)字按順序標(biāo)定，共標(biāo)定14個(gè)共有指紋峰，見圖l。c共有峰相對保留時(shí)間及相對峰面積的比較進(jìn)行10批樣品分析，以9號峰作為參照峰，各指紋峰的峰面積及相對峰面積、保留時(shí)間及相對保留時(shí)間均具有較好的重現(xiàn)性，RSD值均低于3%。共有峰的平均相對保留時(shí)間(min)為7.911、9.731、13.390、16.59、19.997、23.964、29.512、30.271、31.949、34.525、37.298、39.161、39.957、42.096，見圖1。d指紋圖譜的建立將所得的IO批樣品HPLC色譜圖數(shù)據(jù)用國家藥典委員會(huì)頒布的"中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004版A"進(jìn)行共有圖譜擬合，結(jié)果見圖2。由上圖結(jié)果可知IO批樣品的HPLC色譜峰的峰數(shù)、峰位、各峰面積之間均具有較高的相似性。e指紋圖譜相似度評價(jià)將所得的10批樣品HPLC色譜圖數(shù)據(jù)用國家藥典委員會(huì)頒布的"中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004版A"進(jìn)行全譜的相似度評價(jià)，結(jié)果見表11。表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>上述結(jié)果表明:IO批樣品相似度值分別為:0.998、0.991、0.998、0.999、0.991、0.996、0.996、0.997、0.997、0.999、1(參照圖譜)，10批樣品相關(guān)系數(shù)>0.99，具有較好的相似度。本法選取10批樣品建立共有模式，較好地保證了共有模式建立的代表性和科學(xué)性，樣品指紋圖譜中主要峰群的整體圖貌基本一致，雖然不同批次川白芷香豆素提取物中各成分含量的相對比值稍有差別，但相似度計(jì)算結(jié)果表明，IO批樣品相似度較高，相似度計(jì)算結(jié)果均大于0.99，說明批次之間差異不明顯，該指紋圖譜能較全面的控制川白芷有效部位的質(zhì)量。以下通過藥效學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步證明本發(fā)明的有效效果。試驗(yàn)例1川白芷總香豆素對低5-HT性偏頭痛動(dòng)物模型的影響1、材料1.1藥物川白芷購于四川遂寧白芷GAP生產(chǎn)基地，川白芷總香豆素浸膏(由西華大學(xué)中藥制劑教研室制備，總香豆素含量測定為55.8%)，實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水(含O.5%吐溫-80助溶)配成所需濃度的混懸液備用。1.2試劑麥角胺咖啡因片，上海醫(yī)藥(集團(tuán))有限公司信誼制藥總廠，生產(chǎn)批號20060401;利血平注射液，廣東邦民制藥廠有限公司，批號060308;其余藥品試劑均為國產(chǎn)分析純。1.3儀器ACS—M型電子計(jì)重秤，上海友聲衡器有限公司；FA1004N電子天平(萬分之一)，法國塞多利斯公司。1.4動(dòng)物SD大鼠，雌雄兼用，體重180200g;昆明種小鼠，全雌，體重1820g;均由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號scxk(川2004-11)。2、方法2.l川白芷總香豆素對利血平化低5-HT型偏頭痛動(dòng)物模型的影響用熱板法篩選符合實(shí)驗(yàn)的合格雌性昆明種小鼠60只(痛閾值大于10s，小于30s)，按體重分層隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為空白組、模型組、川白芷總香豆素高劑量組、中劑量組、低劑量組。除空白組外，其余各組小鼠每只均皮下注射利血平10mg/kg,每日一次，共14d后，實(shí)驗(yàn)組予川白芷總香豆素混懸液灌胃(給藥劑量見表12)，空白組和模型組給予等容積蒸餾水(含0.5%吐溫-80)，每日一次，連續(xù)3d。于第3d給藥后lh，熱板法測痛閾值。2.2統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用《中國醫(yī)學(xué)百科全書醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)》統(tǒng)計(jì)軟件包PEMS3.l進(jìn)行。兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，方差齊性用LSD或Tukey等多重比較方法，方差不齊用Tamhane'sT2多重比較方法。3、結(jié)果表12川白芷總香豆素對利血平化低5-HT型偏頭痛模型小鼠痛閾值的影響("s，n=10)組另lj動(dòng)物數(shù)(只)痛閾值(秒)空白對照組12——16.17±4.47模型對照組12—15.83±5.17白芷總香豆素組120,72QdX321.67±5.28*白芷總香豆素組120.36QdX318.83±6.63白芷總香豆素組120.18QdX317.42±7.57注與模型組比較，f〈0.05,**/><0.01表12結(jié)果顯示川白芷總香豆素高劑量組可明顯提高模型小鼠的痛閾值，與模型組比較有顯著差異(尸<0.05)。4、討論本次實(shí)驗(yàn)研究顯示在單胺類遞質(zhì)耗竭劑利血平誘導(dǎo)低5-HT性偏頭痛小鼠模型上，川白芷總香豆素在0.72g/kg劑量下可明顯提高小鼠的痛閾值14(尸<0.05)，具有明確的鎮(zhèn)痛作用。試驗(yàn)例2川白芷總香豆素對五羥色胺及單胺氧化酶的影響1、材料1.1藥物川白芷購于四川遂寧白芷GAP生產(chǎn)基地，川白芷總香豆素浸膏(由西華大學(xué)中藥制劑教研室制備，總香豆素含量測定為55.8%)，實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水(含0.5%吐溫-80助溶)配成所需濃度的混懸液備用。1.2試劑5-羥色胺硫酸肌酐，中國醫(yī)藥公司上?；瘜W(xué)試劑采購站進(jìn)口分裝；其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。單胺氧化酶，由南京建成生物工程研究所提供。1.3儀器960CRT熒光分光光度計(jì)，上海精密^f學(xué)儀器有限公司；751紫外分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；HemeusBioFugepico臺式離心機(jī)(德國)；HeraeusBioFugestratos低溫高速離心機(jī)(德國)；SANYO全自動(dòng)制冰機(jī)(日本)；SANYO超低溫冰箱(日本)；超聲波勻漿機(jī)，浙江省三門超聲波儀器廠；ACS—AA型電子計(jì)重秤,上海友聲衡器有限公司；FA1004N電子天平(萬分之一)，法國塞多利斯公司。1.4動(dòng)物昆明種小鼠，雌雄兼用，體重1820g;均由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號scxk(川2004-11)。2、方法2.1實(shí)驗(yàn)方法取昆明種小鼠60只，按體重分層隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為空白組、模型組、川白芷總香豆素高劑量組、中劑量組、低劑量組。除空白組夕卜，其余各組小鼠每只均皮下注射利血平10mg/kg，共14d。從第7d起，實(shí)驗(yàn)組予川白芷總香豆素混懸液灌胃(給藥劑量見表13)，空白組和模型組予等容積蒸餾水(含0.5%吐溫-80)，連續(xù)7d。于第14d給藥后lh，摘眼球取血，而后脫頸椎處死動(dòng)物，迅速分離腦組織。2.2血和腦中5—HT和單胺氧化酶MAO測定的檢測方法血和腦中5—HT按文獻(xiàn)方法測定，單胺氧化酶測定按試劑盒說明書進(jìn)行。腦中5-HT的測定具體方法如下置少量酸化正丁醇于勻漿器中。取組織稱重后放入勻漿器中，在冰浴中制備勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)移至刻度離心管，用酸化正丁醇補(bǔ)至4ml。振蕩5min。離心5min，取上清液2.5ml放入另一離心管。每管加入正庚垸5ml和0.1MHCL1.2ml。振蕩5min。離心5min，此時(shí)溶液分為兩相，從水相中分別取0.5ml于另一支試管中。加0.5。/。半胱氨酸0.1ml，再加0.004%OPT3ml，沸水浴10min后，冷水冷卻，在480nm/365nm處測定5-HT熒光強(qiáng)度。然后將測得的5-HT的熒光強(qiáng)度A值代入下列公式即可5-HT含量樣品管A值—空白管A值1=-^-^--xf)2x"l-(pg/g)標(biāo)準(zhǔn)管A值一空白管A值''組織重g同法檢測血中5-HT含量。z2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用《中國醫(yī)學(xué)百科全書醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)》統(tǒng)計(jì)軟件包PEMS3.1進(jìn)行。兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，方差齊性用LSD或Tukey等多重比較方法，方差不齊用Tamhane'sT2多重比較方法。3、結(jié)果表13川白芷總香豆素對偏頭痛模型小鼠腦內(nèi)5-HT的影響(；±s)組另u動(dòng)物數(shù)(只)給藥量(g/kg)5墨HT含量(ng/g)空白對照組12一0.0630±0.0171**模型對照組12—0,0374±0.0153白芷總香豆素組120.72QdX7一0.0531±0.0157*白芷總香豆素組120.36QdX70.0513±0麓0*白芷總香豆素組120.18QdX70.0419±0.0200注與模型組比較，*尸<0.05表13結(jié)果顯示川白芷總香豆素在0.72g/kg和0.36g/kg劑量下可升高模型動(dòng)物腦內(nèi)5-HT含量，與模型組比較有明顯差異(代0.05)。表14川白芷總香豆素對偏頭痛模型小鼠血中5-HT的影響(x土s)組另lj動(dòng)物數(shù)(只)給藥量(g/kg)5-HT含量(ng/g)空白對照組12一0.1358±0.0371**模型對照組12一0.0812±0.0166白芷總香豆素組120.72QdX70.1209±0.0208**白芷總香豆素組120.36QdX70.1149±0.0415*白芷總香豆素組120.18QdX70.1014±0扁0注與模型組比較，林尸<0.01，*尸<0.05表14結(jié)果顯示川白芷總香豆素在0.72g/kg和0.36g/kg劑量下可升高禾難動(dòng)物血中5-HT，，與禾難組比皿明M^(尺0.05，AO.01)。表15川白芷總香豆素對偏頭痛模型小鼠腦內(nèi)單胺氧化酶的影口向("s)注與模型組比較，P〉0.05表15結(jié)果顯示川白芷總香豆素在0.72g/kg和0.36g/kg劑量下對模型動(dòng)物腦內(nèi)MAO活性均無明顯影響(P〉0.05)。表16川白芷總香豆素對偏頭痛模型小鼠血中單胺氧化酶的影響(S土s)組另u動(dòng)物數(shù)(只)給藥量(g/kg)MAO含量(U/ml)空白對照組10—7.97±2.79模型對照組10一8.84±2.12白芷總香豆素組100.72QdX710.04±2.79白芷總香豆素組100.36QdX79.13±2.28注與模型組比較，尸〉0.05表16結(jié)果顯示川白芷總香豆素在0.72g/kg和0.36g/kg劑量下對模型動(dòng)物血中MAO活性均無明顯影響CP〉0.05)。4、討論在偏頭痛的發(fā)病理論中，生化源5-羥色胺(5-hydroxvtryptamine，5-HT)的耗竭學(xué)說占有重要的位置。首先因某些原因偏頭痛患者血液中可特異性作用于血小板的5-HT釋放因子升高，使血小板釋放5-HT。釋放的5-HT使顱內(nèi)血管收縮，引起缺血的前驅(qū)癥狀。同時(shí)顱內(nèi)血管收縮導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)，興奮交感神經(jīng)，使血中腎上腺素和游離脂肪酸增加，作用于血小板，產(chǎn)生血栓素A2(ThromboxanA2，TXA2)，TXA2主要在血小板微粒體內(nèi)合成，具有很強(qiáng)的收縮血管作用，進(jìn)一步促進(jìn)5-HT對顱內(nèi)血管收縮的作用。升高的5-HT被單胺氧化酶A(monoamineoxidasea，MAO-A)所不斷分解，其結(jié)果使5-HT耗竭，繼發(fā)性地引起血管的過度擴(kuò)張，從而產(chǎn)生搏動(dòng)性頭痛。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)偏頭痛發(fā)作期患者血漿中5-HT含量降低，而偏頭痛臨床治療中兩類5-HT受體激動(dòng)劑的肯定療效也部分證明了該學(xué)說的合理性。因此，考察了川白芷總香豆素對5-HT和單胺氧化酶的影響。采用利血平化低5-HT實(shí)驗(yàn)性偏頭痛小鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示川白芷總香豆素在0.72g/kg和0.36g/kg劑量下可明顯升高模型小鼠腦內(nèi)及血中5-HT水平(尸〈0.05，PO.01);但在單胺氧化酶的研究中，川白芷總香豆素各劑量組對模型動(dòng)物中腦和血中單胺氧化酶活性無明顯影響，說明川白芷總香豆素升高模型動(dòng)物腦和血中5-HT的作用。除了可治療偏頭痛外，還適應(yīng)癥針對性強(qiáng)，制劑使質(zhì)量穩(wěn)定，可控性強(qiáng)，為綜上所述，本發(fā)明藥物作為5-羥色胺調(diào)節(jié)劑，可治療5-羥色胺降低引起的其它疾病，藥效明確，用廣泛，除了口服制劑外，還包括經(jīng)皮給藥制劑，臨床提供了一種新的選擇。權(quán)利要求1、白芷總香素提取物在制備5-羥色胺調(diào)節(jié)劑的藥物中的用途。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的藥物是治療偏頭痛的藥物。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的白芷總香素素提取物中總香豆素的含量應(yīng)不低于44.672mg/g，歐前胡素的含量應(yīng)不低于68.623mg/g。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述的白芷總香素素提取物的HPLC色譜如圖1所示，含有14個(gè)共有指紋峰；其色譜條件為色譜柱AichromRdiasilC^色譜柱(4.6mmx250mm，5|iim)，流動(dòng)相甲醇、水和四氫呋喃梯度洗脫，柱溫40°C，流速lml/min，波長300nm，進(jìn)樣量5|Lll，甲醇、水及四氫呋喃梯度洗脫時(shí)間和比例為洗脫時(shí)間Omin，水、四氫呋喃、甲醇的重量百分比分別為水占60%，四氫呋喃8%，甲醇32%;洗脫時(shí)間10min，水、四氫呋喃、甲醇的重量百分比分別為水占60%，四氫呋喃8%，甲醇32%;洗脫時(shí)間50min，水、四氫呋喃、甲醇的重量百分比分別為水占20%，四氫呋喃16%，甲醇64%。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述的共有峰的平均相對保留時(shí)間(min)為:7.911、9.731、13.390、16.59、19.997、23.964、29.512、30.271、31.949、34.525、37.298、39.161、39.957、42.096。6、根據(jù)權(quán)利要求l-5任一一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述的白芷香豆素的制備方法包括如下步驟a、白芷55-95%乙醇提取液減壓回收乙醇，濃縮；b、將a步驟濃縮，加入石油醚萃取，棄去石油醚萃取層；萃余相加入乙酸乙酯萃取，合并萃取相，減壓回收乙酸乙酯，即得。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于a步驟所述的白芷藥材粒度為20目，乙醇提取為75%乙醇熱回流提取。8、一種調(diào)節(jié)5-羥色胺的藥物組合物，其特征在于它是由所述的白芷總香豆素提取物為活性成分，加入藥學(xué)上可接受的輔料制備而成的藥劑。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥劑是口服制劑或經(jīng)皮給藥制劑。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于所述的經(jīng)皮給藥制劑中輔料促滲劑為氮酮、油酸和冰片。全文摘要本發(fā)明提供了白芷總香素提取物的用途，具體地，是在制備5-羥色胺調(diào)節(jié)劑的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了用于5-羥色胺調(diào)節(jié)劑的藥物組合物。本發(fā)明藥物藥效明確，具體適應(yīng)癥針對性強(qiáng)。文檔編號A61K36/232GK101637487SQ20091014210公開日2010年2月3日申請日期2009年5月25日優(yōu)先權(quán)日2008年7月29日發(fā)明者玲李,李祖?zhèn)?秦旭華申請人:成都中醫(yī)藥大學(xué)