專利名稱：一種發(fā)酵液中他克莫司的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大環(huán)內(nèi)酯類強(qiáng)效免疫抑制劑他克莫
司的分離純化方法。
背景技術(shù)：
他克莫司(Tacrolimus)又名FK-506，是由日本藤澤制藥公司于1984年從土壤放 線菌中提取的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，為一種強(qiáng)力的新型免疫抑制劑，主要通過(guò)抑制白介 素-2(IL-2)的釋放，全面抑制T淋巴細(xì)胞的作用，較常用的環(huán)孢素(CsA)強(qiáng)100倍，因此大
大降低了臨床使用劑量和原治療費(fèi)用。近年來(lái)，作為肝、腎等移植的一線用藥，已在日本、美 國(guó)等14個(gè)國(guó)家上市。 此外用本品的患者，細(xì)菌和病毒感染率也較環(huán)孢菌素治療者低，尤其是該藥品有 較強(qiáng)的親肝性。FK-506和環(huán)孢菌素合用具有明顯的協(xié)同作用，效果更好。他克莫司不僅可 用于防止免疫反應(yīng)的發(fā)生，還可用于治療已發(fā)生的免疫反應(yīng)及自身免疫性疾病，對(duì)防止器 官移植的免疫反應(yīng)和自身免疫性疾病的治療具有重要意義。 目前，他克莫司的主要生產(chǎn)方法是發(fā)酵。從發(fā)酵液中分離純化他克莫司的方法，主 要是專利U. S. 6， 576， 135， U. S. 7， 220， 357，和W0/2006/031664，這些專利報(bào)道了用不同方 法分離純化他克莫司，但提取收率不是很高，導(dǎo)致工業(yè)化生產(chǎn)成本很高，產(chǎn)品的價(jià)格昂貴。
本發(fā)明的目的就是提供一種從發(fā)酵液中分離純化他克莫司的方法。主要涉及有機(jī) 溶劑浸提、大孔吸附樹(shù)脂和硅膠層析、重結(jié)晶等技術(shù)從鏈霉菌(CGMCC No. 2919)發(fā)酵液中分 離純化他克莫司的方法。 —般在他克莫司的初始分離階段并不提倡使用如硅膠、氧化鋁及C18等為填料 的柱層析。主要是因?yàn)闃悠烦煞謴?fù)雜，雜質(zhì)含量高，部分吸附性很強(qiáng)的雜質(zhì)會(huì)造成填料的不 可逆吸附，再生相當(dāng)困難，導(dǎo)致填料報(bào)廢，從成本上分析并不經(jīng)濟(jì)。C18柱價(jià)格昂貴，處理量 相對(duì)較小，若直接分離他克莫司并不實(shí)際。但大孔樹(shù)脂與硅膠、氧化鋁等填料相比，其特點(diǎn) 表現(xiàn)在處理量大、再生容易、價(jià)格便宜。他克莫司具有多環(huán)結(jié)構(gòu)，理論上易被帶苯環(huán)的吸附 劑吸附，而以苯乙烯_二乙烯苯為載體的大孔吸附樹(shù)脂可成為他克莫司的良好吸附劑。
權(quán)利要求
一種從發(fā)酵液中分離純化他克莫司的方法，其特征在于，包括如下步驟1)在發(fā)酵液中加入助濾劑進(jìn)行攪拌，過(guò)濾收集菌體；2)用有機(jī)溶劑浸提菌體，合并濾液減壓濃縮得濃縮物；3)步驟2)濃縮物進(jìn)行大孔吸附樹(shù)脂層析，梯度洗脫，收集洗脫液，濃縮；4)步驟3)濃縮物加入有機(jī)溶劑萃取，萃取液抽濾，減壓濃縮至油狀物；5)步驟4)油狀物進(jìn)行硅膠柱層析，梯度洗脫，收集洗脫液，濃縮；6)步驟5)濃縮物經(jīng)有機(jī)溶劑溶解，重結(jié)晶，即得產(chǎn)品。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟l)所述助濾劑為硅藻土、珍珠巖或其混 合物。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述攪拌時(shí)間為15-30分鐘。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述有機(jī)溶劑為甲醇、氯仿、乙酸丙 酯、二氯甲烷、乙酸丁酯、乙醇、正己烷、乙腈、丙酮或石油醚中的一種或多種的混合物溶劑。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)室溫浸提菌體3-4次，每次浸提時(shí)間 1-4小時(shí)。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)在減壓條件下，濃縮回收有機(jī)溶劑， 得到濃縮物。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的大孔吸附樹(shù)脂為非極性大孔 吸附樹(shù)脂X-5、 D4020、 HZ801、 HZ803或HZ818。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的洗脫劑為以下任一溶液 20% _80%甲醇的水溶液；含有20% _75%丙酮的水溶液；含有25% _75%乙醇的水溶液。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所述有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、乙酸丁酯 或氯仿。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)所述的硅膠為200 300目的層析 硅膠。
11. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)所述的洗脫劑為以下任一溶液含 35% _70%乙酸乙酯的正己烷混合液；含15% _50%丙酮的正己烷混合液；含15% -70%乙 醇的正己烷混合液；含35% _70%乙酸乙酯的環(huán)己烷混合液；含15% _50%丙酮的環(huán)己烷 混合液；含15% _70%乙醇的環(huán)己烷混合液。
12. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟6)所述有機(jī)溶劑為乙酸乙酯。
13. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟6)重結(jié)晶時(shí)在濃縮后的萃取液中緩慢加入正己烷或環(huán)己烷至有少量晶體析出，然后將溶液置于4t:繼續(xù)析晶。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大環(huán)內(nèi)酯類強(qiáng)效免疫抑制劑他克莫司的分離純化方法。本發(fā)明將鏈霉菌發(fā)酵液用板框壓濾得到菌體，用有機(jī)溶劑多次室溫浸提菌體，得到浸提液，將浸提液濃縮后進(jìn)行大孔樹(shù)脂和硅膠柱層析，柱層析所得他克莫司用混合溶劑進(jìn)行濃縮結(jié)晶，他克莫司的純度達(dá)96.5％。該方法通用性強(qiáng)，易推廣，可以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101712686SQ20091014638
公開(kāi)日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2009年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月22日
發(fā)明者劉忠 申請(qǐng)人:魯南制藥集團(tuán)股份有限公司