專利名稱：眼的基因治療的制作方法
眼的基因治療 發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及利用基因療法治療視網(wǎng)膜疾病的方法。本發(fā)明還涉及 用于治療視網(wǎng)膜疾病的栽體，更特別是反轉(zhuǎn)錄病毒栽體。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供治療個(gè)體視網(wǎng)膜疾病的方法，包括，在患有視網(wǎng)膜疾
病的個(gè)體中，使該個(gè)體眼組織中的體內(nèi)內(nèi)皮抑制素(endostatin)濃 度升高至治療該視網(wǎng)膜疾病的有效量。
在一種優(yōu)選方面中，內(nèi)皮抑制素為內(nèi)皮抑制素或內(nèi)皮抑制素活性 片段。
在另一種優(yōu)選方面中，用于本發(fā)明方法中的內(nèi)皮抑制素是具有 SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽。在另一種優(yōu)選方面，該內(nèi)皮抑 制素是具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽的多肽片段、具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽的衍生物、或具有SEQ ID NO: 1所示 氨基酸序列的多肽的變體。這樣的活性片段及變體列在，例如，美國(guó) 專利6 174 861中，將該公開文本全文引入本文。
在另一種優(yōu)選方面中，本發(fā)明指向治療個(gè)體視網(wǎng)膜疾病的方法， 包括，在患有視網(wǎng)膜疾病的個(gè)體中，使該個(gè)體眼組織(尤其是視網(wǎng)膜 組織)中的體內(nèi)內(nèi)皮抑制素濃度升高至有效量，其中這種提高是通過 向個(gè)體施用外源內(nèi)皮抑制素來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
在另一種優(yōu)選方面中，本發(fā)明指向治療個(gè)體視網(wǎng)膜疾病的方法， 包括，在患有視網(wǎng)膜疾病的個(gè)體中，使該個(gè)體眼組織(尤其是視網(wǎng)膜 組織)中的體內(nèi)內(nèi)皮抑制素濃度升高至有效量，其中這種提高是通過 使個(gè)體內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)皮抑制素來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在一種更為優(yōu)選的方面中，這種 提高是通過向個(gè)體施用有效量的含內(nèi)皮抑制素編碼核酸的病毒載體來(lái) 實(shí)現(xiàn)的。在一種最為優(yōu)選的方面中，該病毒栽體選自腺病毒一一例如無(wú)病毒基因的腺病毒(gutless adenovirus)、腺伴隨病毒、反轉(zhuǎn) 錄病毒、和慢病毒，并經(jīng)眼內(nèi)或眼周給藥。
在另一種優(yōu)選方面中，本發(fā)明涉及治療個(gè)體視網(wǎng)膜疾病的方法， 包括，在患有視網(wǎng)膜疾病的個(gè)體中，使該個(gè)體眼組織(尤其是視網(wǎng)膜 組織)中的體內(nèi)內(nèi)皮抑制素濃度升高至有效量，其中這種提高是通過 向個(gè)體內(nèi)植入至少一個(gè)微嚢來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中該微嚢含有分泌內(nèi)皮抑制 素的細(xì)胞。
視網(wǎng)膜疾病包括，例如，視網(wǎng)膜脫離和視網(wǎng)膜水腫(retinal edema), 包括黃斑水肺(macular edema)。
發(fā)明詳述
內(nèi)皮抑制素是XVIII型膠原蛋白的切割產(chǎn)物，已發(fā)現(xiàn)它能抑制腫 瘤血管發(fā)生和生長(zhǎng)。干擾素a2a也阻斷腫瘤血管發(fā)生并導(dǎo)致血管瘤退 化，但是對(duì)脈絡(luò)膜新生血管形成(CNV)無(wú)效。本發(fā)明人已經(jīng)令人驚奇 且不可預(yù)料地發(fā)現(xiàn)，提高個(gè)體眼組織中的體內(nèi)內(nèi)皮抑制素濃度可以治 療象視網(wǎng)膜脫離和視網(wǎng)膜水腫，包括黃斑水胂，這樣的視網(wǎng)膜疾病。
因此，本發(fā)明提供視網(wǎng)膜疾病，例如，視網(wǎng)膜脫離和視網(wǎng)膜水腫， 包括黃斑水腫，的預(yù)防性及治療性治療方法。"治療"包括預(yù)防性和 治療性治療兩者。"預(yù)防性，，意指，針對(duì)視網(wǎng)膜疾病，例如，視網(wǎng)膜 脫離和視網(wǎng)膜水腫，包括黃斑水腫，的完全或部分防護(hù)。"治療性" 意指視網(wǎng)膜疾病自身的改善，以及，針對(duì)進(jìn)一步視網(wǎng)膜疾病或已經(jīng)存 在的疾病的惡化的完全或部分防護(hù)。本發(fā)明尤其可以用于治療視網(wǎng)膜 脫離和視網(wǎng)膜水腫，包括黃斑水腫。
如本文所使用的，內(nèi)皮抑制素的"視網(wǎng)膜疾病抑制有效量"是可 以導(dǎo)致以下任何或全部結(jié)果的內(nèi)皮抑制素量l)視網(wǎng)膜血管滲透性降 低；2)視網(wǎng)膜厚度降低；或3)對(duì)視網(wǎng)膜脫離的完全抑制或使視網(wǎng)膜 脫離程度降低。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)"編碼內(nèi)皮抑制素的DNA序列"意指編碼全長(zhǎng) 內(nèi)皮抑制素或內(nèi)皮抑制素的活性片段、衍生物、或類似物的DNA,例 如，這樣的DNA可以是編碼全長(zhǎng)內(nèi)皮抑制素的全長(zhǎng)基因、或截短基因、或編碼這樣的內(nèi)皮抑制素的具有內(nèi)皮抑制素活性的片段或衍生物或類
似物的突變基因。術(shù)語(yǔ)"DM序列"通常指多聚脫氧核糖核苷酸分子， 且更特別指通過相鄰戊糖上3'和5'碳原子間的磷酸二酯鍵一個(gè)一個(gè) 相連的脫氧核糖核苷酸線性系列。
因此，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明指向編碼內(nèi)皮抑制素或其具有 內(nèi)皮抑制素活性的片段、衍生物或類似物的DNA序列。
美國(guó)專利號(hào)5 854 205中顯示并描述了編碼內(nèi)皮抑制素的DNA序 列或其片段或衍生物，該文全文引入本文作為參考。
術(shù)語(yǔ)"內(nèi)皮抑制素"指分別根據(jù)非還原性和還原性凝膠電泳測(cè)定 其大小優(yōu)選為18 kDa至20 kDa的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)內(nèi)皮抑制素還包括該 18 kDa至20 kDa蛋白質(zhì)的活性前體形式。人內(nèi)皮抑制素的全長(zhǎng)氨基 酸序列示于SEQ ID NO: 1中。編碼人內(nèi)皮抑制素的核酸序列示于SEQ ID N0:2中。小鼠內(nèi)皮抑制素的氨基酸序列，加上小鼠IgK引導(dǎo)序列， 示于SEQ ID NO: 3中。編碼小鼠內(nèi)皮抑制素和小鼠Ig k引導(dǎo)序列的 核酸序列示于SEQ ID NO: 4中。
術(shù)語(yǔ)內(nèi)皮抑制素還包括該18 kDa至20 kDa蛋白質(zhì)的片段以及具 有基本相似氨基酸序列的經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)和肽，而且它們能夠抑制內(nèi) 皮細(xì)胞的增殖。例如，氨基酸的沉默置換(其中某氨基酸用一個(gè)結(jié)構(gòu) 上或化學(xué)上相似的氨基酸進(jìn)行替代不會(huì)顯著改變?cè)摰鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)、構(gòu) 象或活性)是本領(lǐng)域熟知的。這樣的沉默置換意將落入所附權(quán)利要求 范圍內(nèi)。
可以理解，術(shù)語(yǔ)"內(nèi)皮抑制素"包括縮短的多肽，其中從全長(zhǎng)內(nèi) 皮抑制素(也即，具有SEQ ID N0:1的多肽)的任一個(gè)或兩個(gè)末端、 或從該蛋白質(zhì)內(nèi)部除去了一或多個(gè)氨基酸，然而所產(chǎn)生的分子仍然保 持抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和/或治療視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜水腫、和/或眼新 生血管形成的效力。這種縮短的多肽在本文中稱作"片段"。術(shù)語(yǔ)"內(nèi) 皮抑制素"還包括延長(zhǎng)的蛋白質(zhì)或肽，其中在內(nèi)皮抑制素的任一個(gè)或 兩個(gè)末端、或在該蛋白質(zhì)內(nèi)部增加了一或多個(gè)氨基酸，然而所產(chǎn)生的 分子仍然保持內(nèi)皮增殖的抑制活性。這樣的分子，例如在第一位增加了酪氨酸的分子，對(duì)于利用例如"5J進(jìn)行標(biāo)記是有用的。用其它放射 性同位素進(jìn)行的標(biāo)記可用于為破壞包含內(nèi)皮抑制素受體的靶細(xì)胞提供 分子工具。用"靶向"分子例如蓖麻毒蛋白進(jìn)行標(biāo)記可以為破壞帶有
內(nèi)皮抑制素受體的細(xì)胞提供一種機(jī)制。延長(zhǎng)的內(nèi)皮抑制素多肽、或已 經(jīng)經(jīng)過共價(jià)修飾的內(nèi)皮抑制素多肽，在本文中統(tǒng)稱為內(nèi)皮抑制素"衍 生物"。
"基本序列同源性"意指內(nèi)皮抑制素類似物序列和內(nèi)皮抑制素序
列的氨基酸殘基序列間至少約70 %的同源性，優(yōu)選至少約80 %的同源 性，更優(yōu)選至少約90%的同源性。
術(shù)語(yǔ)內(nèi)皮抑制素的定義中還包括對(duì)內(nèi)皮抑制素蛋白及其肽片段的 修飾。這樣的修飾包括其它分子，包括但不限于天然或非天然存在的 氨基酸，對(duì)特定位點(diǎn)天然存在的氨基酸的取代。這樣的取代可能改變 內(nèi)皮抑制素的生物活性并產(chǎn)生生物學(xué)或藥理學(xué)激動(dòng)劑或拮抗劑。這樣 的修飾多肽在本文中稱作"變體"。已經(jīng)顯示出具有抗腫瘤效應(yīng)和/ 或抗血管形成效應(yīng)的內(nèi)皮抑制素變體、衍生物、和片段是已知的并且 已被報(bào)道，例如，在已出版的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O0067771、 W00063249、 W09931616、 W09929855、和W09948924中，將這些/>開文本全文引入 本文作為參考。這樣的內(nèi)皮抑制素變體、衍生物、和片段也可用在本 發(fā)明的方法中。
可以在本發(fā)明實(shí)踐中使用的多肽可以通過常規(guī)的藥物制劑施用給 需要治療的個(gè)體。
本發(fā)明另外一種實(shí)施方式涉及為上面所討論的任何一種治療效果 而施用藥物組合物，與藥學(xué)上可接受的載體一起。這樣的藥物組合物 可以由內(nèi)皮抑制素(例如，內(nèi)皮抑制素)、或內(nèi)皮抑制素的抗獨(dú)特型 抗體、或內(nèi)皮抑制素模擬物組成。這些組合物可以單獨(dú)或與至少一種 其它物質(zhì)，例如穩(wěn)定化化合物， 一起施用，它們可以在任何無(wú)菌的、 生物相容的藥學(xué)載體，包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、和水， 中進(jìn)行施用。這些組合物可以單獨(dú)、或與其它物質(zhì)、藥物或激素一起 施用給患者。本發(fā)明的藥物組合物可以通過任何途徑進(jìn)行給藥，包括但不限于， 經(jīng)眼內(nèi)、眼周、口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髄內(nèi)、鞘內(nèi)、 心室內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸、局部、舌下、或直腸途徑。
除活性成分外，這些組合物還可以包含適宜的藥學(xué)可接受載體一 一包括可以使活性化合物便于被加工成可以在藥學(xué)上使用的制劑的賦
形劑和助劑。在最新出版的Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co. ， Easton， Pa.)中可以找到有關(guān)制劑和給 藥的進(jìn)一步技術(shù)細(xì)節(jié)。
口服藥物制劑可以按如下得到通過將活性化合物與固體賦形劑 組合，可選地對(duì)所得混合物進(jìn)行研磨，并且在加入適宜助劑(如果需 要的話)后對(duì)顆粒混合物進(jìn)行加工得到片劑或糖衣丸核。適宜賦形劑 為碳水化合物或蛋白質(zhì)填充劑，比如糖類，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、 或山梨醇；來(lái)自玉米、小麥、稻、土豆、或其它植物的淀粉；纖維素， 比如甲基纖維素、羥基丙基曱基纖維素、或羧甲基纖維素鈉；樹膠包 括阿拉伯膠和黃萊膠，以及象明膠或膠原蛋白等這樣的蛋白質(zhì)。如果 想要的話，可以添加崩解劑或增溶劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊 脂、藻酸、或其鹽，比如藻酸鈉。
糖衣丸核可與其它適宜的包衣結(jié)合使用，比如濃縮糖溶液，它還 可包括阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol凝膠、聚乙二 醇、和/或二氧化鈥、lacquer溶液，和適宜的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。 片劑或糖片包衣中可以加入染料或色素便于產(chǎn)物鑒別或表示活性化合 物的量，即，劑量。
可以口服的藥物制劑包括用明膠制成的push-fi t膠嚢，以及由明 膠和包衣(例如甘油或山梨醇)制成的密封軟膠嚢。Push-fit膠囊可 以包含與填充劑或結(jié)合劑，比如乳糖或淀粉，潤(rùn)滑劑，比如滑石粉或 硬脂酸鎂，混合的活性成分，以及可選地包含，穩(wěn)定劑。在軟膠嚢中， 化合物可以溶解或懸浮在適宜的液體，比如油脂、液體、或含或不含 穩(wěn)定劑的液態(tài)聚乙二醇中。
適于腸胃外給藥的藥物劑型可以在水溶液中配制，優(yōu)選在生理學(xué)，溶液、Ringer，s溶液、或生理緩沖 鹽水中。水性注射懸液可以含有提高懸液粘度的物質(zhì)，例如羧曱基纖 維素鈉、山梨醇、或右旋糖酐。此外，活性化合物懸液可適當(dāng)制成油 性注射懸液。適宜的親脂性溶劑或載體包括油脂，例如芝麻油，或合 成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酸酯，或脂質(zhì)體。非脂質(zhì)聚陽(yáng)離 子氨基聚合物也可以用于運(yùn)輸?？蛇x地，該懸浮液還包含適宜的穩(wěn)定 劑或提高化合物可溶性的試劑以得以制成高濃度的溶液。
對(duì)于局部或鼻給藥，制劑中可以使用適于待滲透的特定屏障的滲 透劑。這樣的滲透劑是本領(lǐng)域公知的。
可以通過本領(lǐng)域/>知的方式，例如，通過常規(guī)的混合、溶解、顆 ?；?、制成糖丸、乳化、包嚢化、截留、或凍干過程，生產(chǎn)本發(fā)明的 藥物組合物。
該藥物組合物可以以鹽的形式提供，并可以與許多酸形成鹽，這 些酸包括但不限于，鹽酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥 珀酸，等。鹽與相應(yīng)的游離堿形式相比在水性或其它質(zhì)子溶劑中傾向 于更加可溶。在其它情況中，優(yōu)選制劑可能是包含以下任一或全部成 分的凍干粉末1-50 mM組氨酸、0.1%-2%蔗糖、和2-7%甘露醇， pH范圍4. 5至5. 5，使用前與緩沖液混合。
藥物組合物制好后可以置于適宜容器中并為指定狀況的治療作標(biāo) 記。對(duì)于內(nèi)皮抑制素的給藥，這樣的標(biāo)記應(yīng)當(dāng)包括劑量、次數(shù)、和給 藥方法。
適于在本發(fā)明中使用的藥物組合物包括其中含有實(shí)現(xiàn)預(yù)定目的的 有效量的活性成分的組合物。有效劑量的確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能 力范圍內(nèi)。
活性試劑的治療有效劑量可以在細(xì)胞，例如內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)檢測(cè) 分析中或者在動(dòng)物模型中進(jìn)行初步估計(jì)，動(dòng)物模型通常為小鼠、兔、 狗、或豬。動(dòng)物模型還可用于確定適宜的濃度范圍和給藥途徑。這樣 的信息之后可以用于確定在人類中的有效劑量和給藥途徑。
治療有效劑量指活性成分，例如內(nèi)皮抑制素或其片段，內(nèi)皮抑制
9素抗體，內(nèi)皮抑制素激動(dòng)劑、拮抗劑或抑制劑，改善癥狀或狀況的量。 可以通過標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中確定治療效力或毒
性，例如，ED50 ( 50%群體中的治療有效劑量)和LD50 (對(duì)50%群體 的致死劑量)。毒性效果和治療效果間的劑量比率為治療指數(shù)，它可 以用LD50/ED50比值表示。表現(xiàn)出高治療指數(shù)的藥物組合物是優(yōu)選的。
時(shí)的劑量范^ 。這樣的組合物中所包含的劑量?jī)?yōu)選在循環(huán)濃度范圍內(nèi)， 循環(huán)濃度包括帶極少或不帶毒性的ED50。該劑量根據(jù)所使用的劑量形 式、患者敏感程度、和給藥途徑在該范圍內(nèi)變化。
確切劑量由醫(yī)師根據(jù)與需要治療的對(duì)象相關(guān)的因素確定。對(duì)劑量 和給藥進(jìn)行調(diào)節(jié)以形成活性部分的有效水平或保持目的效果?？赡芸?慮的因素包括疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度、對(duì)象的總體健康、年齡、體重和 對(duì)象的性別、飲食、給藥時(shí)間和頻率、藥物組合、反應(yīng)敏感程度、和 對(duì)治療的耐受性/反應(yīng)。長(zhǎng)時(shí)間作用藥物組合物可以根據(jù)特定制劑的半 衰期和清除速率每3至4天、每周、或每?jī)芍芙o藥一次。
正常劑量，例如，當(dāng)施用外源制備的內(nèi)皮抑制素時(shí)，可以根據(jù)給 藥途徑和方法在自約0. 1至約20 mg/kg每天、優(yōu)選自2. 5至20 mg/kg 每天的范圍內(nèi)變化。特定劑量和運(yùn)送方法的指導(dǎo)在文獻(xiàn)中給出，并且 本領(lǐng)域醫(yī)師通?？梢缘玫?。對(duì)于核苷酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用不 同于蛋白質(zhì)或其抑制劑的制劑。類似地，多核苷酸或多肽的運(yùn)輸針對(duì) 特定細(xì)胞、狀況、位置等是特定的。不同的生物可降解或生物相容性 聚合物基質(zhì)，包括微嚢、納米球體(nanospheres )、和植入物，可用 于實(shí)施本發(fā)明。
微球體(microspheres)是含有活性藥物的精細(xì)球形顆粒。它們 與納米球體的基本不同之處在于顆粒大??；微球體的直徑小于約1000 ,，而納米球體是亞微米級(jí)的(<1 jim)。微球體系統(tǒng)或者含有均一 的整體型微球體(monolithic microspheres)或者含有ji&庫(kù)型 (reservoir-type)微球體，在前者中藥物均勻地溶解或分散在聚合 物基質(zhì)中，在后者中藥物被聚合物基質(zhì)膜殼所包圍。也可以將整體型或貯庫(kù)型系統(tǒng)相結(jié)合。例如，活性藥物可以分散 于、或被吸收到li庫(kù)型微球體的聚合物表面。
生物可降解聚合物可以包括純度不同的天然或者合成物質(zhì)。天然
聚合物包括多肽和蛋白質(zhì)(例如，白蛋白、纖維蛋白原、明膠、膠原 蛋白)、多糖(例如，透明質(zhì)酸、淀粉、殼聚糖)、和病毒包膜和活 細(xì)胞(例如，紅細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞)。天然物質(zhì)需要在微 嚢化過程中進(jìn)行交聯(lián)，從而使聚合物變性并形成被包埋的藥物。因此，
最常使用合成聚合物。經(jīng)常使用的合成聚合物包括如聚乳酸(PLA )這 樣的多(-羥基)酸、聚羥基丁酸、和乳酸/羥乙酸共聚物(PLGA)。這 些化合物是生物相容的、沒有免疫原性、并具有使其易于成型的物理 特性(控制生物降解速率)。
膠狀顆粒載體也可以在本發(fā)明的方法中用于運(yùn)送內(nèi)皮抑制素。脂 質(zhì)體是優(yōu)選的膠狀載體，它由可同時(shí)作為親水和疏水藥物載體的磷脂 雙層構(gòu)成。脂質(zhì)體由，例如，中性脂質(zhì)、帶電磷脂、和膽固醇制成。 向脂質(zhì)體表面中添加如聚乙二醇(PEG )這樣的兩親性聚合物可以減緩 脂質(zhì)體的清除。
施用經(jīng)過PEG # 飾的內(nèi)皮抑制素也在本發(fā)明范圍內(nèi)。PEG是由重 復(fù)乙撐氧亞單位和兩個(gè)可以被化學(xué)激活的末端羥基基團(tuán)構(gòu)成的聚合 物。PEG分子有大量不同的構(gòu)型。PEG鏈包括線性和支鏈結(jié)構(gòu)一一其中 一或多個(gè)PEG鏈通過如賴氨酸或三溱這樣的接頭相連。PEG可以在一 個(gè)位點(diǎn)或多個(gè)位點(diǎn)與內(nèi)皮抑制素結(jié)合，優(yōu)選共價(jià)結(jié)合。由于支鏈PEG 結(jié)合于單個(gè)位點(diǎn)或者比線性PEG結(jié)合的位點(diǎn)少，因此支鏈PEG或許比 多個(gè)小線性鏈PEG的結(jié)合不太可能干擾天然分子的生物活性，因此支 鏈PEG為優(yōu)選的。適于蛋白質(zhì)口服給藥的藥物制劑描述于，例如，美 國(guó)專利5 008 114、 5 505 962、 5 641 515、 5 681 811、 5 700 486、 5 766 633、 5 792 451、 5 853 748、 5 972 387、 5 976 569、和6 051 561,全部將其全文引入本文作為參考。
可以用基因療法將內(nèi)皮抑制素運(yùn)輸至需要治療的個(gè)體。本領(lǐng)域中 可獲得的任何基因療法都可以根據(jù)發(fā)明使用。示例性方法如下所述。在一個(gè)優(yōu)選方面，治療物包括作為表達(dá)載體一部分的內(nèi)皮抑制素 編碼核酸，所述表達(dá)栽體在適宜宿主中表達(dá)內(nèi)皮抑制素或其片段或嵌 合蛋白質(zhì)。特別地，這樣的核酸具有與多肽編碼區(qū)可操作性相連的啟 動(dòng)子，該啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的或組成型的，以及，可選地，是組織特異
性的。在另一種特定實(shí)施方式中，使用這樣一種核酸分子其中在多 肽編碼序列和任何其它目的序列兩側(cè)是促進(jìn)在基因組中目的位點(diǎn)發(fā)生 同源重組的區(qū)域，從而使目的核酸在染色體內(nèi)表達(dá)。
向患者體內(nèi)運(yùn)輸內(nèi)皮抑制素編碼核酸可以是直接的一一此時(shí)直 接將患者暴露于核酸或攜帶核酸的載體，或間接的一一此時(shí)細(xì)胞首先 在體外用核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化、之后移植到患者體內(nèi)。這兩種方法分別被稱 為體內(nèi)或體外基因療法。
在一種特定實(shí)施方式中，內(nèi)皮抑制素編碼核酸直接在體內(nèi)施用， 它在體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生編碼產(chǎn)物。這可以通過本領(lǐng)域已知的眾多方法中的 任何一種來(lái)完成，例如，通過將其構(gòu)建為適宜核酸表達(dá)載體的一部分 并用其進(jìn)行給藥以使其位于細(xì)胞內(nèi)，例如，通過用缺陷型或減毒型逆 轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒載體進(jìn)行感染(參見，例如，美國(guó)專利號(hào)4 980 286 和上面提及的其它文獻(xiàn))，或通過直接注射棵DM (參見，例如， Blezinger等人，Nature Biotechnology, 17， 343-348 ( 1999 ))或 通過使用微粒子轟擊(例如，基因槍；Biolistic， Dupont)，或用脂 質(zhì)或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)化劑進(jìn)行包被、包裝入脂質(zhì)體(參見，例如， Chen等人，Cancer Research, 59, 3308-3312 ( 1999 ))、微粒、或 微嚢中，或通過與已知進(jìn)入核內(nèi)的肽關(guān)聯(lián)給藥，或通過與接受受體介 導(dǎo)的內(nèi)吞作用的配體關(guān)聯(lián)給藥(參見，例如，美國(guó)專利5 166 320、 5 728 399、 5 874 297、和6 030 954，全部將其文引入本文作為參考)
(這可用于靶向特異表達(dá)該受體的細(xì)胞類型)，等。在另一種實(shí)施方 式中，可以形成核酸-配體復(fù)合物，其中的配體含有融合性病毒肽
(fusogenic viral peptide)以破壞內(nèi)體，以4吏該核酸免于被溶酶體 降解。在另一種實(shí)施方式中，可以通過靶向一種特異性受體，使該核 酸可以在體內(nèi)被細(xì)胞特異性攝取和表達(dá)(參見，例如，PCT乂^開W092/06180、 WO 92/22635、 W092/20316、 W093/14188、和WO 93/20221 )。
作為替代方式，可以將該核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)并通過同源重組將其整合到 宿主DNA中進(jìn)行表達(dá)(參見，例如，美國(guó)專利5 413 923、 5 416 260、 和5 574 205)。
在一種特異實(shí)施方式中，使用了含有內(nèi)皮抑制素編碼核酸的病毒 栽體。例如，可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見，例如，美國(guó)專利5 219 740、 5 604 090、和5 834 182 )。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)過修飾 從而刪除了包裝病毒基因組以及將其整合進(jìn)宿主細(xì)胞DNA非必需的逆 轉(zhuǎn)錄病毒序列。把基因療法中使用的內(nèi)皮抑制素編碼核酸克隆進(jìn)該載 體，使得該基因向患者的運(yùn)送更為便利。
腺病毒是另一種可以在基因療法中使用的病毒載體。腺病毒基因 組是線性、雙鏈DNA分子，長(zhǎng)約36千個(gè)堿基對(duì)。病毒基因組各末端都 有一個(gè)稱為反向末端重復(fù)(或ITR)的短序列，它們是病毒復(fù)制所必 須的。由于腺病毒分子遺傳學(xué)已經(jīng)被詳細(xì)描述，使腺病毒成為基因轉(zhuǎn) 移的有利載體。病毒基因組部分可以用帶有外源DNA進(jìn)行替換。此外， 重組腺病毒在結(jié)構(gòu)上是穩(wěn)定的，而且在大量擴(kuò)增后沒有發(fā)現(xiàn)重排病毒。
腺病毒對(duì)于將基因運(yùn)送至呼吸道上皮來(lái)說(shuō)是尤為吸引人的載體。 腺病毒天然感染呼吸道上皮而在其中引起輕微的疾病。以腺病毒為基 礎(chǔ)的運(yùn)輸系統(tǒng)的其它乾物是肝細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞、和肌 肉。腺病毒具有能夠感染非分裂細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)。實(shí)施以腺病毒為基礎(chǔ)的 基因療法的方法描述于，例如美國(guó)專利5 824 544、 5 868 040、 5 871 722、 5 880 102、 5 882 877、 5 885 808、 5 932 210、 5 981 225、 5 994 106、 5 994 132、 5 994 134、 6 001 557、和6 033 8843，全 部將其全文引入本文作為參考。
在一種特定實(shí)施方式中，為基因治療目的而將要利用腺病毒載體 被導(dǎo)入的核酸含有與編碼區(qū)域可操作性相連的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，這樣， 可以通過控制適當(dāng)轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物的存在與否來(lái)控制該核酸的表達(dá)。
將基因組元件整合進(jìn)腺病毒載體可以提高內(nèi)皮抑制素編碼DNA序 列的表達(dá)。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包括至少一個(gè)內(nèi)皮抑制素編碼DNA序列、和至少一個(gè)影響這樣的DNA序列表達(dá)的基因組 元件的腺病毒載體。術(shù)語(yǔ)"基因組元件，，根據(jù)先前所定義的使用。這 樣的基因組元件包括但不限于內(nèi)含子、5'非翻譯區(qū)、和3'非翻譯區(qū)、 以及內(nèi)含子和3'和5'非翻譯區(qū)之部分。該腺病毒栽體可以是上文所 描述的腺病毒載體?？刂艱NA序列的啟動(dòng)子選自本文中以及現(xiàn)有技術(shù) 中所描述的那些啟動(dòng)子。
將由具有感染性、但為復(fù)制缺陷型的病毒顆粒構(gòu)成的載體(其含 有至少一條編碼內(nèi)皮抑制素的DNA序列)以治療宿主脈絡(luò)膜新生血管 形成的有效量向宿主體內(nèi)給藥。該組主可以是哺乳動(dòng)物宿主，包括人 和非人靈長(zhǎng)類宿主。
可以向哺乳動(dòng)物宿主施用產(chǎn)生不超過l 000 000 ng/ml血液或l mg/ml血液的內(nèi)皮抑制素水平的有效量的腺病毒載體?？梢韵虿溉閯?dòng) 物宿主施用產(chǎn)生不超過l 000 000 ng/ml血液的內(nèi)皮抑制素水平的有 效量腺病毒載體，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)， 一些內(nèi)皮抑制素，比如內(nèi)皮抑制素， 當(dāng)由經(jīng)本發(fā)明腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)時(shí)，顯著地比由非 哺乳動(dòng)物細(xì)胞(比如酵母細(xì)胞或如大腸桿菌細(xì)胞這樣的細(xì)菌細(xì)胞)表 達(dá)的內(nèi)皮抑制素更有活性(活性高約IOOO倍)。因此，為了達(dá)到滿意 的抗-新生血管形成效果，人們通?？梢酝ㄟ^向哺乳動(dòng)物宿主施用腺病 毒載體來(lái)為哺乳動(dòng)物宿主提供較低水平的內(nèi)皮抑制素，這與向哺乳動(dòng) 物提供顯著更高水平的由酵母或細(xì)菌表達(dá)的內(nèi)皮抑制素相反。
在另一種實(shí)施方式中，當(dāng)向哺乳動(dòng)物宿主給藥時(shí)，施用產(chǎn)生宿主 體內(nèi)基本內(nèi)皮抑制素水平的自約2至20倍內(nèi)皮抑制素水平的有效量腺 病毒栽體。通常，在這樣的一種實(shí)施方式中，向哺乳動(dòng)物宿主施用產(chǎn) 生至少約300 ng/ml血液、優(yōu)選自約300 ng/ml至約3000 ng/ml、更 優(yōu)選自約500 ng/ml至約1500 ng/ml水平的活性多肽表達(dá)的有效量的 腺病毒栽體。
在另一種實(shí)施方式中，施用其量為自約108噬斑形成單位至約10" 噬斑形成單位，優(yōu)選自約108噬斑形成單位至約1()u噬斑形成單位，更 優(yōu)選自約10'噬斑形成單位至約1(T噬斑形成單位的病毒載體。上述所列量的腺病毒載體為優(yōu)選。
可以全身性施用感染性載體粒子，比如，例如，通過靜脈內(nèi)(比 如，例如，經(jīng)外周靜脈注射)或經(jīng)門靜脈施用，施用至膽管、肌內(nèi)、 腹膜內(nèi)、或鼻內(nèi)給藥。作為替代，可以局部施用感染性載體粒子，通 過例如眼內(nèi)或眼周注射?？梢赃@樣注射進(jìn)眼前房或后房，例如，注射 進(jìn)房水或玻璃體液。作為替代，可以在視網(wǎng)膜下注射，例如，通過在
視網(wǎng)膜后注射含載體的溶液試樣(例如，1至io微升每份試樣)，之
后，溶液被吸收，感染性栽體粒子感染眼組織的局部細(xì)胞并產(chǎn)生活性 多肽。這樣的給藥可以包括單次注射同一天內(nèi)多次注射、數(shù)周或數(shù)月 內(nèi)的單次注射、或數(shù)周或數(shù)月內(nèi)的多次注射。
這些栽體粒子可以與適于向患者施用的藥學(xué)可接受載體結(jié)合給 藥。該栽體可以是液體載體(例如，鹽水溶液)、或固體載體、比如，
例如微載體珠(mirocarrier beads)。
腺伴隨病毒(AAV)已被提議用于基因治療，包括治療腫瘤的內(nèi)皮 抑制素基因療法(參見，例如，Nguyen等人，Cancer Research, 58， 5673-5677 ( 1998 ))。產(chǎn)生并利用AAV的方法描述于，例如，美國(guó)專 利5 173 414、 5 252 479、 5 552 311、 5 658 785、 5 763 416、 5 773 289、 5 843 742、 5 869 040、 5 942 496、和5 948 675，全部將其 全文引入本文作為參考。
基因療法的另一種途徑涉及通過如電擊法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、或病毒感染這樣的方法將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)組織培養(yǎng)細(xì)胞。通 常，轉(zhuǎn)移方法包括將選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞。之后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行選擇以分 離已經(jīng)攝入并表達(dá)了該轉(zhuǎn)移基因的那些細(xì)胞。之后將那些細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn) 患者。
在這種實(shí)施方式中，在將最后的重組細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)給藥之前，將 核酸導(dǎo)入細(xì)胞?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法來(lái)完成這種導(dǎo)入，包括 但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔法、微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌體 栽體感染，細(xì)胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細(xì)胞(microcell) 介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)體融合，等。本領(lǐng)域中已知了大量用于將外源基因?qū)爰?xì)胞的方法而且它們可以用于本發(fā)明，只要受體細(xì)胞的必 須的發(fā)育和生理功能未被破壞。這一技術(shù)應(yīng)當(dāng)使核酸向細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)移， 由此該核酸可以被細(xì)胞表達(dá)且優(yōu)選地可被其細(xì)胞后代遺傳并表達(dá)。在 另一種實(shí)施方式中，在細(xì)胞中通常不表達(dá)、或由細(xì)胞低水平表達(dá)的內(nèi) 源基因，可以被與該內(nèi)源基因可操作性相連的啟動(dòng)子激活，由此提供 高水平表達(dá)內(nèi)源基因的細(xì)胞，使該細(xì)胞合成并分泌內(nèi)皮抑制素。
產(chǎn)生和注射這樣的細(xì)胞的方法(也即，從或內(nèi)源或外源基因或核
酸產(chǎn)生高水平蛋白質(zhì)的那些方法)描述于特別是美國(guó)專利號(hào)5 641 670、 5 733 761、 5 968 502、 6 048 729、 6 054 288、 6 063 630、 和6 187 305。在優(yōu)選實(shí)施方式中，以裝入微嚢的形式來(lái)運(yùn)送產(chǎn)生內(nèi) 皮抑制素的細(xì)胞，例如，裝入藻酸鈉或藻酸鈣聚L-賴氨酸藻酸鹽微膠 嚢中的細(xì)胞形式(參見，例如，Read等人，Nature Biotechnology 19， 29-34 ( 2001年1月)和Joki等人，Nature Biotechnology 19, 35-39 (2001年1月))?？梢詫⒃撐⒛一募?xì)胞移植在眼附近或由細(xì)胞產(chǎn) 生的內(nèi)皮抑制素最迅速進(jìn)入對(duì)象血流的位置，例如，在肝臟。預(yù)計(jì)的 細(xì)胞使用量依賴于期望的效應(yīng)、患者狀態(tài)等，而且可由本領(lǐng)域技術(shù)人 員測(cè)定。
可以為基因治療目的而向其中導(dǎo)入核酸的細(xì)胞包括任何想得到 的、可以得到的細(xì)胞類型，而且包括但不限于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、 角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞；血細(xì)胞，比如T'淋巴 細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒 細(xì)胞、巨核細(xì)胞、粒細(xì)胞；各種干細(xì)胞或始祖細(xì)胞，尤其是造血干細(xì) 胞或祖先細(xì)胞，例如，獲自骨髓、臍帶血、外周血、胎兒肝臟等的那 些。
在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，用于基因療法的細(xì)胞是患者自體的。 在一種將重組細(xì)胞用于基因治療的實(shí)施方式中，將內(nèi)皮抑制素編 碼核酸導(dǎo)入細(xì)胞，這樣該細(xì)胞或其后代可以表達(dá)該核酸，而且之后為 治療目的體內(nèi)施用該重組細(xì)胞。在一種特定實(shí)施方式中，使用干細(xì)胞 或始祖細(xì)胞。才艮據(jù)本發(fā)明的這一實(shí)施方式，可以使用任何可以體外分離并保持的干和/或始祖細(xì)胞。這樣的干細(xì)胞包括但不陷于造血干細(xì)胞
(HSC)，比如皮膚和內(nèi)臟襯里這樣的上皮組織的千細(xì)胞、胚胎心肌細(xì) 胞、肝臟千細(xì)胞(參見，例如，W0 94/08598 )、和神經(jīng)千細(xì)胞。
上皮干細(xì)胞(ESCs)或角質(zhì)形成細(xì)胞可通過已知方法獲自比如皮 膚或內(nèi)臟襯里這樣的組織。在分層上皮組織例如皮膚中，通過生發(fā)層 (與基底層最接近的一層)內(nèi)干細(xì)胞的有絲分裂進(jìn)行更新。內(nèi)臟襯里 中的干細(xì)胞使這一組織快速更新。獲自患者或供體皮膚或內(nèi)臟襯里的 ESC或角質(zhì)形成細(xì)胞可以在組織培養(yǎng)中培養(yǎng)。如果ESC由供體提供， 還可以使用抑制宿主對(duì)移植物反應(yīng)性的方法(例如，施用放射、藥物 或抗體來(lái)促進(jìn)適當(dāng)?shù)拿庖咭种?。
至于造血干細(xì)胞(HSC)，在本發(fā)明這一實(shí)施方式中可以使用任何 分離、增殖、體外保持HSC的技術(shù)。可以完成這些的技術(shù)包括(a)從 分離自未來(lái)宿主、或供體的骨髄細(xì)胞分離和建立HSC培養(yǎng)物，或(b) 利用先前建立的長(zhǎng)期HSC培養(yǎng)物，其可能是同種異體或異種的。非自 體HSC優(yōu)選與抑制未來(lái)宿主/患者的移植免疫反應(yīng)的方法相結(jié)合。在本 發(fā)明的一種特殊實(shí)施方式中，人骨髓細(xì)胞可通過針吸從后髂嵴獲得(參 見，例如，Kodo等人，1984， J. Clin. Invest. 73: 1377-1384 )。 可以以高度富集或基本純的形式制備HSC。這種富集可以在長(zhǎng)期培養(yǎng) 之前、期間、或之后進(jìn)行，并且可以用本領(lǐng)域中的任何技術(shù)完成?？?以用，例如，改良Dexter細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(Dexter等人，1977, J. Cell Physiol. 91: 335 )或Witlock-Witte培養(yǎng)技術(shù)(Witlock和Witte， 1982， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3608-3612 )建立并保持骨 髓細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)物。
特別將本說(shuō)明書中所參考的所有專利、公開出版物、(包括已出 版的專利申請(qǐng))、和數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)和保藏登記號(hào)完整地引入本文作為 參考，仿佛這樣的每個(gè)專利、公開出版物、(包括已出版的專利申請(qǐng))、 和數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)和保藏登記號(hào)都特別地且單獨(dú)地被指定引入本文作為 參考。
然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的范圍不限于上述特定實(shí)施方式?？梢杂贸唧w描述的之外的其它方式來(lái)實(shí)施本發(fā)明，它們?nèi)栽诒景l(fā)明所附 權(quán)利要求書范圍內(nèi)。
進(jìn)一步的方面涉及內(nèi)皮抑制素在制備用于治療患有視網(wǎng)膜脫離或 視網(wǎng)膜水腫的患者的藥物中的用途，其中所述內(nèi)皮抑制素特別地是具
有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽，或其中所述內(nèi)皮抑制素如整 個(gè)本公開文本中所定義或描述的。
實(shí)施例1
腺病毒載體的產(chǎn)生方法l
用引物-ACT GGT GAC GCG GCC CAT ACT CAT CAG GAC TTT CAG CC-3' ( SEQ ID NO: 6 )和5' -AAG GGC TAT CGA TCT AGC TGG CAG AGG CCT AT-3' ( SEQ ID NO: 7 )從獲自Genome Systems ( St. Louis， MO) 的小鼠膠原蛋白XVIII克隆ID 748987中經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR )擴(kuò) 增出小鼠內(nèi)皮抑制素(mEndo) cDNA ( 598-bp Fl片段)。用引物5' -CAC TGC TTA CTG GCT TAT CG-3' ( SEQ ID NO: 8 )和5' -CTG ATG AGT ATG GGC CGC GTC ACC AGT GG-3' ( SEQ ID NO: 9 )從pSecTag2
(InVitrogen, Carlsbad, CA) PCR擴(kuò)增出小鼠免疫球蛋白k鏈引導(dǎo) 序列(Ig-k leader) ( 147-bp F2片段)。PCR用Pfu DNA聚合酶
(Stratagene， LaJolla， CA )在下列條件下完成35個(gè)循環(huán)95C熱 起始3分鐘，95X:變性1分鐘，55C退火1分鐘，和72X:延伸2分鐘。 DNA片段經(jīng)凝膠純化。以上述產(chǎn)生的Fl和F2 DM片段為模板利用PCR 拼接重疊延伸(splice overlap extension)裝配小鼠Ig-k引導(dǎo)序 列和鼠內(nèi)皮抑制素cDNA從而產(chǎn)生sig-mEndo嵌合DNA( 718 bp) 。 PCR 用引物5' -CAC TGC TTA CTG GCT TAT CG-3' (SEQ ID NO: 8 )和5' -AAG GGC TAT CGA TCT AGC TGG CAG AGG CCT AT-S' ( SEQ ID NO: 10 ) 以及Pfu DNA聚合酶(Stratagene)來(lái)完成。PCR在下列條件下運(yùn)行 35個(gè)循環(huán)95"熱起始3分鐘，95C變性1分鐘，601C退火l分鐘， 和721C延伸2分鐘。將718-bp sig-mEndo嵌合DM插入到腺病毒穿梭質(zhì)粒pAvF91xr 的Nhel和Clal位點(diǎn)間，處于Rous肉瘤病毒(RSV )啟動(dòng)子下游和猿 病毒40 ( SV40 )多聚腺苷酸信號(hào)上游，構(gòu)建得到pAvmEndoLxr腺病毒 穿梭質(zhì)粒。pAvmEndoLxc中除用經(jīng)Ascl和Nhel消化的猿巨細(xì)胞病毒 (sCMV)啟動(dòng)子片段替換RSV啟動(dòng)子之外，其它與pAvmEndoLxr相同。 這兩個(gè)穿梭質(zhì)粒都含有用于Cre/lox-介導(dǎo)重組的LoxP位點(diǎn)。 pAvmEndoLxr和pAvmEndoLxc腺病毒質(zhì)粒中的轉(zhuǎn)基因序列都經(jīng)直接序 列分析驗(yàn)證。
通過由Cre/lox-介導(dǎo)的兩個(gè)質(zhì)粒，pSQ3和pAvmEndoLxr,之間的 重組來(lái)產(chǎn)生編碼sig-mEndo嵌合體的重組Av3mEndo(缺失了 El、 E2a、 和E3)。該pSQ3質(zhì)粒包含loxP位點(diǎn)、以及在該位點(diǎn)之后含有缺失了
自左側(cè)末端反向末端重復(fù)(ITR)至Ela末端這一區(qū)域的Av3基因組。 pAvmEndoLxr和pSQ3各自首先用Notl和Clal限制性酶線性化。用磷 酸鈣哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(Promega， Madison, WI)完成對(duì)293細(xì)胞的 瞬間轉(zhuǎn)染(六孔板各孔4 x io5個(gè)細(xì)胞)。用總體積為1. 8ml的4. 8mg 線性化的pAvmEndoLxr、 12 mg線性化的pSQ3、 6 mg pcmvCre、和6 mg pcmvE2a制備磷酸鉀-DNA沉淀。向各孔中加入0. 6-ml磷酸鉤-DNA沉 淀。將293細(xì)胞與磷酸鉤-DNA沉淀于371C下溫育16小時(shí)。除去沉淀， 細(xì)胞用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌。轉(zhuǎn)染后十五天，觀察細(xì)胞病變效果
(CPE)。之后刮取收集細(xì)胞和培養(yǎng)基。經(jīng)五個(gè)凍融循環(huán)制備粗病毒裂 解物。
用0. 3 mM地塞米松在含有5 % FBS的Richter，s CM上在S8細(xì)胞 中再擴(kuò)增Av3mEndo載體直到觀察到CPE。如(Mittereder等人，1996 ) 所述測(cè)定腺病毒載體滴度(粒子每毫升)和生物學(xué)滴度(噬斑形成單 位[PFU]每毫升)。以同樣的方式利用Cre/Zor"介導(dǎo)的pSQ3和 pAvmEndoLxc的重組產(chǎn)生由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的、包含sig-mEndo的重 組Av3CsmEndo。通過限制性消化和DNA印跡分析來(lái)驗(yàn)證純化的 Av3mEndo、 Av3CsmEndo、和對(duì)照Av3Nul1的正確基因組結(jié)構(gòu)。已證實(shí) Av3mEndo和Av3CsmEndo種子批對(duì)于復(fù)制型腺病毒(RCA )為陰性。經(jīng)Av3mEndo轉(zhuǎn)化的S8細(xì)胞上清液中含有可以有效抑制由 VEGF165誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞遷移的20-kDa蛋白質(zhì)，這一大小為預(yù)計(jì)的 內(nèi)皮抑制素大小，而且經(jīng)ELISA證實(shí)106經(jīng)Av3mEndo轉(zhuǎn)導(dǎo)的Hep3B 細(xì)胞每24小時(shí)分泌1-2 jig鼠內(nèi)皮抑制素。 腺病毒載體的產(chǎn)生方法2
從驟凍的2周齡C57BIV6小鼠(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)肝臟分離■ ( RNeasy Mini試劑盒；Qiagen， Valencia, CA)并經(jīng)Moloney鼠白血病(Moloney murine leukemia) 病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)處 理得到鼠cDM。用正義引物5' -GATCTCTAGACCACCATGCATACTCAT CAGGACTT-3' ( SEQ ID NO: 11 )和反義引物5' -ACTGGAGAAAGAGGTTT ATCTAGCTACTAG-3' (SEQ ID NO: 12 )經(jīng)PCR將鼠內(nèi)皮抑制素基因克 隆進(jìn)TA克隆載體(Invitrogen， Carlsbad, CA)。用正義引物 5' -GATCTCTAGACCACCATG AGGTACATGATTTTAGGCTTGCTCGCCCTTGCGG CAGTCTGCAGCGCGGCCCATACTCATACTCATCAGGACTTTCAG-3, ( SEQ ID NO: 14)和反義引物(同上)經(jīng)PCR將18氨基酸E3/19K信號(hào)序列 MRYMILGLLALAAVCSAA (SEQ ID NO: 13)插入到內(nèi)皮抑制素序列上游。 質(zhì)粒DNA在DH5細(xì)胞(Life Technologies)中擴(kuò)增，并驗(yàn)證信號(hào)序列 —鼠內(nèi)皮抑制素(ss-mEndo)序列(ABI Prism 310自動(dòng)測(cè)序儀；PE Applied Biosystems, Foster City, CA)。
ss-mEndo構(gòu)建體經(jīng)EcoRl消化并通過鈍端連接克隆進(jìn)腺病毒穿梭 質(zhì)粒pAd/CMV. 1的多克隆位點(diǎn)。所得質(zhì)粒與5型El A/B-缺失Ad2重 組，并用于感染293細(xì)胞(American Type Culture Collection, Manassas, VA)。通過蛋白酶K消化、苯酚抽提、和乙醇沉淀提取逸 斑DNA,并經(jīng)PCR篩選ss-mEndo。在293細(xì)胞中擴(kuò)增所得病毒， Ad-ss-mEndo。用相似的策略產(chǎn)生包含p-gal ( Ad-p-gal)基因和螢火 蟲熒光素酶(Ad-luc)基因的對(duì)照重組病毒。用標(biāo)準(zhǔn)噬斑形成檢測(cè)測(cè) 定293細(xì)胞中的病毒滴度。細(xì)胞在由含有10% FCS、 100單位/ml青 霉素、100 jig/ml鏈霉素、50 fig/ml慶大霉素、0.5 ng/ml兩性霉素B、和4 mM谷氨酸的DMEM (Biofluids, Rockville, MD)組成的完全 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。用Ad-ss-mEndo、 Ad-luc、或無(wú)病毒以MOI介于0.1 至100 ( 1. Oml完全培養(yǎng)基中每106個(gè)細(xì)胞，105至108個(gè)pfu )間感 染細(xì)胞，并于37匸溫育24小時(shí)。上清液2xg離心5分鐘，并根據(jù)制 造商說(shuō)明用竟?fàn)幮訣IA ( Cytimmune Sciences, College Park, MD) 檢測(cè)內(nèi)皮抑制素。在纖維素柱(Centricon YM-10; Millipore， Bedford, MA)中將293細(xì)胞上清液濃縮10倍，并用570 ng/ml兔抗鼠內(nèi)皮抑制 素多克隆IgG抗體(Cytimmune Sciences贈(zèng)品)做蛋白質(zhì)印跡分析
(NuPAGE; Novex， San Diego, CA)。用EIA鼠內(nèi)皮抑制素標(biāo)準(zhǔn)作為 陽(yáng)性對(duì)照。用上述Ad-p-gal感染細(xì)胞并在24小時(shí)后用染色試劑盒
(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN )檢領(lǐng)ij p-gal， 由此測(cè)試 鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞系MC38 (由Surgery Branch, National Cancer Institute開發(fā))對(duì)腺病毒感染的易感性。用鼠肝細(xì)胞系歷uLi (美國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心)對(duì)Ad-p-gal感染的易感性作為陽(yáng)性對(duì)照。 腺病毒載體的產(chǎn)生方法3
將來(lái)自BALB/c小鼠的肝臟組織勻漿，并抽提總RNA( Rneasy試劑 盒；Qiagen， Chatsworth， CA)。用寡聚(dT)引物(Superscript II; Life Technologies, Grand Island, NY)經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增出笫一 鏈cDM。經(jīng)PCR (帶有Clal接頭的正義引物，5' -ATCGATCATACTCATCAGGACTTTCAGCC-3' ( SEQ ID NO: 15 );帶有Notl 接頭的反義引物，5' -GCGGCCGCCTATTTGGAGAAAGAGGTCAT-3' ( SEQ ID NO: 16))擴(kuò)增出全長(zhǎng)小鼠內(nèi)皮抑制素cDNA用于亞克隆進(jìn)pBluescript
(Stratagene)。將編碼大鼠胰島素引導(dǎo)序列的合成寡核苷酸克隆在 內(nèi)皮抑制素基因前面。驗(yàn)證序列之后，將大鼠胰島素引導(dǎo)序列-內(nèi)皮抑 制素cDNA克隆進(jìn)如Bautista， D. S.等人，(1991) Virology 182, 578-596所述用于拯救重組腺病毒的重組腺病毒(ADV)穿梭載體 pADV.hEFl-a (人延長(zhǎng)因子1- a)。通過吸光度(A260 )測(cè)定病毒粒 子，用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖覆層噬斑檢測(cè)法測(cè)定293細(xì)胞的噬斑形成單位。對(duì) 分離自人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC )的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-PCR獲得用于構(gòu)建ADV. hVEGF165的cDNA。 JC和LLC細(xì)胞系獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保 藏中心。細(xì)胞在RPMI培養(yǎng)基1640 (JC)和DMEM( LLC)中培養(yǎng)。所有 培養(yǎng)基都補(bǔ)加了 10% FBS、 0. 2mM谷氨酸鹽、和1%青霉素/鏈霉素。 室溫下用IV型膠原蛋白酶(Sigma)灌注(0. 2 % ,溶于Hanks平衡鹽 溶液中)20分鐘從臍帶分離得到HUVEC。之后在補(bǔ)加了 20% FBS、 0. 2 mM谷氨酸鹽、1%青霉素/鏈霉素、和l ng/ml bFGF的M199培養(yǎng)基 中在用膠原蛋白(1%,溶于PBS)包被的平板上培養(yǎng)細(xì)胞。
實(shí)施例2:向小鼠的基因轉(zhuǎn)移和CNV的誘導(dǎo)
將病毒載體注射進(jìn)成年C57BL/6小鼠的尾靜脈。用2 x 1011粒子
(particles )的Av3mEndo (n=18 )或Av3mNul1 (n-17)或用6 x 101。 粒子的Av3CsmEndo或Av3CsNu11注射小鼠。注射病毒栽體四天后，用 鹽酸氯胺酮(100 mg/kg體重)麻痹小鼠，用1 %托吡卡胺(tropicamide ) 使瞳孔放大，如Tobe爭(zhēng)乂， J瓜/. AMo/. 153， 1641-1646 ( 1998 ) 先前所描述的用氪激光光凝固法使各小鼠每只眼睛的玻璃膜在三個(gè)位 置破裂。簡(jiǎn)言之，用Coherent Model 920光凝固器的狹縫燈傳遞系統(tǒng)
(slit lamp delivery system)和一塊用作接觸鏡的手持蓋玻片來(lái)進(jìn) 行氪激光凝固法(100 nm點(diǎn)大小，0. l秒持續(xù)時(shí)間，120 mW)。在離 視覺神經(jīng)2 ~ 3個(gè)視神經(jīng)盤直徑(disc diameter )的9、 12、和3點(diǎn) 鐘的位置進(jìn)行灼燒。激光照射時(shí)蒸發(fā)泡的產(chǎn)生，它表示玻璃膜的破裂， 是獲得CNV的重要因素，因此只有起泡的灼燒才包括在該項(xiàng)研究中。 經(jīng)Av3mEndo注射的小鼠有一次灼燒沒有起泡，經(jīng)Av3mNul1注射的小 鼠有三次灼燒沒有起泡。有一只經(jīng)Av3mEndo注射的小鼠有一只眼睛的 角膜有一個(gè)妨礙激光使用的角膜疤，因此未曾使用該眼。
實(shí)施例3:由激光誘導(dǎo)的CNV損傷大小的測(cè)定
激光處理之后兩周，利用兩種不同的技術(shù)之一評(píng)估CNV損傷的大 小，由Seo等人，j/ffer. / ,"/ o厶154， 1743-1753 ( 1999 )先前 報(bào)導(dǎo)的對(duì)連續(xù)切片上的CNV總和面積(integrated area)的測(cè)定或由Edelman等人，//^e", ^/ Ma/邊o/. 「h. 41， S834 ( 2000 )
描述的對(duì)脈絡(luò)膜flat mounts中CNV面積的測(cè)定。對(duì)于用Av3mEndo 注射的小鼠，10只小鼠用flat mount技術(shù)評(píng)估以及8只用連續(xù)切片 評(píng)估，對(duì)于用Av3mNul1注射的小鼠，10只小鼠用flat mount技術(shù)評(píng) 估以及7只用連續(xù)切片評(píng)估。
如Tobe等人，/力re". ^7力^w/邊o厶P7s. 39， 180-8( 1998 ) 先前所述，麻痹用于flat mount技術(shù)的小鼠并用含有50 mg/ml經(jīng)熒 光素標(biāo)記的右旋糖酐(2xl06平均mw， Sigma, St. Louis, MO )的1 ml礴酸緩沖鹽水灌注。取出眼睛并在10%磷酸鹽緩沖福爾馬林中固 定1小時(shí)。取出角膜和晶狀體，從視杯中小心分離出完整視網(wǎng)膜。在 視杯的邊緣到中綷線做徑向切割(4-7，平均為5個(gè))，并在Aquamount 中使鞏膜向上、脈絡(luò)膜向下將視杯水平安放(flat mounted)。用熒 光顯微鏡檢測(cè)Flat mounts,用3 CCD彩色攝^f象儀和幀接收器(frame grabber)將圖〗象數(shù)字化。用Image-Pro Plus測(cè)量與各次灼燒有關(guān)的 超熒光總面積，其對(duì)應(yīng)于總維管疤。
對(duì)于用Av3mEndo注射的小鼠，總計(jì)評(píng)估了 19只眼(有一只眼睛 沒有進(jìn)行激光處理就已經(jīng)存在了角膜疤)而且由于有一次灼燒沒有起 泡，因此測(cè)定了56個(gè)損傷。對(duì)于用Av3mNul1注射的小鼠，總計(jì)評(píng)估 了20只眼，而且由于有3次灼燒沒有起泡，因此測(cè)定了57個(gè)損傷。 對(duì)每只眼睛內(nèi)的面積取平均值，做log轉(zhuǎn)換后，用廣義估計(jì)方程 (generalized estimating equations, GEE)完成回歸分析。該分 析調(diào)節(jié)每只小鼠右眼和左眼間的相關(guān)性。
用激光處理了兩周后，將用于測(cè)定連續(xù)切片上的CNV總和面積的 小鼠處死，將眼睛迅速取出并冷凍在適宜切割溫度包埋化合物(OCT; Miles Diagnostics, Elkhart, IN)中。沿每個(gè)灼燒整個(gè)區(qū)域切割冷凍 連續(xù)切片(10 nm),并用選擇性地與血管細(xì)胞結(jié)合的生物素化 griffonia simplicifolia lectin B4 ( GSA， Vector Laboratories, Burlingame， CA)進(jìn)行組織化學(xué)染色。4"€下將栽玻片放在曱醇/11202中 孵育10分鐘，用0.05 M Tris緩沖鹽水洗滌，pH 7. 6 ( TBS )，并在10%正常豬血清中孵育30分鐘。室溫下用生物素化的GSA孵育載玻片 2小時(shí)，用O. 05M TBS漂洗后，用與過氧化物酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白
(Vector Laboratories)于室溫孵育45分鐘。用0. 05 M TBS洗滌 IO分鐘后，用Histomark Red ( Kirkegaard和Perry )孵育栽玻片以 產(chǎn)生能夠與黑色素區(qū)分開的紅色反應(yīng)產(chǎn)物。用Contrast Blue
(Kirkegaard和Perry)對(duì)一些載玻片進(jìn)行復(fù)染色。
為了進(jìn)行定量評(píng)估，用Axioskop顯微鏡檢查經(jīng)GSA染色的切片， 并用3 CCD彩色攝像機(jī)和幀接收器(frame grabber)使圖像數(shù)字化。 用Image-Pro Plus軟件描繪并測(cè)定視網(wǎng)膜下空間中經(jīng)GSA染色血管的 面積。對(duì)于各損傷，對(duì)所有出現(xiàn)了損傷的切片做面積測(cè)量，并把它們 加在 一起以得出總和面積測(cè)量值。對(duì)每只眼睛中的測(cè)量值取平均值， 并用GEE做回歸分析。
在最初的實(shí)驗(yàn)中，將位于由激光誘導(dǎo)的玻璃膜破裂位點(diǎn)的CNV量 與用Av3mEndo注射的小鼠和用Av3mNul1注射的小鼠相比。用兩種不 同的技術(shù)估測(cè)CNV的量；對(duì)脈絡(luò)膜flat mounts上用熒光標(biāo)記的右旋 糖酐灌注的CNV面積的測(cè)定，和對(duì)貫穿整個(gè)損傷的連續(xù)切片上CNV面 積的測(cè)定。與未注射小鼠和用Av3Nul1注射的小鼠相比，用Av3mEndo 注射的小鼠中，脈絡(luò)膜flat mounts中的由激光誘導(dǎo)的CNV面積更少。 由不知曉處理組的調(diào)查者完成的圖像分析證實(shí)了由視覺比較所見的區(qū) 別，這表明用Av3mEndo注射的小鼠中的灌注CNV損傷平均面積顯著小 于用Av3Nul1注射對(duì)照的(表l)。
表l
脈絡(luò)膜Flat Mounts上的灌注CNV面積
載體 小鼠眼損傷 面積(l(Tmm2)_P
Av3mEndo 10 19 56 13. 73 ± 1. 36 <0.0001
Av3Nul1 10 20 57 29.41 ± 2. 19
貫穿整個(gè)損傷的連續(xù)切片上的CNV總和面積栽體 小鼠 目艮 損傷 總和面積(l(T2mm2) P Av3mEndo 815 44 5. 88 ± 0.91 <0. 0001
Av3Nul1 713 37 12. 58 ± 2. 21
經(jīng)CNV損傷的連續(xù)切片還顯示，與用Av3Nul1注射的小鼠相比，在用 Av3mEndo注射的小鼠中有較小的損傷。將各系列切片上的CNV面積相 加得到的CNV總和面積一一其估測(cè)了三維的大小，證實(shí)了與Av3Nul1 注射小鼠相比用Av3mEndo注射的小鼠中在玻璃膜破裂位置處的CNV 顯著更小(表l)。由于兩種測(cè)量技術(shù)給出了非常相似的信息，在后 面的實(shí)驗(yàn)中只施用了脈絡(luò)膜f lat mounts。
內(nèi)皮抑制素血清水平與CNV面積之間存在反相關(guān)性。用載體進(jìn)行 靜脈內(nèi)注射4~7天后內(nèi)皮抑制素血清水平是最適宜的。用Av3mEndo、 Av3CsmEndo、 Av3Nul1、或Av3CsNul 1注射了 一組小鼠。第四天進(jìn)行激 光處理，注射后七天獲得血清。在調(diào)查者不知道栽體組和內(nèi)皮抑制素 血清水平的情況下，激光光凝固法后14天測(cè)定了脈絡(luò)膜flat mounts 上的CNV面積。用Av3CsmEndo注射的小鼠看來(lái)比未注射小鼠或用 Av3CsNu11注射的小鼠的CNV更少。圖l象分析證實(shí)，與對(duì)照相比，用 Av3CsmEndo或Av3mEndo注射的小鼠中的CNV損傷面積顯著更少(表 2)。
表2:脈絡(luò)膜Flat Mounts上的灌注CNV面積
載體小鼠眼損傷面積(10—3 mm2)P
Av3CsmEndo1122668. 87 ± 0. 85*<0. 0001，'"<0. 0001
Av3mEndo10195518. 36 ± 2. 24*0. 0013,'"0. 0004
Av3CsNu1111216224. 41 ± 2. 92*0. 22
Av3Nul19174832. 91 ± 4. 87*0. 89
無(wú)栽體11215931. 71 ± 3. 98
*相對(duì)于無(wú)載體對(duì)照的差異；"相對(duì)于相應(yīng)空栽體對(duì)照的差異
對(duì)每只小鼠中的CNV損傷平均面積vs內(nèi)皮抑制素血清水平作圖顯示出強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，r = -0.66。
實(shí)施例4:眼和肝臟中的內(nèi)皮抑制素表達(dá)分析
為確定全身性施用腺病毒載體是否會(huì)對(duì)眼睛產(chǎn)生顯著的轉(zhuǎn)導(dǎo)，用 Av3nBg對(duì)一組小鼠進(jìn)行了注射。該載體由RSV啟動(dòng)子表達(dá)p-半乳糖苷 酶。五天后，處死這些小鼠，并用化學(xué)發(fā)光分析測(cè)定眼和肝臟勻漿中 的p-半乳糖苷酶活性。將肝臟和眼從小鼠中取出后迅速冷凍。檢測(cè)當(dāng) 天，在裂解緩沖液(40:1 v/v 1 x Reporter裂解緩沖液(Promega， Madison WI): Protease Inhibitor Cocktail ( Sigma, St Louis M0)) 中將肝臟或目艮勻漿。用Bradford Assay (Biorad， Hercules CA )測(cè) 定蛋白質(zhì)含量。用Galacto-Light system (Tropix， Bedford MA )領(lǐng)'J 定p-半乳糖苷酶活性。
在接受了載體的小鼠的肝臟中，p-半乳糖苷酶活性水平比未注射 對(duì)照高約1000倍，而在眼中，注射載體的動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物間的該酶活 性水平相似。在給予了表達(dá)該酶的腺病毒之后的眼中未出現(xiàn)可檢測(cè)的 P-半乳糖苷酶活性，這意味著血管內(nèi)注射內(nèi)皮抑制素載體后的抗血管 生成效應(yīng)是由于內(nèi)皮抑制素的全身性生成而非局部生成引起的。
實(shí)施例5:用Av3mEndo注射的小鼠與用Av3CsmEndo注射的小鼠間的 比較
用2xl011粒子的Av3mEndo (n=10)或Av3mNul1 (n=9)對(duì)小鼠進(jìn) 行尾靜脈注射，或用6xl010粒子的Av3CsmEndo(n=ll )或Av3CsmNu11 (n-ll)注射。還包括一個(gè)未注射對(duì)照組(n-ll)。注射后四天，如 上所述用激光使各鼠各眼的玻璃膜發(fā)生三處破裂。注射后七天，從各 鼠的尾靜脈抽血，血清于-80X:保存以用于ELISA。注射后18天以及 激光處理后14天，如上所述估計(jì)脈絡(luò)膜f lat mounts上的CNV面積。
用鼠內(nèi)皮抑制素酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)試劑盒(ACCUCYTE 鼠內(nèi)皮抑制素Cytlmmune Sciences, College Park, MD)根據(jù)制造 商說(shuō)明測(cè)定內(nèi)皮抑制素血清水平。第二個(gè)栽體構(gòu)建物Av3CsmEndo的表征證實(shí)，與用最大耐受劑量的 Av3mEndo粒子(2xl0"pfu)注射的小鼠中的水平相比，Av3CsmEndo 的血管內(nèi)注射產(chǎn)生高約IO倍的最大內(nèi)皮抑制素水平。用Av3mEndo和 Av3CsmEndo注射的小鼠中的內(nèi)皮抑制素血清水平顯著高于未注射或 注射了空栽體的對(duì)照小鼠中的水平。小鼠中的基本內(nèi)皮抑制素水平介 于約30至150 ng/ml血清之間。
因此，注射了由Rous肉瘤病毒啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sig-mEndo表達(dá)的構(gòu)建 體的小鼠具有適度高的內(nèi)皮抑制素水平，并且在激光誘導(dǎo)的玻璃膜破 裂位點(diǎn)比用空病毒注射的小鼠具有顯著較小的CNV損傷。注射了由猿 巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sig-mBndo的構(gòu)建體的小鼠具有約10倍高的內(nèi) 皮抑制素血清水平并具有顯著較小的CNV，幾乎完全抑制。
實(shí)施例6:編碼人內(nèi)皮抑制素的重組腺載體的制備
從人al (XVIII)膠原蛋白cDNA PCR擴(kuò)增出人內(nèi)皮抑制素cDNA。 通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT- PCR)從人肝臟polyA RNA (Clonetech， Palo Alto, CA)產(chǎn)生人肝臟cDNA。用Perkin Elmer RT-PCR試劑盒(Perkin Elmer Applied Biosystems， Foster City, CA)和引物5' -TTT TTT TTT CAG TGT AAA AGG TC-3' ( SEQ ID NO: 17)在以下條件中進(jìn)行1個(gè)循環(huán)完成反轉(zhuǎn)錄室溫下10分鐘，42匸反 轉(zhuǎn)錄3分鐘，99X:變性5分鐘，51C冷卻5分鐘，保持在41C直到cDNA 用乙醇沉淀并重懸。用引物5' -CAG ATG ACA TCC TGG CCA G-3' ( SEQ ID NO: 18 )和-CTA TAC AGG AAA GTA TGG CAG C-3' ( SEQ ID NO: 19)從已經(jīng)制備好的cDNAPCR擴(kuò)增出790 bp人內(nèi)皮抑制素cDNA片段。 在以下條件下完成35個(gè)循環(huán)95X:熱起始3分鐘，80t: 3分鐘，之 后添加Pfu DNA聚合酶(Stratagene， La Jolla， CA) ， 95C變性1 分鐘，55r退火l分鐘，以及72X:延伸3分鐘。凝膠純化出790 bp 人內(nèi)皮抑制素cDNA片段經(jīng)并如所述進(jìn)行再擴(kuò)增一一除了使用58t:的 退火溫度。凝膠純化790 bp人內(nèi)皮抑制素cDNA片段，并根據(jù)制造商 說(shuō)明用PCR-Script Cloning試劑盒(Stratagene)將其克隆進(jìn)PCR-Script Amp SK+以產(chǎn)生pcrhend I。由Gene Therapy Core Technologies Molecular Core Laboratory at Genetic Therapy, Inc. Gaithersburg， MD經(jīng)直接測(cè)序分析驗(yàn)證pcrhend I質(zhì)粒的人內(nèi) 皮抑制素cDNA區(qū)域。
根據(jù)以下程序用人BM4 0基底蛋白質(zhì)引導(dǎo)序列來(lái)組裝人內(nèi)皮抑制 素cDNA片段。使兩條合成寡核苷酸，5' -GCC AAG CTT CCA TGA GGG CCT GGA TCT TCT TTC TCC TTT GCC TGG CCG GGA GGG CTC TGG CAG CCC CTC AGC AAG AAG CGC TCG CTC ACA GCC ACC GCG ACT TCC AGC CGG TGC TCC A-3'(正義)(SEQ ID NO: 20)、和5' -CCA GGT GGA GCA CCG GCT GGA AGT CGC GGT GGC TGT GAG CGA GCG CTT CTT GCT GAG GGG CTG CCA GAG CCC TCC CGG CCA GGC AAA GGA GAA AGA AGA TCC AGG CCC TCA TGG AAG CTT GGC-3'(反義)(SEQ ID NO: 21)，退火來(lái)產(chǎn)生BM40 基底蛋白引導(dǎo)序列，之后用Hind III和Sex Al消化。將經(jīng)過消化的 BM40基底蛋白引導(dǎo)序列克隆進(jìn)pcrhend I的Hind III和Sex Al位點(diǎn) 以產(chǎn)生pBmpcrhen質(zhì)粒。通過直接測(cè)序分4斤驗(yàn)證pBmpcrhen質(zhì)粒的整 個(gè)sig-hEndo區(qū)域。
在以下程序中，在pAvF9Lxr腺病毒穿梭質(zhì)粒中將含有Factor IX (F9)的序列替換為含有sig-Endo的序列來(lái)產(chǎn)生腺病毒穿梭質(zhì)粒 pAVlbmhendlx。 Sacl消化后經(jīng)Klenow補(bǔ)齊和Sal I消化從pBmpcrhen 產(chǎn)生含有sig-hEndo序列的800 bp片段。pAvF9Lxr質(zhì)粒用Barn HI限 制酶消化，之后經(jīng)Klenow補(bǔ)齊并用Sal I限制酶消化以除去含有F9 的序列。凝膠純化這兩個(gè)片段，并使其連接以產(chǎn)生pAVlbmhendlx。
經(jīng)RT-PCR從來(lái)自人肝臟poly A RNA的人al (XVIII)膠原蛋白 cDNA C-末端產(chǎn)生人內(nèi)皮抑制素cDNA。從兩條合成寡核苷酸產(chǎn)生人 BM40基底蛋白引導(dǎo)序列。用退火后的人BM40基底蛋白引導(dǎo)序列與人 內(nèi)皮抑制素cDNA的5'克隆以形成用于分泌人內(nèi)皮抑制素蛋白的 sig-hEndo嵌合蛋白。將sig-hEndo嵌合DNA克隆進(jìn)腺病毒穿梭質(zhì)粒 pAvF91xr以產(chǎn)生pAVlbmhendlx (附

圖12A)。通過自動(dòng)測(cè)序分析驗(yàn)證 整個(gè)sig-hEndo嵌合序列。根據(jù)下列程序用"Quick Cre/Lox雙質(zhì)粒系統(tǒng)"產(chǎn)生編碼sig-hEndo 嵌合蛋白的重組Av3bmhendlx (帶有E1、 Eh、和ES-缺失)。首先用 Not I和Cla I限制酶分別使質(zhì)粒pAVlbmhendlx和pSQ3線性化。用 0. 3jiM地塞米松預(yù)處理S8細(xì)胞24小時(shí)，之后用LipofectAMINE PLUS Reagent (Life Technologies, Rockville， MD )在含有4x105 S8細(xì) 胞每孔的6孔板上完成S8細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。用lpg線性化的pSQ3、 0. 5 Hg pCre、和0. 5 jug線性化的pAVlbmhendlx、和6 pi脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺才艮 據(jù)制造商的方法(Life Technologies)制備脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺復(fù)合DNA (lipofectamine complexed DM) 。 37"C下將S8細(xì)胞與脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺 復(fù)合DNA溫育4. 5小時(shí)。除去脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺復(fù)合DNA，并用PBS洗滌細(xì) 胞。37C下用5%0)2培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的S8細(xì)胞直到觀察到致細(xì)胞病變。刮 取收集細(xì)胞和培養(yǎng)基。經(jīng)五個(gè)凍融循環(huán)制備粗病毒裂解物。在含有5 % FBS的Richter，s CM培養(yǎng)基中用0.3 jiM地塞米松使Av3bmhendlx 在S8細(xì)胞中再擴(kuò)增直到觀察到致細(xì)胞病變。
Av3bmhend 1 x介導(dǎo)的人內(nèi)皮抑制素表達(dá)和分泌在經(jīng)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的S8 細(xì)胞中表征。經(jīng)SDS-PAGE分析用Av3bmhendlx感染的細(xì)胞的上清蛋白 質(zhì)，也即，人內(nèi)皮抑制素。在4至12%的線性梯度預(yù)制凝膠上分析每 20pg上清蛋白質(zhì)。將SDS-PAGE轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用考馬斯 藍(lán)R-250對(duì)該膜染色。從膜印跡上切出對(duì)應(yīng)于人內(nèi)皮抑制素正確大小 的20 kDa蛋白條帶，并對(duì)其做N-末端蛋白質(zhì)測(cè)序分析。測(cè)定了三個(gè) 主要分泌蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列，其中50%具有帶附加氨基酸殘基 APQQEALA(SEQ ID NO: 5)的人內(nèi)皮抑制素氨基酸序列，25%含有殘 基LA，以及25。/。不帶有來(lái)自人BM40基底蛋白質(zhì)信號(hào)肽的殘基。在來(lái) 自Av3Nul1細(xì)胞的上清蛋白質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)20 kDa蛋白質(zhì)。該結(jié)果證實(shí)， 人內(nèi)皮抑制素經(jīng)過人BM40基底蛋白信號(hào)肽加工后，經(jīng)Av3bmhendlx 轉(zhuǎn)導(dǎo)的S8細(xì)胞表達(dá)并分泌人內(nèi)皮抑制素。
實(shí)施例7:由Biv栽體介導(dǎo)的抗血管生成基因表達(dá)對(duì)視網(wǎng)膜滲漏、增厚、 脫離、和新生血管形成的體內(nèi)抑制從三個(gè)組成系統(tǒng)產(chǎn)生編碼eGFP的牛免疫缺陷病毒(BIV )載體(描 述于已出版的國(guó)際專利^^開號(hào)W00144458中，將該^^開文本全文引入 本文作為參考)'根據(jù)Takahashi， K.等人#咖.r力er. 13， 1305-1316 ( 2002 )，轉(zhuǎn)移載體BIVendostain衍生自pBSV4MGpptGAG， 一種基于BIV的、在MND U3啟動(dòng)子下編碼eGFP的轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建體。 用鼠內(nèi)皮抑制素(mEndo)替換了 eGFP編碼序列。特別的，為使eGFP 從親體質(zhì)粒pBSV4MGpptGAG中缺失，通過PCR擴(kuò)增了 eGFP加上一些側(cè) 翼序列。所用引物為eGFPlF0R 5'
-GCGCATGTCGACAGAATATGGGCCAAAC-3'，其在PCR產(chǎn)物5'末端摻入 Sall位點(diǎn)，和eGFPlREV 5' -GCGCTACTGCAGAGCTAATGAGCTACAC-3', 其在PCR產(chǎn)物3'末端摻入Pstl位點(diǎn)。用Sail和Pstl切割該片段， 并將其與已經(jīng)事先用Sail和Pstl消化的pBSII(KS+)連接，從而形成 pBS2eGFP。用ExSite PCR-Based Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene， LaJolla， CA)使eGFP從pBS2eGFP中缺失。把PCR 引物設(shè)計(jì)成位于eGFP基因外部的兩側(cè)、并指向外部，從而使其能擴(kuò)增 包括整個(gè)側(cè)翼序列和質(zhì)粒、但除eGFP之外的一切。所用引物為 DELeGFPlFOR: 5' -CCGGCTAGCTTAAGGGTGGCGACCGGT-3'，其加入了 Nhel 和AfIII限制性位點(diǎn)，和DELeGFPlREV: 5'
-GCTTCGAACGCGTAGCGGCCAACCCTC-3'，其加入了 BstBI和Mlul限制 性位點(diǎn)。根據(jù)制造商的說(shuō)明處理擴(kuò)增子，并將其連接形成缺失了 eGFP、 但帶有從其親本質(zhì)粒的側(cè)翼序列的pBS2deleGFP。該策略還在中間形 成了四個(gè)新的限制性位點(diǎn)。對(duì)該片段進(jìn)行測(cè)序以確定未引入突變。根 據(jù)Mori， K.等人j/zzer. /.戶"力o/. 159， 313-320 ( 2001 )從腺病毒 穿梭質(zhì)粒，pAVmEndolxr制備mEndo基因插入物。用Nhel和Clal消 化該質(zhì)粒以釋放mEndo片段。將該片段與已經(jīng)事先用Nhel和Bs tBI(末 端與Clal相容)消化的pBS2deleGFP相連，由此產(chǎn)生 pBS2deleGFPmEndo。將Woodchuck肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE) 插入mEndo下游的Mlul位點(diǎn)，由此形成pBS2deleGFPmEndoPRE。最后， 用Bsu361和BbvCI消化質(zhì)粒pBS2deleGFPmEndoPRE以釋放mEndo編碼序列和原始eGFP側(cè)翼序列，將該片段與已經(jīng)事先用Bsu 361和BbvC 1 消化的pBS4MGpptGAG相連，由此產(chǎn)生pBvMNDmEndoPRE。還產(chǎn)生了空 BIV載體pBvMNDPRE，并將其用作陰性對(duì)照載體。除了不含mEndo編碼 序列，PBvMNDPRE與pBvMNDmEndPRE相同'
簡(jiǎn)言之，為產(chǎn)生編碼mEndo的BIV載體粒子(BIVendostatin)， 在150mm培養(yǎng)皿(2xl()7細(xì)胞/皿)中用45 jig pBvMNDmEndoPRE、 45 pg 基于BIV的包裝構(gòu)建體pBIVminipack、和13. 5 jig假型化包膜表達(dá)構(gòu) 建體pVSV-G轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。為產(chǎn)生BIV空載體(BIVNuII)，用 pBvMNDPRE構(gòu)建體替代pBvMNDmEndoPRE。轉(zhuǎn)染后四十八小時(shí)，收集栽 體并經(jīng)0.45 jim濾膜過濾。之后用超離心濃縮載體上清液。將濃縮的 載體等分并保存于-80TC直至使用。
檢測(cè)濃縮栽體的反轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性，這是對(duì)栽體粒子的一種測(cè) 定。BIVendostatin和BIVNull載體的RT活性都約為15 ng/ml。我 們之前已經(jīng)用基于BIV的編碼eGFP的栽體顯示了 1 ng RT約等于 lxl()5轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(T，U.)。因此，所估測(cè)的BIVendostatin載體滴度為 1. 5xl09 T. U. /ml。為檢測(cè)BIVendostatin載體是否能夠介導(dǎo)mEndo的 有效產(chǎn)生，用1 jil (15 ng RT當(dāng)量栽體粒子)BIVNull載體或等量的 BIVendostatin栽體在六孔板(4xl(T細(xì)胞/孔)中轉(zhuǎn)導(dǎo)Cf2Th細(xì)胞。 轉(zhuǎn)導(dǎo)后四十八小時(shí)，根據(jù)制造商的指導(dǎo)(Cytimmune Sciences Inc., College Park, MD)用商業(yè)內(nèi)皮抑制素檢測(cè)試劑盒，Accucyte小鼠內(nèi)
皮抑制素檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)細(xì)胞上清液中的內(nèi)皮抑制素表達(dá)。經(jīng) BIVendostatin載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)生412 ng/ml內(nèi)皮抑制素，而 BIVNull栽體未顯示可檢測(cè)的內(nèi)皮抑制素水平。
經(jīng)視網(wǎng)膜下注射向單轉(zhuǎn)基因小鼠(IRBP/rtTA-TRE/VEGF tg小鼠) (該轉(zhuǎn)基因小鼠在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)下從小鼠感光細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因子)，施用根據(jù)O'Reilly等人，Ce//; 88 (2): 277-85 ( 1997 )制備 的編碼鼠內(nèi)皮抑制素的BIV載體。向小鼠右眼中注射BIV載體，而用 左眼作為不注射栽體的對(duì)照。注射后三周，在轉(zhuǎn)基因小鼠的引用水中 加入O. 5 mg/ml強(qiáng)力霉素。通過熒光血管造影檢查發(fā)現(xiàn)，由強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小鼠左眼上產(chǎn)生嚴(yán)重的新生血管形成。由 BIV載體介導(dǎo)的內(nèi)皮抑制素表達(dá)完全阻斷同 一小鼠右眼中由VEGF誘導(dǎo) 的新生血管形成。
經(jīng)免疫組織化學(xué)染色的眼冷凍切片(這些切片來(lái)自右眼視網(wǎng)膜下 接受了 1.5xl()6轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)的BIVendostatin注射且左眼接受了 1. 5xl06 TU BIVNull注射、并且在注射載體四周后安樂死的成年 C57BL/6小鼠的眼睛)顯示，經(jīng)BIVendostatin注射的眼睛表現(xiàn)出RPE 細(xì)胞中以及整個(gè)內(nèi)核層的內(nèi)皮抑制素強(qiáng)染色， 一些血管壁細(xì)胞帶有密 集染色。內(nèi)網(wǎng)層中線性染色結(jié)構(gòu)是Muller細(xì)胞突起典型的。用BIVNull 注射的眼睛沿內(nèi)界膜和玻璃膜出現(xiàn)反應(yīng)產(chǎn)物，這可能是由于與膠原蛋 白XVIII交叉反應(yīng)導(dǎo)致的。
右眼接受了 1. 5xl()6轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)的BIVendostatin、且左眼接 受了 1. 5xl06 TU BIVNull的視網(wǎng)膜下注射的成年雙重轉(zhuǎn)基因 rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠在注射四周后開始在其飲用水中加入2 mg/ml 強(qiáng)力霉素，使用強(qiáng)力霉素3天后用[3H]甘露醇測(cè)定這些小鼠的視網(wǎng)膜 血管滲透性。與用空載體注射的伴眼相比，在表達(dá)內(nèi)皮抑制素的眼中 視網(wǎng)膜至肺(retina to lung (RLLR))被顯著降低，這表明用兩個(gè) 不同載體系統(tǒng)之中任一個(gè)表達(dá)內(nèi)皮抑制素都導(dǎo)致對(duì)由VEGF誘導(dǎo)的視 網(wǎng)膜血管滲透性的抑制。
成年rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠(其右眼接受了 1. 5xl06 TU BIVendostatin且左眼接受了 1. 5xl06 TU BIVNul 1視網(wǎng)膜下注射、并 在注射載體四周后其飲用水中添加了 0.5 mg/ml強(qiáng)力霉素)在開始使 用強(qiáng)力霉素四天后接受熒光血管造影。用BIVendostatin注射的小鼠 在用BIVendostatin注射的眼中表現(xiàn)為出現(xiàn)正常的帶有清晰壁的視網(wǎng) 膜血管，這表明極少或幾乎沒有熒光素滲透，而用BIVNull注射的眼 在整個(gè)視網(wǎng)膜都顯示彌散熒光，這表示廣泛的熒光素外溢。開始使用 強(qiáng)力霉素七天后，與用BIVNull注射的眼相比仍幾乎沒有跡象顯示在 用BIVendostatin注射的眼中有熒光素外漏。當(dāng)視網(wǎng)膜血管滲透性提 高時(shí)，視網(wǎng)膜中積累了導(dǎo)致視網(wǎng)膜變厚的液體。黃斑變厚稱為黃斑水
32腫，異常變厚量與視敏度呈反向相關(guān)。因此，視網(wǎng)膜變厚是欲評(píng)估的
生理學(xué)相關(guān)變量，并適于用比如光學(xué)相干X射線斷層攝影術(shù)(OCT )或 視網(wǎng)膜變厚分析(RTA)這樣的體內(nèi)成像技術(shù)對(duì)其進(jìn)行精確的定量。在 飲用水中開始使用0.5 mg/ml強(qiáng)力霉素以誘導(dǎo)VEGF表達(dá)七天后，用 BIVendostatin注射的眼冷凍切片比用BIVNull注射的眼表現(xiàn)更少的 視網(wǎng)膜增厚。用八只rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠定量評(píng)估內(nèi)皮抑制素對(duì) 用VEGF誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜厚度的影響。
用1. 5xl06 TU BIVendostatin視網(wǎng)膜下注射右眼、用1. 5xl06 TU BIVNull視網(wǎng)膜下注射左眼四周后，開始在小鼠飲用水中使用0.5 mg/ml強(qiáng)力霉素。開始使用強(qiáng)力霉素七天后，通過離各視神經(jīng)邊緣300 一沿水平子午線的成像分析測(cè)定視網(wǎng)膜厚度，并取平均值以得出各眼 的單實(shí)驗(yàn)值。用BIVNull注射的眼中的平均視網(wǎng)膜厚度顯著大于用 BIVendostatin注射眼的平均視網(wǎng)膜厚度。
用l，5xl06TU BIVendostatin視網(wǎng)膜下注射右眼、用1. 5xl06 TU BIVNull視網(wǎng)膜下注射左眼四周后，開始在小鼠飲用水中使用0.5 mg/ml強(qiáng)力霉素。開始4吏用強(qiáng)力霉素七天后，與用BIVendostatin注 射的眼相比，用BIVNull注射的眼中的視網(wǎng)膜新生血管形成量顯著更 大。
當(dāng)在rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠的飲用水中給以2 mg/ml強(qiáng)力霉素 5天或更久時(shí)，這些小鼠表達(dá)高水平的VEGF并發(fā)生出嚴(yán)重的新生血管 形成和視網(wǎng)膜脫離。用十一只rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠評(píng)估BIV栽有 的內(nèi)皮抑制素對(duì)由視網(wǎng)膜VEGF導(dǎo)致的這一嚴(yán)重表型的影響。用 1. 5xl06TUBIVendostatin視網(wǎng)膜下注射右眼、用1. 5xl06 TU BIVNull 視網(wǎng)膜下注射左眼四周后，開始在小鼠飲用水中使用2 mg/ml強(qiáng)力霉 素。開始使用強(qiáng)力霉素七天后，使小鼠安樂死，將眼在2%多聚甲醛 中固定。做總體病理檢查后，把它們?cè)?CT中冷凍并切片。用蘇木精 和曙紅對(duì)連續(xù)切片染色。由對(duì)栽體組未知的觀察者檢查各眼是否出現(xiàn) 總體、部分、或無(wú)視網(wǎng)膜脫離。用BIVendostatin注射的眼中總體視網(wǎng)膜脫離顯著少于用BIVNuII注射的眼中的總體視網(wǎng)膜脫離。與僅一 只用BIVNuII注射的眼沒有視網(wǎng)膜脫離相比，有四只用BIVendostatin 注射的眼沒有視網(wǎng)膜脫離。
實(shí)施例8:眼內(nèi)注射
為進(jìn)行利用腺病毒載體的研究，在成年小鼠一只眼中視網(wǎng)膜下注 射6xl07粒子的AGVC7mEndo和AGVas521的1 : 1混合物，另一只眼中 視網(wǎng)膜下注射6xl(T粒子的AGVnull。為進(jìn)行利用慢病毒載體的研究， 小鼠一只眼中接受5xl(T轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)的BIVendostatin，另一只眼 接受5xl06 TU的BIVNuIl。校準(zhǔn)拉伸式玻璃微量移液管以通過壓下腳 踏開關(guān)吸取l pl栽體。用聚光透鏡系統(tǒng)在解剖顯微鏡和接觸透鏡上 完成注射，這可以使視網(wǎng)膜在注射過程中可視化。麻醉小鼠，使其瞳 孔放大，并在解剖顯微鏡下將尖的微量移液管頭穿透鞏膜至其后緣并 定位在剛好視網(wǎng)膜上方。按壓腳踏開關(guān)使注射液噴射刺穿視網(wǎng)膜。由 于出現(xiàn)小視網(wǎng)膜脫離(bleb(小泡))，因此這一技術(shù)的創(chuàng)傷極小， 而且直接可視化保證了注射的成功。小泡的大小十分一致，而且這些 小泡涉及約小于一半的視網(wǎng)膜面積。
實(shí)施例9:由無(wú)病毒基因的腺病毒載體介導(dǎo)的眼中的受控內(nèi)皮抑制素 表達(dá)
根據(jù)Xu等人，Molecular Therapy; 3:262 ( 2001 )描述的方法 完成利用腺病毒載體運(yùn)輸系統(tǒng)的內(nèi)皮抑制素體內(nèi)受控表達(dá)。分別從質(zhì) 粒pAGVas521和pAGVC7mEndo產(chǎn)生編碼可由三苯氧胺誘導(dǎo)的嵌合轉(zhuǎn)錄 因子的AGV載體AGVas521、和可調(diào)控內(nèi)皮抑制素轉(zhuǎn)基因AGVC7mEndo。 根據(jù)Reddy， P. S,等人，Molec. Ther, 5， 63-73 ( 2002 )，該AGV質(zhì) 粒除含有轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒(參見下述)外還含有側(cè)翼為獨(dú)特Pac I位點(diǎn) 的左和右ITRs、 Ad5包裝信號(hào)、以及作為DNA "填充物，，的約25 kb 的人a synuclein內(nèi)含子區(qū)域。質(zhì)粒pAGVas521含有可由三苯氧胺資 導(dǎo)的嵌合轉(zhuǎn)錄因子，它由單一鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、以人雌激素受體為基礎(chǔ)的經(jīng)修飾的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、和衍生自VP16的由CMV啟動(dòng)子驅(qū) 動(dòng)的反式激活區(qū)域組成。為構(gòu)建pAGVas521,用Nru I和Bam HI消化 pAvCv-C7LBD分離出該嵌合轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)盒，并將其插入pBLSV2。質(zhì) 粒pBLSV2衍生自pBluescript (Strategene， La Jolla， CA)，含有 兩個(gè)多克隆位點(diǎn)多接頭。用Bspe I消化所得質(zhì)粒pBLSV2as521,并與 用Xma I消化的pGTI. 24aPL2連接形成pGTI24as521。 pGTI24aPL2含 有一個(gè)側(cè)翼為人synuclein填充DNA的多克隆位點(diǎn)多接頭。接下來(lái)， 用Pac I消化pGT124as521以釋放質(zhì)粒骨架，并根據(jù)Toietta， G.等 人，Mot. Ther. 5， 204-210 ( 2002 )所述通過在BJ5138大腸桿菌中 的同源重組與經(jīng)Pme I-Mlu I消化的pBV2結(jié)合以產(chǎn)生pAGVas521。質(zhì) 粒pBV2含有26625 bp的人synuclein填充DM。
質(zhì)粒pAGVC7mEndo含有驅(qū)動(dòng)鼠內(nèi)皮抑制素表達(dá)的、配體可誘導(dǎo)轉(zhuǎn) 錄因子調(diào)控的啟動(dòng)子。為構(gòu)建pAGVC7mEndo，用Asc I (鈍端)和Bam HI消化pav-6X2C7tatamendo并將其插入pBLSV2C7endo。用Bam HI 和Eco RI消化質(zhì)粒pBLSV2C7endo，末端補(bǔ)齊并與用Sma I消化的 pGTI245. aPL2連接以產(chǎn)生pGTI24C7endo。最后，用Pac I消化 pGTI245. aPL2以釋放質(zhì)粒骨架，并4艮據(jù)上述Toietta的方法通過在 BJ5138大腸桿菌中的同源重組與經(jīng)Pme I和Mlu I消化的pBV4結(jié)合 以產(chǎn)生pAGVC7mEndo。質(zhì)粒pBV4含有27191 bp的人synuclein填充 DNA。
根據(jù)Reddy等人的描述完成無(wú)病毒基因的載體的產(chǎn)生、大規(guī)模制 備和純化。通過光學(xué)密度檢測(cè)測(cè)量粒子滴度。通過限制性酶消化驗(yàn)證 栽體完整性來(lái)分析從CsCI-純化載體提取的DNA。用一種基于六鄰體 (hexon )的定量PCR檢測(cè)方法確定AGV制品中的輔助病毒污染水平。 本研究中所使用的AGVNuII、 AGVas521、和AGVC7mEndo制品的輔助病 毒污染水平分別為0. 09%、 1.9%、和1.4%。
對(duì)C57BL/6小鼠全身性施用編碼可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子、或可調(diào)控內(nèi)皮 抑制素轉(zhuǎn)基因的早期世代的El/E2a/E3缺陷型載體之后，這一三苯氧 胺-可誘導(dǎo)系統(tǒng)在C57BL/6小鼠血清中顯示出高水平的可誘導(dǎo)內(nèi)皮抑
35制素表達(dá)。
該調(diào)控系統(tǒng)由兩個(gè)構(gòu)件組成， 一個(gè)可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子、和一個(gè)驅(qū) 動(dòng)內(nèi)皮抑制素表達(dá)的應(yīng)答啟動(dòng)子。該轉(zhuǎn)錄因子由一個(gè)經(jīng)過修飾的對(duì)三
苯氧胺產(chǎn)生應(yīng)答的人雌激素配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、 一個(gè)獨(dú)特的半胱氨酸2-組氨酸2鋅指DNA結(jié)合基序、和一個(gè)來(lái)自VP 16的最小反式激活結(jié)構(gòu) 域組成。該應(yīng)答啟動(dòng)子由被轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)識(shí)別的 DNA序列六個(gè)重復(fù)、和一個(gè)編碼內(nèi)皮抑制素的DNA組成。在三苯氧胺 存在下，該轉(zhuǎn)錄因子激活從與最小啟動(dòng)子連接的獨(dú)特靶核酸序列的轉(zhuǎn) 錄。當(dāng)用熒光素酶進(jìn)行體外評(píng)估時(shí)，三苯氧胺誘導(dǎo)高至250倍的表達(dá)。 該系統(tǒng)整合到兩個(gè)無(wú)病毒基因的腺病毒載體中，它們都不含全部的病 毒編碼區(qū)域。 一個(gè)栽體編碼轉(zhuǎn)錄因子，第二個(gè)編碼驅(qū)動(dòng)編碼內(nèi)皮抑制 素的核酸的靶啟動(dòng)子。將這兩種載體注射進(jìn)小鼠，其導(dǎo)致有效的肝轉(zhuǎn) 導(dǎo)。向小鼠施用三苯氧胺導(dǎo)致可誘導(dǎo)的內(nèi)皮抑制素表達(dá)，由此產(chǎn)生高 至20 ng/ml的極高血漿水平。兩個(gè)月中完成了四次三苯氧胺誘導(dǎo)。 在不存在三苯氧胺時(shí)，觀察到了背景水平的內(nèi)皮抑制素。
用三苯氧胺處理接受了構(gòu)成可誘導(dǎo)系統(tǒng)的AGVC7mEndo和 AGVas521栽體對(duì)注射的小鼠表現(xiàn)出整個(gè)視網(wǎng)膜的內(nèi)皮抑制素強(qiáng)染色， 這證實(shí)了內(nèi)皮抑制素表達(dá)在視網(wǎng)膜中的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。
用[3H]甘露醇作為追蹤劑測(cè)定成年IRBP/rtTA-TRE/VEGF小鼠中 視網(wǎng)膜血管滲透性，這些小鼠右眼接受了 6xl(T粒子的AGVC7mEndo和 AGVas521的1:1混合物視網(wǎng)膜下注射且左眼接受了 6xl(T粒子的 AGVNuII視網(wǎng)膜下注射、以及之后用三苯氧胺處理六天以誘導(dǎo)內(nèi)皮抑 制素表達(dá)，其中最后三天這些小鼠還接受了強(qiáng)力霉素以誘導(dǎo)VEGF表 達(dá)。與僅誘導(dǎo)了 VEGF表達(dá)的伴眼相比，在同時(shí)誘導(dǎo)了內(nèi)皮抑制素和 VEGF表達(dá)的眼中視網(wǎng)膜至肺(RLLR)和視網(wǎng)膜至腎滲漏比(RRLR )都 被顯著降低。這證實(shí)，內(nèi)皮抑制素抑制VEGF-誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管滲透 性提高。
實(shí)施例10:轉(zhuǎn)基因小鼠和試驗(yàn)方法本研究中使用了由Ohno-Matsui， K.等人J瓜/.戶fl"o/. I", 711-719 ( 2002 )產(chǎn)生的兩個(gè)雙重轉(zhuǎn)基因小鼠系，這兩個(gè)小鼠系都帶有 在視網(wǎng)膜中可誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)。在其中的一個(gè)小鼠系中，光感受器間 維生素A類結(jié)合蛋白(IRBP )啟動(dòng)子與反向的四環(huán)素反式激活子(rtTA ) 系統(tǒng)結(jié)合以指導(dǎo)光感受器中VEGF的強(qiáng)力霉素-可誘導(dǎo)表達(dá)。這些小鼠 稱為IRBP/rtTA-TRE/VEGF小鼠。在雙重轉(zhuǎn)基因小鼠中第二個(gè)小鼠系 中，視紫質(zhì)啟動(dòng)子而非IRBP啟動(dòng)子與反向的四環(huán)素反式激活子(rtTA) 系統(tǒng)結(jié)合以指導(dǎo)光感受器中VEGF的強(qiáng)力霉素-可誘導(dǎo)表達(dá)。這些小鼠 稱為rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠.
1) 內(nèi)皮抑制素的免疫組織化學(xué)
將眼刺穿并置于4%多聚甲醛/5%蔗糖中，之后在0. 1M、 pH7. 4 的磷酸緩沖液中4n孵育過夜1. 5小時(shí)。之后漂洗該眼并迅速冷凍于 0. 1M磷酸緩沖液/溶于0CT的20%蔗糖的2:1混合物中。使十微米冷 凍切片干燥，之后在冰冷的4%多聚甲醛中固定30分鐘。漂洗后，用 含有6. 25% &02的水冷曱醇對(duì)玻片阻斷15分鐘，之后再用Tris-緩 沖鹽溶液中的(TBS) 2%脫脂牛奶于室溫下阻斷30分鐘。于室溫下將 玻片在溶于2。/。牛奶/TBS中的1.5 pg/ml多克隆山羊抗小鼠內(nèi)皮抑制 素IgG (R&D Systems, Minneapolis, MN)中孵育1小時(shí)。在0,1 % 牛奶/TBS中洗滌10分鐘后，室溫下將玻片在溶于2。/。牛奶/TBS中的2 jig/ml生物素綴合的抗山羊IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz， CA)中孵育30分鐘。在0. 1 %牛奶/TBS中洗滌10分鐘后，室 溫下將玻片在鏈酶抗生物素蛋白-磷酸酯酶(Kirkegaard和Perry, Cabin John, MD )孵育30分鐘。在0. 05 M Tris HCI中洗滌五分鐘 后，用HistoMark Red ( Kirkegaard和Perry)使玻片顯色并固定。
2 ) 用[311]甘露醇作為追蹤劑對(duì)視網(wǎng)膜血管滲透性的測(cè)定
對(duì)成年雙重轉(zhuǎn)基因IRBP/rtTA-TRE/VEGF小鼠(n = ll)右眼視網(wǎng) 膜下注射6xl07粒子的AGVC7mEndo和AGVas521的1: 1混合物和左眼視網(wǎng)膜下注射6xl(T粒子的AGVNuII。第二天開始每天對(duì)小鼠施以腹膜下注射500 jig溶于5 0/。DMS0葵花子油中的三苯氧胺，三天后，對(duì)在它們的飲用水中給以2mg/ml強(qiáng)力霉素。開始^f吏用強(qiáng)力霉素后三天，用PH]甘露醇測(cè)定視網(wǎng)膜血管滲透性。簡(jiǎn)言之，對(duì)小鼠腹膜內(nèi)注射lnCi/克體重[3H]甘露醇(New England Nuclear, Boston, MA)。 一小時(shí)后，殺死該小鼠并取出眼睛。取出角膜和晶狀體，仔細(xì)地從視杯中分離出完整視網(wǎng)膜并將其置于預(yù)先稱重的閃爍瓶(scintillationvials)中。打開胸腔，取出左上肺葉并將其置于另一個(gè)預(yù)先稱重的閃爍瓶中。做左背部切口，進(jìn)入腹膜后隙而不進(jìn)入腹膜腔。用鑷子夾住腎血管，取出左腎，清除全部脂肪并將其放到一個(gè)預(yù)先稱重的閃爍瓶中。除去瓶中的所有液體，并使瓶中的殘余液體蒸發(fā)20分鐘。給小瓶稱重，記錄組織重量。向各小瓶中加入一毫升NCSII溶解液(Amersham，Chicago, IL)，將小瓶在50C水浴中孵育過夜。將溶解了的組織恢復(fù)至室溫，并用溶于曱苯中的20%苯甲酰過氧化物使其在50X:水浴中脫色。將小瓶恢復(fù)至室溫，加入五毫升Cytoscint ES ( ICN， Aurora,OH)和30 jal水乙酸。4匸將小瓶在黑暗中保存數(shù)小時(shí)以除去化學(xué)發(fā)光。用Wallac 1409液體閃爍計(jì)數(shù)器(Gaithersburg， MD)對(duì)放射活性進(jìn)行計(jì)數(shù)。
3 ) 用熒光素泄漏估測(cè)視網(wǎng)膜血管滲透性
對(duì)成年rho/rtTA-TRE/VEGF雙重轉(zhuǎn)基因小鼠右眼視網(wǎng)膜下注射1.&106轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)的BIVendostatin以及左眼視網(wǎng)膜下注射1.5xl(^TU的BIVNuII。注射載體四周后，開始在小鼠的飲用水中加入O. 5 mg/ml強(qiáng)力霉素。四或七天后，對(duì)小鼠腹膜內(nèi)注射12 jnl/g體重的1%熒光素鈉(Alcon， Fort Worth, Texas), —分鐘后用體內(nèi)熒光顯微鏡對(duì)各眼拍照。引發(fā)VEGF表達(dá)七天后，使另 一只小鼠安樂死，
片。切片用Griffonia simplicifolia lectin,蘇木精、和曙紅染色。用BIVNull注射的眼(F和H)中的視網(wǎng)膜比用BIVendostatin注射的眼(E和G)中的視網(wǎng)膜厚得多。
4) 視網(wǎng)膜厚的測(cè)量
對(duì)成年rho/rtTA-TRE/VEGF雙重轉(zhuǎn)基因小鼠右眼視網(wǎng)膜下注射1. 5xl06 TU的BIVendostatin和左眼視網(wǎng)膜下注射1. 5xl06 TU的BIVNull。注射栽體四周后，開始在小鼠的飲用水中加入0. 5 mg/ml強(qiáng)力霉素。開始使用強(qiáng)力霉素七天后，使小鼠安樂死，在各眼中相同的位置沿與視神經(jīng)相鄰的視網(wǎng)膜后部做10 pm視網(wǎng)膜冷凍切片。切片用生物素化的Griffonia simplicifolia lectin B4 ( GSA, VectorLaboratories, Burlingame， CA)染色，該染料選擇性結(jié)合于血管細(xì)胞22。將玻片在甲醇/H202中4X:孵育十分鐘，用0. 05 M、 pH 7， 6( TBS )Tris-緩沖鹽溶液洗滌，并在10%正常豬血清中孵育30分鐘。室溫下將玻片與生物素化的GSA孵育2小時(shí)，用O. 05M TBS漂洗后，將它們與綴合了過氧化物酶的抗生物素蛋白(Vector Laboratories)于室溫下孵育45分鐘。用HistoMarkRed ( Kirkegaard和Perry )使玻片顯色以產(chǎn)生紅色反應(yīng)產(chǎn)物，并用蘇木精和曙紅復(fù)染。通過對(duì)離視神經(jīng)各邊緣300 pm的圖像做分析測(cè)定視網(wǎng)膜厚度，求平均值以得出單個(gè)實(shí)驗(yàn)值。
5 ) 雙重轉(zhuǎn)基因小鼠中的視網(wǎng)膜新生血管形成的評(píng)估
使用了三只rho/rtTA-TRE/VEGF小鼠評(píng)估內(nèi)皮抑制素對(duì)由VEGF-誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管形成的效果。右眼視網(wǎng)膜下注射1. 5xl06 TU的BIVendostatin以及左眼視網(wǎng)膜下注射1. 5xl06TU的BIVNull四周后，開始在小鼠飲用水中加入O. 5 mg/ml強(qiáng)力霉素。開始使用強(qiáng)力霉素七天后，使小鼠安樂死，對(duì)各眼從虹膜外周邊緣至相隔180。的另一邊緣做切片(10 jim切片)。切片用Griffonia simplicifolia lectin(GSA)、蘇木精、和曙紅染色。
光感受器層中的GSA染色面積是新生血管形成的指征，在虹膜的一條邊緣至另一邊緣100 jim的切片(一般每只眼睛13張切片)上測(cè)定該面積。這13個(gè)測(cè)定值的平均值構(gòu)成單個(gè)實(shí)驗(yàn)值，即每張切片的新生血管形成面積。
6) 雙重轉(zhuǎn)基因小鼠中視網(wǎng)膜脫離的評(píng)估
對(duì)十一只成年rho/rtTA-TRE/VEGF雙重轉(zhuǎn)基因小鼠右眼視網(wǎng)膜下注射1. 5xl06 TU的BlVendostatin以及左眼視網(wǎng)膜下注射1. 5xl06 TU的BIVNuII。注射栽體后四周，開始在小鼠飲用水中加入2 mg/ml強(qiáng)力霉素。四天后，使小鼠安樂死，放大瞳孔，并由兩位觀察者獨(dú)立對(duì)各眼做眼底鏡檢查，觀察是否存在完全或部分視網(wǎng)膜脫離、或者沒有脫離。
本申請(qǐng)還>^開了如下項(xiàng)目中的內(nèi)容
1. 治療患有視網(wǎng)膜脫離或視網(wǎng)膜水腫的個(gè)體的視網(wǎng)膜脫離或視網(wǎng)膜水腫的方法，包括
使患有視網(wǎng)膜脫離或視網(wǎng)膜水腫的個(gè)體眼組織中的內(nèi)皮抑制素量提高至抑制視網(wǎng)膜脫離或視網(wǎng)膜水腫的有效量。
2. 項(xiàng)目l的方法，其中內(nèi)皮抑制素是具有SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的多肽。
3. 項(xiàng)目l的方法，其中內(nèi)皮抑制素是具有SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的多肽的多肽片段、具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽的衍生物、或具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽的變體。
4. 項(xiàng)目l的方法，其中所述提高是通過向個(gè)體施用外源內(nèi)皮抑制素來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
5. 項(xiàng)目l的方法，其中所述提高是通過使個(gè)體內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)皮抑制素來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
6. 項(xiàng)目5的方法，其中所述提高是通過向個(gè)體施用有效量的含有內(nèi)皮抑制素編碼核酸的病毒載體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
7. 項(xiàng)目6的方法，其中該病毒載體選自腺病毒、腺伴隨病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、和'漫病毒。
8. 項(xiàng)目7的方法，其中該病毒栽體是腺病毒載體。
9. 項(xiàng)目5的方法，其中所述提高是通過向個(gè)體內(nèi)植入至少一個(gè)微囊來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中該微嚢含有分泌內(nèi)皮抑制素的細(xì)胞。
10. 項(xiàng)目9的方法，其中該微囊含有藻酸鹽。
11. 項(xiàng)目IO的方法，其中該微囊含有藻酸鈉。
12. 項(xiàng)目ll的方法，其中該微囊含有藻酸鈣。
13. 項(xiàng)目12的方法，其中該微囊含有多聚L-賴氨酸。
14. 項(xiàng)目9的方法，其中該細(xì)胞含有外源內(nèi)皮抑制素編碼核酸。
15. 項(xiàng)目9的方法，其中該細(xì)胞過表達(dá)內(nèi)源內(nèi)皮抑制素編碼基因。
16. 項(xiàng)目4的方法，其中向個(gè)體施用約2. 5 mg/kg每天至約20mg/kg每天的內(nèi)皮抑制素。
17. 項(xiàng)目8的方法，其中以有效量施用腺病毒載體以使該個(gè)體表達(dá)內(nèi)皮抑制素從而在該個(gè)體血清中產(chǎn)生不超過l 000 000 ng/ml的內(nèi)皮抑制素濃度。
18. 項(xiàng)目8的方法，其中以有效量施用腺病毒載體以使該個(gè)體表達(dá)內(nèi)皮抑制素從而在該個(gè)體血清中產(chǎn)生至少約300 ng/ml的內(nèi)皮抑制素濃度。
19. 項(xiàng)目18的方法，其中內(nèi)皮抑制素在個(gè)體中以有效量表達(dá)從而在該個(gè)體血清中產(chǎn)生約300 ng/ml至約3000 ng/ml的內(nèi)皮抑制素濃度。
20. 項(xiàng)目19的方法，其中內(nèi)皮抑制素在個(gè)體中以有效量表達(dá)從而在該個(gè)體血清中產(chǎn)生約300 ng/ml至約1500 ng/ml的內(nèi)皮抑制素濃度。
21. 項(xiàng)目6的方法，其中載體以約108噬斑形成單位至約1014噬斑形成單位的量施用。
22. 項(xiàng)目8的方法，其中載體以約108噬斑形成單位至約1014噬斑形成單位的量施用。
23. 項(xiàng)目9的方法，其中微嚢以有效量植入以使細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮抑制素從而在該個(gè)體血清中產(chǎn)生不超過l 000 000 ng/ml的內(nèi)皮抑制素濃度。24. 項(xiàng)目8的方法，其中微囊以有效量植入以使個(gè)體表達(dá)內(nèi)皮抑制素從而在該個(gè)體血清中產(chǎn)生至少約300 ng/ml的內(nèi)皮抑制素濃度。
25. 項(xiàng)目18的方法，其中微囊以有效量植入個(gè)體從而在該個(gè)體血清中產(chǎn)生約300 ng/ml至約3000 ng/ml的內(nèi)皮抑制素濃度。
26. 項(xiàng)目19的方法，其中微嚢以有效量植入個(gè)體從而在該個(gè)體血清中產(chǎn)生約300 ng/ml至約1500 ng/ml的內(nèi)皮抑制素濃度。
27. 項(xiàng)目6的方法，其中內(nèi)皮抑制素編碼核酸具有SEQ ID NO: 2所示的序列。
28. 根據(jù)項(xiàng)目6的方法，其中病毒載體經(jīng)眼內(nèi)施用。
29. 根據(jù)項(xiàng)目28的方法，其中病毒栽體經(jīng)視網(wǎng)膜下施用。
30. 根據(jù)項(xiàng)目28的方法，其中病毒載體經(jīng)玻璃體內(nèi)施用。
31. 根據(jù)項(xiàng)目7的方法，其中病毒載體為慢病毒載體。
32. 項(xiàng)目33的方法，其中以有效量施用慢病毒載體以使該個(gè)體表達(dá)內(nèi)皮抑制素從而在該個(gè)體血清中產(chǎn)生不超過1 000 000 ng/ml的內(nèi)皮抑制素濃度。
33，項(xiàng)目32的方法，其中以有效量施用慢病毒栽體以使該個(gè)體表達(dá)內(nèi)皮抑制素從而在該個(gè)體血清中產(chǎn)生至少約300 ng/ml的內(nèi)皮抑制素濃度。
34. 項(xiàng)目33的方法，其中內(nèi)皮抑制素在個(gè)體中以有效量表達(dá)從而在該個(gè)體血清中產(chǎn)生約300 ng/ml至約3000 ng/ml的內(nèi)皮抑制素濃度。
35. 項(xiàng)目34的方法，其中內(nèi)皮抑制素在個(gè)體中以有效量表達(dá)從而在該個(gè)體血清中產(chǎn)生約300 ng/ml至約1500 ng/ml的內(nèi)皮抑制素濃度。
36. 項(xiàng)目31的方法，其中慢病毒載體為牛免疫缺陷病毒載體。
37. 項(xiàng)目36的方法，其中牛免疫缺陷病毒載體經(jīng)眼內(nèi)施用。
38. 項(xiàng)目37的方法，其中牛免疫缺陷病毒載體經(jīng)視網(wǎng)膜下施用。
39. 項(xiàng)目48的方法，其中牛免疫缺陷病毒載體經(jīng)玻璃體內(nèi)施用。
40. 項(xiàng)目6的方法，其中的提高是通過向個(gè)體施用病毒載體而可誘導(dǎo)地實(shí)現(xiàn)的，所述病毒栽體能夠使得在個(gè)體內(nèi)產(chǎn)生將誘導(dǎo)內(nèi)皮抑制素編碼核酸表達(dá)的物質(zhì)。41. 項(xiàng)目36的方法，其中牛免疫缺陷病毒載體經(jīng)眼周施用。
42. 項(xiàng)目6的方法，其中病毒載體經(jīng)眼周施用。
43. 內(nèi)皮抑制素在生產(chǎn)用于治療患有視網(wǎng)膜脫離或視網(wǎng)膜水腫的個(gè)體中的視網(wǎng)膜脫離或視網(wǎng)膜水腫的藥物中的用途，其中所述內(nèi)皮抑制素特別是具有SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的多肽。
44. 項(xiàng)目43的用途，其中內(nèi)皮抑制素是具有SEQIDN0:1所示氨基酸序列的多肽的多肽片段、具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽的衍生物、或具有SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽的變體。
45. 項(xiàng)目43的用途，其中在眼組織中引起內(nèi)皮抑制素量提高。
46. 項(xiàng)目45的用途，其中所述提高是通過施用有效量含有內(nèi)皮抑制素編碼核酸的病毒實(shí)現(xiàn)的。
47. 項(xiàng)目46的用途，其中所述病毒載體選自腺病毒、腺伴隨病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、和慢病毒。
48. 項(xiàng)目46的用途，其中所述提高是通過在患有視網(wǎng)膜脫離或視網(wǎng)膜水腫的個(gè)體中植入至少一個(gè)微囊實(shí)現(xiàn)的，其中該微嚢含有分泌內(nèi)皮抑制素的細(xì)胞。序列表
<110> Novartis AG
<120=>眼的基因治療
<130> 4-32625<160> 21
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1<211> 183<212> PRT<213>人
<400> 1
HisSerHisArgAspPheGinProValLeuHisLieuValAlaUeuAsn
11015
SerProUeuSer 20GlyGly■MetArgGly 25lieArgGlyAlaAsp 30PheGin
CysPheGin 35GinAlaArgAlaVal 40GlyLieuAlaGlyThr 45PheArgAla
PheLeu 50SerSerArgGin 55AspUeuTyrSerlie 60ValArgArgAla
AspAr:gAlaAlaValPro工leValAsnLeuLysAspGluLeuLeuPhe
65707580
ProSerTrpGluAla 85lieuPheSerGlySer 90GluGlyProLeuLys 95Pro
GlyAlaAxg工le 100PheSerPheAspGly 105LysAspValLeuArg 110HisPro
ThrTrpPro 115GinLysSerValTrp 120HisGlySerAspPro 125AsnGlyArg
ArgJdeu 13 0ThrGluSerTyrCys 13 5GluThrTrpArgThr 140GluAlaProSer
AlaThrGlyGinAlaSerSerIjeuLeuGlyGlyArgIjeulieuGlyGin
145150155160
SerAlaAlaSerCys 165HisHisAlaTyrlie 170ValLeuCyslieGlu 175Asn
SerPheMetThrAlaSerLys
180
<210> 2<211> 551<212> DNA<213>人
<400> 2
acagccaccg
gcggcatgcg
ggctggcggg
tgcgccgtgc
ccagctggga
cgacttccaggggcatccgccaccttccgccgaccgcgcaggctctgttc
ccggtgctcc
ggggccgact
gccttcctgtgccgtgcccatcaggctctg
acctggttgctccagtgcttcctcgcgccttcgtcascctagggtccgct
gctcascagcccagcaggcggcaggacctgcaaggacgaggaagcccggg
cccctgtcagcgggccgtggtacagcatcgctgctgtttcgcacgcatct
60120180240300
tctcctttga cggca3ggac gtcctgaggc etccccacctgatggctcgga ccccaacggg cgcaggctga ccgagagctaaggctccctc ggccacgggc caggcctcct cgctgctggggtgccgcgag ctgccatcac gcctacatcg tgctctgcatcctccaagta g
gccccagaag agcgtgtggcctgtgagacg tggcggacgggggcaggctc ctggggcagatgagaacagc ttcatgactg
360420480540551<400> 4
atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gacgcggccc atactcatca ggactttcag ccagtgctcc acctggtggc ELCtgaacacc 120
cccctgtctg gaggcatgcg tggtatccgt ggagcagatt tccagtgctt ccagcaagcc 180
cgagccgtgg ggctgtcggg caccttccgg gctttcctgt cctctaggct gcaggatctc 240
tsttagcatcg tgcgccgtgc tgaccggggg tctgtgccca tcgtcaacct gsaggacgag 300
gtgctatctc ccagctggga ctccctgtt仁 tctggctccc agggtcaagt gcaacccggg 360
gcccgcatct tttcttttga cggcagagat gtcctgagac acccagcctg gccgcagaag 420
agcgtstggc acggctcgga ccccagtggg cggaggctga tggagagtta ctgtgagaca 480
tggcgaactg aaactactgg ggctscaggt caggcctcct ccctgctgtc aggcaggctc 540
ctggaacaga aagctgcgag ctgccacaac agctetcatcg tcctgtgcat tgagaatagc 600
ttcatgacct ctttctccaa atag 624
<210> 5
<211> 8 <212> PRT <213>人
<400> 5
Ala Pro Gin Gin Glu Ala Leu Ala
<210> 6
<211> <212> <213>
^權(quán)> 3
MetGluThrAspThrLeuLeuLeuTrpValLeuLeLeuTrpValPro
151015
GlySerThrGly 20AspAlaAlaHisThr 25HisGinAspPheGin 30ProVal
LeuHisL eu 35ValAlalieuAsnThr 40ProIjeuSerGlyGly 45MetArgGly
工leArg 50GlyAlaAspPheGin 55CysPheGinGinAla 60AlaValGly
LeuSerGlyThrPhe'AxgAlaPheIjeuSerSearArgLeuGinAspLeu
65707580
TyrSer工leVal85ArgAlaAspArgGly 90SerValPro工leVal 95Asn
LeuLysAspGlu 100ValSerProSer 105TrpAspSerL euPhe 110SerGly
SerGinGly 115GinLeuGinProGly 120AlaArg工lePheSer 125PheAspGly
ArgAsp 130ValLeu■ArgHisPro 135AlaTrpProGinLys 140SerValTrpHis
GlySerAspProSerGlyArgArgL euMetGluSerTyrCysGluThr
145150155160
TrpArgThrGluThrGlyAlaThrGly 170GinAlaSerSertteu 175Leu
SerGlyArgLeu 180LeuGluGinLysAla 185AlaSerCysHisAsn 190SerTyr
lieValCyslieGluAsnSerPheMetThrSerPheSerLys
195 200 205
<210> <211> <212> <213>
T鼠
R卜
4 A鼠
6 Q -::7<211> 38 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> PCR弓|物 <400> 6
actggtgacg cggcccatac tcatcaggac tttcagcc 38
<210> 7 <211> 32 <212> DMA <213>人工序列
《220>
<223> PCR引物 <400> 7
aagggctatc gatctagctg gcagaggcct at
<210> 8 <211> 20 <212> DN"A <213>人工序列
32
<220>
<223> PCR弓|物 <鋼> 8
cactgcttac tggcttatcg 20
<210> 9 <211> 29 <212> DNA <213>人工序列
<220>
《223> PCR弓|物 <秦> 9
ctgatgsgta tgggccgcgt caccagtgg 29
<210> 10 <211> 32 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> PCR引物 <400> 10
aagggctatc gatctagctg gcagaggcct at 32
<210> 11 <211> 35 <212> DNA <213>人工序列
<220><223> PCR弓|物 <權(quán)> 11
gatctctaga ccaccatgca tactcatcag gactt
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>12
actggagaaa gaggtttatc tagctactag
<210> 13 <211> 18 <212> PRT <2"> .腺病毒
Met工le Leu Gly Leu Leu Ala Leu Ala Ala Val Cys Ser 5 10 15
<4O0> 13 Met Arg Tyr 1
Ala Ala
<210> 14 <211> 96 <212> DNA
<213>人工序列 <220>
<223> PCR 弓|物 <400> 14
gatctctaga ccaccatgag gtacatgatt ttaggcttgc tcgcccttgc ggcagtctgc agcgcggccc atactcatac tcatcaggac tttcag
<210> 15
<211> 29
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> PCR弓l物 <400> 15
atcgatcata ctcatcagga ctttcagcc
<210> 16 <211> 29 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> PCR弓|物 <400> 16
gcggccgcct atttggagaa agaggtcat <210> 17<211> 23 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> PCR弓|物 <400> 17
tttttttttc agtgtaaaag gtc
。10> 18 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> PCR弓|物 <400> 18
cagatgacat cctggccag
<210>19
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>19
ctstacaggei sagtatggcgL gc
<210> 20 <211> 118 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> PCR弓|物 <400> 20
gccaagcttc catgagggcc tggatcttct ttc匕cctttg cctggccggg agggctctgg cagcccctca gcaagaagcg ctcgctcaca gccaccgcga cttccagccg gtgctcca
<210> 21 <211> 123 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> PCR弓|物
<400> 21
ccaggtggag caccggctgg aagtcgcggt ggctgtgagc gagcgcttct tgctgagggg ctgccagagc cctcccggcc aggcaaagga gaaagaagat ccaggccctc atggaagctt
ggc
權(quán)利要求
1.作為在適宜宿主中表達(dá)內(nèi)皮抑制素的表達(dá)載體一部分的內(nèi)皮抑制素編碼核酸在制備用于抑制視網(wǎng)膜血管滲透性以治療視網(wǎng)膜疾病的藥物中的用途。
2. 權(quán)利要求l的用途，其中所述內(nèi)皮抑制素包含SEQ ID N0:1。
3. 權(quán)利要求1的用途，其中所述視網(wǎng)膜疾病是視網(wǎng)膜脫離或視網(wǎng) 膜水腫。
4. 權(quán)利要求1的用途，其中在眼組織中引起內(nèi)皮抑制素量提高。
5. 權(quán)利要求4的用途，其中所述提高是通過向個(gè)體施用有效量 的含有內(nèi)皮抑制素編碼核酸的病毒載體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
6. 權(quán)利要求5的用途，其中該病毒載體選自腺病毒、腺伴隨病 毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、和'艮病毒。
7. 權(quán)利要求4的用途，其中所述提高是通過向個(gè)體內(nèi)植入至少 一個(gè)微嚢來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中該微嚢含有包含所述內(nèi)皮抑制素編碼核酸的 細(xì)胞，而且所述細(xì)胞分泌內(nèi)皮抑制素。
8. 權(quán)利要求7的用途，所述細(xì)胞是自體的。
9. 權(quán)利要求7的用途，其中該微嚢含有藻酸鹽。
10. 權(quán)利要求7的用途，其中該微囊含有多聚L-賴氨酸。
11. 權(quán)利要求l的用途，其中所述藥物包含含有內(nèi)皮抑制素編碼 核酸的細(xì)胞。
12. 權(quán)利要求5的用途，其中所述載體以約108噬斑形成單位至 約IO"噬斑形成單位的量施用。
13. 權(quán)利要求l的用途，其中所述內(nèi)皮抑制素編碼核酸包含SEQ ID NO:2。
14. 權(quán)利要求5的用途，其中病毒栽體經(jīng)眼內(nèi)施用。
15. 根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中病毒載體經(jīng)視網(wǎng)膜下施用。
16. 根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中病毒載體經(jīng)玻璃體內(nèi)施用。
17. 根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中病毒栽體經(jīng)眼周施用。
18. 根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中病毒栽體為慢病毒載體。
19. 權(quán)利要求18的用途，其中慢病毒載體為牛免疫缺陷病毒載體。
20. 權(quán)利要求19的用途，其中牛免疫缺陷病毒載體經(jīng)眼內(nèi)施用。
21. 權(quán)利要求19的用途，其中牛免疫缺陷病毒載體經(jīng)視網(wǎng)膜下施用。
22. 權(quán)利要求19的用途，其中牛免疫缺陷病毒載體經(jīng)玻璃體內(nèi)施用。
23. 權(quán)利要求19的用途，其中牛免疫缺陷病毒載體經(jīng)眼周施用。
全文摘要
本發(fā)明涉及眼的基因治療。具體而言，提供了通過提高患有VEGF-誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜脫離或視網(wǎng)膜水腫的個(gè)體的眼組織中體內(nèi)內(nèi)皮抑制素蛋白濃度至抑制視網(wǎng)膜脫離或視網(wǎng)膜水腫有效量來(lái)治療VEGF-誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜脫離或視網(wǎng)膜水腫的用途。
文檔編號(hào)A61K38/39GK101637611SQ20091015052
公開日2010年2月3日 申請(qǐng)日期2003年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月28日
發(fā)明者M·卡萊克, P·A·坎普契亞羅 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司