專利名稱：使用絲蛋白的人工鼓膜及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用絲蛋白的人工鼓膜和其制造方法，且更具體來(lái)說(shuō)，涉及使用絲蛋 白的呈絲素膜形式的人工鼓膜，其是使用通過去除蠶繭中的絲膠獲得的絲蛋白或其復(fù)合物 作為所述人工鼓膜的原料制成，所述人工鼓膜刺激因疾病或突發(fā)事故而穿孔的鼓膜再生， 為所述再生鼓膜提供清晰邊界并且因高生物相容性和透明性而易于使用；以及其制造方 法。
背景技術(shù)：
一般說(shuō)來(lái)，蠶絲是一種由用桑葉喂養(yǎng)的蠶吐絲形成的蠶繭制成的織物，并且數(shù)千 年來(lái)，蠶絲已因其獨(dú)特的光澤、良好的染色特性、高拉伸強(qiáng)度、光滑的紋理以及當(dāng)碰觸時(shí)發(fā) 出的優(yōu)美聲音而用作高品質(zhì)織物的原料。蠶絲是由兩股絲素和圍繞在絲素周圍的絲膠構(gòu)成，并且其一般指代在去除絲膠后 保留的絲素。由于絲素蛋白因具有高生物相容性而不會(huì)對(duì)存在于其周圍的組織產(chǎn)生不良影 響，故將其制成粉末、凝膠和水溶液形式，且因此其適用于諸如食品、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域。此外，已知絲素蛋白在使來(lái)源于人體的上皮細(xì)胞增殖和活化方面具有一定作用， 且因此有關(guān)其在化妝品材料(韓國(guó)專利公開號(hào)第2001-52075號(hào))、創(chuàng)傷敷料(韓國(guó)專利公 開號(hào)第1999-7001234號(hào)和第2000-51938號(hào))和電紡絲納米纖維無(wú)紡布(韓國(guó)專利公開號(hào) 第2004-0011786號(hào)和美國(guó)專利公開號(hào)第6，110，590號(hào))中的用途已被討論。然而，蠶絲材 料用于人工鼓膜尚未公開。與此同時(shí)，常規(guī)的鼓膜成形術(shù)和貼片刺激因外傷或發(fā)炎而穿孔的鼓膜再生。具體 說(shuō)來(lái)，鼓膜成形術(shù)能使用自體筋膜(autogenousfascia)或其它軟組織幫助鼓膜上皮在穿 孔部位生長(zhǎng)。然而，為了采集自體筋膜和軟組織，需要進(jìn)行供體采集手術(shù)(donor harvesting operation)，這可能會(huì)引起發(fā)炎和瘢痕，并且使手術(shù)時(shí)間增加。鼓膜貼片通過與鼓膜穿孔的周圍部分完全接觸來(lái)誘導(dǎo)沿貼片的平坦上皮層再生， 且由此在短時(shí)間內(nèi)增加治療成功率，而無(wú)并發(fā)癥。自1887年Blake提出這種方法以來(lái)，常 常將其用于治療外傷性鼓膜穿孔。這種方法不涉及用人工鼓膜替換穿孔的鼓膜，但容易因?qū)①N片施用于鼓膜的穿孔 部位而引起穿孔鼓膜的阻塞。再生的鼓膜沿施用貼片的部位生長(zhǎng)。然而，鼓膜貼片的常規(guī)材料通常為紙質(zhì)貼片(paper patch)，這種材料會(huì)因較長(zhǎng)的 再生時(shí)間以及再生鼓膜的厚度而具有較低效率或相容性。如果放任穿孔的鼓膜一段較長(zhǎng)的時(shí)間，則會(huì)發(fā)生慢性中耳炎。已知一般使用紙質(zhì)貼片來(lái)治療慢性鼓膜穿孔，但其會(huì)引起發(fā)炎。此外，預(yù)計(jì)隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，老年人越 來(lái)越多，這種貼片將不太易于使穿孔的鼓膜再生，且因此迫切需要研發(fā)并銷售新穎的人工 鼓膜產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)使用具絲素膜形式的絲蛋白的人工鼓膜，其是使用通過去除蠶繭中的 絲膠獲得的絲蛋白或其復(fù)合物作為所述人工鼓膜的原料而制成，所述人工鼓膜刺激因疾病 或突發(fā)事故而穿孔的鼓膜再生，為再生的鼓膜提供清晰的邊界且因具有高生物相容性和透 明性而易于使用；以及其制造方法。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)方面，提供一種使用絲蛋白的人工鼓膜，其通過將從蠶繭或絲素 去除絲膠后獲得的絲蛋白或其復(fù)合物溶液脫鹽并干燥而制成絲素膜的形式。在所述方面中，可在室溫到90°C下，使用濃度為0. 8 %到20 %的絲蛋白或絲蛋白 復(fù)合物溶液來(lái)制造絲素膜?？墒褂糜芍辽僖环N選自溴化鋰(LiBr)、氯化鋰(LiCl)、氯化鋅(ZnCl2)和氯化鈣 (CaCl2)的化合物構(gòu)成的離液鹽或包括所述化合物的乙醇水溶液來(lái)溶解絲蛋白或絲蛋白復(fù) 合物溶液。絲素膜可進(jìn)一步包括至少一種選自明膠、膠原蛋白、殼聚糖、海藻酸、透明質(zhì)酸、普 朗尼克127和聚(乙二醇)(PEG)的添加劑。絲素膜可進(jìn)一步包括至少一種選自增塑劑、柔軟劑、抗生素、抗菌劑、細(xì)胞、酶、抗 體和顏料或其組合的添加劑，以防止施用絲素膜部位的額外感染。根據(jù)本發(fā)明另一方面，制造使用絲蛋白的人工鼓膜的方法包括(a)在從蠶繭或 絲素去除絲膠后，制備絲蛋白或絲蛋白復(fù)合物溶液；和(b)將所制備的絲蛋白或絲蛋白復(fù) 合物溶液脫鹽并干燥，以將所制備的絲蛋白或絲蛋白復(fù)合物溶液制成絲素膜。在所述方面中，在步驟(a)后，可使用由至少一種選自溴化鋰(LiBr)、氯化鋰 (LiCl)、氯化鋅(ZnCl2)和氯化鈣(CaCl2)的化合物構(gòu)成的離液鹽或包括所述化合物的乙醇 水溶液來(lái)溶解絲蛋白或絲蛋白復(fù)合物溶液。在步驟(b)后，可通過熱處理或溶劑處理使絲素膜再結(jié)晶以降低水溶性。所述溶劑可為甲醇、乙醇和丙醇中的至少一種醇或其水溶液?？墒褂肞EG或通過使用干燥器或真空干燥器在減壓下干燥來(lái)控制步驟(a)中所制 備的絲蛋白或絲蛋白復(fù)合物溶液的濃度。步驟(b)中所制造的絲素膜可包括明膠、膠原蛋白、殼聚糖、海藻酸、透明質(zhì)酸、普 朗尼克127和PEG中的至少一種添加劑。


本發(fā)明的上述和/或其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將從以下實(shí)施例的描述，結(jié)合以下隨 附圖式來(lái)說(shuō)明圖1為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的使用絲蛋白的人工鼓膜的絲素膜和其斷裂面；圖2為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的用于使用絲蛋白的人工鼓膜的絲素膜的示范性拉 伸強(qiáng)度曲線；
圖3為將本發(fā)明的使用絲蛋白制造的膜貼片施用于動(dòng)物模型的穿孔鼓膜的照片；圖4為本發(fā)明的使用絲蛋白制造的膜的組織學(xué)結(jié)果，所述結(jié)果是從具有穿孔鼓膜 的動(dòng)物獲得；和圖5為本發(fā)明的使用絲蛋白制造的膜的組織學(xué)結(jié)果的曲線圖和圖表，所述結(jié)果是 從具有穿孔鼓膜的動(dòng)物獲得。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)將參照附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。然而，應(yīng)理解的是本發(fā)明并不限于所述 實(shí)施例，而是包括各種修改、等效變化和替換。提供本發(fā)明的實(shí)施例以便向所屬領(lǐng)域技術(shù)人 員更為全面地解釋本發(fā)明。首先，使用本發(fā)明的絲蛋白的人工鼓膜為一種人工生物膜，其是使用蠶絲材料制 造并且可用于急性和慢性鼓膜穿孔。所述人工鼓膜可包括用于鼓膜的使用蠶絲的人工生物 膜以及貼片。圖1為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的用于使用絲蛋白的人工鼓膜的絲素膜和其斷裂面， 且圖2為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的用于使用絲蛋白的人工鼓膜的絲素膜的拉伸強(qiáng)度曲線。參看圖1和圖2，使用從蠶繭或蠶絲纖維去除絲膠后獲得的絲蛋白(或絲素蛋白) 或絲蛋白復(fù)合物將根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的使用絲蛋白的人工鼓膜制成絲素膜形式。其中，可通過適當(dāng)控制絲蛋白濃度和膜制造溫度而將用于人工鼓膜的絲素膜制成 約30到200微米的厚度。考慮到將與穿孔鼓膜接觸、人工鼓膜的機(jī)械強(qiáng)度等，蠶絲人工鼓 膜可具有約80到120微米的厚度。具體說(shuō)來(lái)，本發(fā)明的人工鼓膜因其透明性、優(yōu)良的細(xì)胞相容性和生物相容性以及 防止外部細(xì)菌侵入而使損壞的人工鼓膜有效再生。因此，即使損傷的組織也可在鼓膜再生 過程中有作用。此外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)例，使用絲蛋白制造的人工鼓膜在術(shù)后3天即顯示明 顯的人工鼓膜復(fù)原。本發(fā)明的人工鼓膜可進(jìn)一步包括明膠、膠原蛋白、殼聚糖、海藻酸、透明質(zhì)酸、普朗 尼克127和聚(乙二醇)(PEG)中的至少一種在干燥狀態(tài)下易于處理的添加劑。本發(fā)明的人工鼓膜可進(jìn)一步包括至少一種選自由增塑劑、柔軟劑、抗生素、抗菌 劑、細(xì)胞、酶、抗體和顏料以及其組合組成的群組的添加劑。在下文中，將詳細(xì)描述一種制造根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的使用絲蛋白的人工鼓膜的 方法。首先，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的使用絲蛋白的人工鼓膜為一種絲素膜，其是在室溫 到90°C下，使用從蠶繭或蠶絲纖維去除絲膠后獲得的濃度為0. 8%到20%的絲蛋白或絲蛋 白復(fù)合物溶液制造而成。其中，可使根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例制造的絲素膜再結(jié)晶以降低水溶性。再結(jié)晶所用 方法可為熱處理或溶劑處理。所述溶劑可包括Ci到c3醇中的任一種，諸如甲醇、乙醇和丙 醇，或其水溶液。在此期間，從蠶繭或生絲去除絲膠的方法稱為脫膠。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知所述 脫膠方法。舉例來(lái)說(shuō)，脫膠方法的實(shí)例包括在堿性水溶液中煮沸馬賽皂(Marseille soap)、 碳酸鈉等的方法，使用從曲霉屬(Aspergillus sp.)等提取的蛋白酶進(jìn)行的脫膠法，和使用高溫和高壓罐進(jìn)行的高溫高壓法。如果在不去除絲膠的情況下進(jìn)行后續(xù)過程，那么可能產(chǎn) 生許多氣泡，這將在工藝中引起大量的問題。通過已知的溶解蛋白質(zhì)的離液鹽進(jìn)行溶解而制成去除絲膠的絲蛋白(或絲素蛋 白)。中性鹽制造絲蛋白溶液也為眾所周知。舉例來(lái)說(shuō)，將脫膠蠶繭或纖維或織物溶解于含 有溴化鋰(LiBr)、氯化鋰(LiCl)、氯化鋅(ZnCl2)或氯化鈣(CaCl2)的乙醇水溶液中，且隨 后使用諸如賽璐玢(cellophane)等透析膜使所得溶液透析，由此完全去除中性鹽。絲蛋白溶液可適當(dāng)控制溶解絲蛋白的條件、濃度和干燥溫度，借此將用于人工鼓 膜的絲素膜的厚度適當(dāng)?shù)乜刂圃诩s30到200微米的范圍內(nèi)。此外，為控制絲蛋白或絲蛋白復(fù)合物溶液的濃度，可使用PEG，或可使用干燥器或 真空干燥器進(jìn)行減壓干燥。此外，所制造的絲素膜可包括明膠、膠原蛋白、殼聚糖、海藻酸、透明質(zhì)酸、普朗尼 克127和PEG中的至少一種添加劑。圖3為將本發(fā)明的使用絲蛋白制造的膜貼片施用于動(dòng)物模型的穿孔鼓膜的照片； 圖4為本發(fā)明的使用絲蛋白制造的膜的組織學(xué)結(jié)果，所述結(jié)果是從具有穿孔鼓膜的動(dòng)物獲 得；且圖5為本發(fā)明的使用絲蛋白制造的膜的組織學(xué)結(jié)果的曲線圖和圖表，所述結(jié)果是從 具有穿孔鼓膜的動(dòng)物獲得。參看圖3到圖5，在去除被例如蠶糞污染的部分后，小心地選擇蠶繭，接著將其浸 入重量為蠶繭重量100倍的水中。在沸點(diǎn)下，用按材料重量計(jì)0. 2%馬賽皂和0. 2%碳酸鈉 將蠶繭處理兩次，歷時(shí)約50分鐘，接著用沸水洗滌數(shù)次，借此去除絲膠。將已去除絲膠的蠶繭放入包括摩爾比為1 8 2的氯化鈣、水和乙醇的混合溶 劑中，在沸點(diǎn)下溶解約3小時(shí)并離心，借此去除殘余雜質(zhì)。為了從溶解的蠶繭溶液中去除 鹽，使用纖維素透析膜將溶液透析約4天，借此制得純絲蛋白溶液。在約60°C的恒定溫度下干燥絲蛋白，借此制得絲素膜。當(dāng)通過掃描電子顯微鏡觀 察到如圖1所示的所制造絲素膜時(shí)，可確定制得無(wú)孔、透明且光滑的絲素膜。其中，在室溫下在約65%的相對(duì)濕度下調(diào)節(jié)約48小時(shí)(其為標(biāo)準(zhǔn)條件)后，通過 反復(fù)測(cè)量至少約10次來(lái)獲得絲素膜的機(jī)械強(qiáng)度。絲素膜的平均斷裂強(qiáng)度為約10兆帕，且 這與約12. 5兆帕的常用紙質(zhì)貼片的斷裂強(qiáng)度近似。此外，為了觀察絲素膜的表面特征，在滴加蒸餾水約5秒后，使用接觸角測(cè)量?jī)x (Kruss easydrop)來(lái)測(cè)量接觸角，且所述接觸角在約45到55°的范圍內(nèi)。因此，優(yōu)選將絲 素膜用于鼓膜再生。根據(jù)前文提及的人工鼓膜和本發(fā)明的制造所述人工鼓膜的方法，通過將從蠶繭或 蠶絲纖維去除絲膠后獲得的絲蛋白或絲蛋白復(fù)合物溶液脫鹽并干燥而將人工鼓膜制成絲 素膜形式。因此，人工鼓膜刺激因疾病或突發(fā)事故而穿孔的鼓膜再生，由此為再生的鼓膜提 供清晰邊界以及具有生物相容性和透明性的優(yōu)點(diǎn)。此外，本發(fā)明可減少可能歸因于自體移植物而執(zhí)行的供體采集手術(shù)的發(fā)生，且由 此不僅避免因供體采集手術(shù)而出現(xiàn)的并發(fā)癥，而且與常規(guī)人工材料相比，其還因高生物相 容性而減少并發(fā)癥。根據(jù)本發(fā)明，可能大量制造鼓膜并制造出各種形狀的鼓膜。此外，根據(jù)本發(fā)明，可對(duì)患者提供較短的手術(shù)時(shí)間和快速的術(shù)后復(fù)原，這對(duì)于患者
6和醫(yī)生都極為有用。 盡管已展示并描述本發(fā)明的少數(shù)實(shí)施例，但所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，可在不偏 離本發(fā)明的原則和精神的情況下對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行改變，所述改變的范圍將在權(quán)利要求和 其等效內(nèi)容中加以界定。
權(quán)利要求
一種使用絲蛋白的人工鼓膜，其是通過將從蠶繭或蠶絲纖維去除絲膠后獲得的絲蛋白或絲蛋白復(fù)合物溶液脫鹽并干燥而制成絲素膜形式。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工鼓膜，其中所述絲素膜是在室溫到90°C下使用濃度為 0. 8 %到20 %的絲蛋白或絲蛋白復(fù)合物溶液制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工鼓膜，其中所述絲蛋白或絲蛋白復(fù)合物溶液是使用由溴 化鋰(LiBr)、氯化鋰(LiCl)、氯化鋅(ZnCl2)和氯化鈣(CaCl2)中至少一種化合物構(gòu)成的離 液鹽或包括所述化合物的乙醇水溶液進(jìn)行溶解。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工鼓膜，其中所述絲素膜進(jìn)一步包括明膠、膠原蛋白、殼聚 糖、海藻酸、透明質(zhì)酸、普朗尼克127(plur0niC 127)和聚(乙二醇)(PEG)中的至少一種添 加劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工鼓膜，其中所述絲素膜進(jìn)一步包括增塑劑、柔軟劑、抗 生素、抗菌劑、細(xì)胞、酶、抗體、顏料和其組合中的至少一種添加劑以防止施用部位的額外污^fe ο
6.一種制造人工鼓膜的方法，其包含(a)在從蠶繭或蠶絲纖維去除絲膠后，制備絲蛋白或絲蛋白復(fù)合物溶液；和(b)將所制備的絲蛋白或絲蛋白復(fù)合物溶液脫鹽并干燥，以將所制備的絲蛋白或絲蛋 白復(fù)合物溶液制成絲素膜。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其進(jìn)一步包含在步驟(a)后，使用由溴化鋰(LiBr)、 氯化鋰(LiCl)、氯化鋅(ZnCl2)和氯化鈣(CaCl2)中的至少一種化合物構(gòu)成的離液鹽或包 括所述化合物的乙醇水溶液來(lái)溶解所述絲蛋白或絲蛋白復(fù)合物溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其進(jìn)一步包含在步驟(b)后，使用熱處理或溶劑處理 使所述絲素膜再結(jié)晶以降低水溶性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述溶劑為選自甲醇、乙醇和丙醇的至少一種醇 或其水溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中步驟(a)中所制備的絲蛋白或絲蛋白復(fù)合物溶液 的濃度使用聚(乙二醇)(PEG)或通過使用干燥器或真空干燥器在減壓下干燥來(lái)控制。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中步驟(b)中所制造的絲素膜包括明膠、膠原蛋白、 殼聚糖、海藻酸、透明質(zhì)酸、普朗尼克127和PEG中的至少一種添加劑。
全文摘要
本發(fā)明提供使用絲蛋白的人工鼓膜和其制造方法。所述人工鼓膜是通過將從蠶繭或蠶絲纖維去除絲膠后獲得的絲蛋白(或絲素蛋白)或絲蛋白復(fù)合物溶液脫鹽并干燥而以絲素膜的形式制成。因此，刺激因疾病或突發(fā)事故而穿孔的鼓膜再生，使所述再生鼓膜的邊界清晰并增加生物相容性和透明性。此外，所述人工鼓膜可單獨(dú)使用從蠶繭獲得的絲蛋白或絲蛋白復(fù)合物溶液，或與膠原蛋白、海藻酸、PEG或普朗尼克127(pluronic 127)混合而制成。
文檔編號(hào)A61L27/18GK101879098SQ20091015012
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2009年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月8日
發(fā)明者呂奏洪, 姜錫宇, 樸燦欽, 權(quán)海龍, 李光吉, 禹順玉, 趙柳英, 金春會(huì), 金珍, 韓相美 申請(qǐng)人:翰林大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán);大韓民國(guó)