專利名稱：：抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的方法及其在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的方法及其應(yīng)用，尤其是涉及利用鉑類配合物抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的方法及其在制藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蛋白質(zhì)內(nèi)含子(Intein)是1990年4皮發(fā)現(xiàn)的一類酶，生物三大系統(tǒng)(真核，真細(xì)菌，古細(xì)菌)中都存在內(nèi)含子。且真核生物的細(xì)胞核、細(xì)胞器中均有分布，說明內(nèi)含子分布的廣泛性。目前Intein的蛋白質(zhì)剪接功能已被廣泛應(yīng)用于蛋白工程中。研究表明，Intein的生物活性同細(xì)菌導(dǎo)致的結(jié)核病(結(jié)核桿菌)、麻風(fēng)病(麻風(fēng)桿菌)、以及鳥分枝桿菌、蟾分枝桿菌、新型隱球菌等細(xì)菌導(dǎo)致的感染，和煙曲霉菌、構(gòu)巢曲霉等真菌導(dǎo)致的哮喘或感染疾病相關(guān)。結(jié)核病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，由于其傳染性較高，在人口密集的城鄉(xiāng)社區(qū)易于傳播。目前已有十多種用于結(jié)核病化療的藥物以及它們的衍生物，然而，由于越來越多的結(jié)核菌產(chǎn)生了抗藥性，使得這些藥物的使用效果受到了極大的影響。因而，結(jié)核病例在幾十年的下降之后，從上世紀(jì)九十年代起又呈上升趨勢(shì)。在傳統(tǒng)抗結(jié)核藥物的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)難以實(shí)現(xiàn)治療期的突破，同時(shí)容易出現(xiàn)交叉耐藥性。由此，研制抗病機(jī)理不同的新型藥物顯得非常必要，它將有可能在耐藥性結(jié)核病的攻克中起到關(guān)鍵的作用。與許多其它細(xì)菌一樣，結(jié)核病菌需要RecA和DnaB酶作用于DNA的修復(fù)和復(fù)制。但與其它細(xì)菌不同的是，結(jié)核病菌首先合成的RecA和DnaB是非活性的前體蛋白，必須通過Intein的蛋白剪接作用將其轉(zhuǎn)化為成熟的、具有功能的蛋白質(zhì)。在發(fā)現(xiàn)Intein是結(jié)核病菌所必需的酶之后，人們建議將Intein抑制劑作為新一類的抗結(jié)核藥物開發(fā)研究。('國(guó)外醫(yī)學(xué)分冊(cè)，2005,289-292)由于作用機(jī)理的不同，Intein抑制劑與現(xiàn)有的化療藥物將不會(huì)產(chǎn)生交叉耐藥性。目前有關(guān)Intein抑制劑作為抗結(jié)核藥物的研究工作剛起步。美國(guó)專利US2006/0217381Al對(duì)大量有機(jī)化合物進(jìn)行篩選，得到了一系列對(duì)蛋白剪接具有抑制作用的有機(jī)化合物。但是，金屬配合物的相關(guān)研究尚未有報(bào)道，以Intein作為靶點(diǎn)的藥物尚未出現(xiàn)。鉑類配合物已經(jīng)被成功地應(yīng)用于癌癥的化療中，表明這一類化合物具有藥用的可行性。有研究表明一些鉑類配合物可以抑制肽的聚集，從而可能在老年癡呆癥的治療中具有潛在的作用。這一發(fā)現(xiàn)表明鈾類配合物的藥用并不僅僅局限于抗癌作用。關(guān)于鉑類化合物對(duì)Intein的抑制作用尚無報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種利用柏類配合物抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的方法，該方法具有抑制濃度低、應(yīng)用廣泛、不易產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的另一目的在于提供這種鉑類配合物在制藥中的應(yīng)用，特別是在制備治療結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。為了解決上述至少一個(gè)技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的方法，包括下述步驟提供鉑類配合物；將該鉑類配合物作用于含有蛋白質(zhì)內(nèi)含子的微生物，從而直接抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子的活性。鉑類配合物通過直接抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子的活性，從而抑制所述微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的剪接作用，進(jìn)而抑制相應(yīng)蛋白質(zhì)的成熟和功能的發(fā)揮。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述含有蛋白質(zhì)內(nèi)含子的微生物包括結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌、鳥分枝桿菌、蟾分枝桿菌、新型隱球菌、煙曲霉菌、構(gòu)巢曲霉等。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述鉑類配合物為四配位，且其中的Pt為二價(jià)金屬，其中至少有兩個(gè)配位原子為氮原子，所述鉑類配合物結(jié)構(gòu)式可以為L(zhǎng)\,m，,,,pt\Am2，其中，Am,、Am2是氨或胺衍生物，L和L'為以氧或氯配4立的配體分子，以上結(jié)構(gòu)式中Aml、Am2可以是不同的分子，或?yàn)橐粋€(gè)雙齒配體中的不同配位基團(tuán)；L和L'也可以是不同的分子，或?yàn)橐粋€(gè)雙齒配體中的不同配位基團(tuán)?；蛘撸鲢K類配合物的結(jié)構(gòu)式還可以為Am3Am2，其中，Am,、Am2、Am3是氨或胺衍生物，L為以氧或氯配位的配體分子，以上結(jié)構(gòu)式中，Am,、Am2、Am3可以是不同的分子，或者可以為同一個(gè)雙齒配體中的不同基團(tuán)。沖艮據(jù)本發(fā)明的一方面，所述鉑類配合物為四配位的平面四邊形結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述胺衍生物包括具有環(huán)烷基胺類化合物和含氮的雜環(huán)化合物。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的方法，其中，所述鉑類配合物包括順式-二氯二氨合鉑、二氨環(huán)丁烷二羥酸鉑、氯化一氯'二氨"米唑合鉑、環(huán)己二胺.草酸合鉑、二氯.鄰菲咯啉合鉑、順式一氯.二氨'吡啶合鉑、順式一氯-二氨.3-甲醇基吡啶合鉑。通過鉑類金屬配合物抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性，從而抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子的蛋白剪接功能，使得微生物不能得到DNA復(fù)制和修復(fù)所必需的酶，從而抑制微生物的生長(zhǎng)。上述鉑類配合物對(duì)具有'蛋白質(zhì)內(nèi)含子，的微生物、特別是對(duì)結(jié)核桿菌具有抑制作用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，具有應(yīng)用價(jià)值的柏類配合物抑制微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)內(nèi)含子的ICs。小于100pM。如果ICso值太高，則基本沒有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了上述的鉑類配合物在制備藥物中的應(yīng)用，所述鉑類配合物可與恰當(dāng)?shù)妮d體或賦形劑相結(jié)合，制備成為治療與蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性相關(guān)疾病的藥物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，上述應(yīng)用為所述鉑類配合物在制備治療結(jié)核病的藥物中的應(yīng)用。雖然本發(fā)明的下述實(shí)施例主要是針對(duì)在結(jié)核桿菌的蛋白質(zhì)內(nèi)含子進(jìn)行的，但是由于各種蛋白質(zhì)內(nèi)含子具有非常保守的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)序列，這些抑制劑對(duì)其它種類的蛋白質(zhì)內(nèi)含子應(yīng)有相似的作用。因而本發(fā)明所提供的方法，可以應(yīng)用于含有蛋白質(zhì)內(nèi)含子的其它致病菌，如麻風(fēng)桿菌、鳥分枝桿菌、蟾分枝桿菌、新型隱球菌、煙曲霉菌、構(gòu)巢曲霉等。本發(fā)明提出了鉑類配合物在抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性方面的作用和它們?cè)谥扑幹械男掠猛?，具有以下突出?yōu)點(diǎn)(1)化合物的作用靶標(biāo)為蛋白質(zhì)內(nèi)含子，而不是發(fā)揮功能的酶，因而，菌抹的變異以及相應(yīng)蛋白質(zhì)的突變不會(huì)干擾該類化合物的作用；(2)目前，鉑類化合物已被作為抗癌藥物而成功應(yīng)用，并積累了大量臨床使用的數(shù)據(jù)，可以大大筒化某些化合物的臨床試驗(yàn)工作。(3)針對(duì)結(jié)核桿菌交叉抗藥性的問題，鉑類配合物以蛋白質(zhì)內(nèi)含子為靶標(biāo)，通過抑制蛋白剪接作用，阻礙微生物產(chǎn)生依賴于蛋白剪接而得到的蛋白質(zhì)，從而達(dá)到抑制微生物生長(zhǎng)的目的。這一方法與目前所有的抗結(jié)核藥物的作用機(jī)理均不同，因而不會(huì)有交叉抗藥性。本發(fā)明附加的方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從下面結(jié)合附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖1為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例之一，順式-二氯二氨合鉑對(duì)結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的抑制作用。具體實(shí)施例方式下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1通過大腸桿菌來表達(dá)結(jié)核桿菌中的RecAIntein與綠色焚光蛋白GFP的融合蛋白。由于RecAIntein的插入，綠色熒光蛋白GFP的發(fā)光作用被完全消除。如果RecAIntein能夠發(fā)揮其蛋白剪接作用、并將GFP蛋白兩端連接，熒光蛋白的發(fā)光被恢復(fù)。蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性抑制劑的存在將會(huì)抑制熒光的產(chǎn)生。因而可以利用熒光強(qiáng)度的變化來檢測(cè)蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性抑制劑的效率。我們采用復(fù)合緩沖液(8M尿素，0.5M氯化鈉，20mM磷酸鈉，pH=7.5)將融合蛋白從包涵體中溶解，然后通過金屬親和柱吸附融合蛋白并將其它雜蛋白洗脫除去。采用含0.5M氯化鈉的磷酸緩沖液進(jìn)行逐級(jí)梯度洗脫，待尿素完全洗脫后，用復(fù)合復(fù)性緩沖液(0.5M氯化鈉，0.5M精氨酸，100mM咪唑，20mM磷酸鈉，pH=7.0)將融合蛋白從柱上洗脫。然后，向復(fù)性蛋白中加入不同濃度的鉑類配合物順式-二氯二氨合鉑([cis-Pt(NH3)2Cl2])，其結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>通過5mMEDTA和2mMTCEP誘導(dǎo)蛋白剪接作用，25。C反應(yīng)溫育18小時(shí)后，450600nm檢測(cè)焚光，激發(fā)波長(zhǎng)為395nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。同時(shí)，利用純GFP綠色熒光蛋白檢測(cè)抑制劑對(duì)熒光的影響作為對(duì)照，證實(shí)順式-二氯二氨合鉑對(duì)GFP的熒光不具有淬滅作用。檢驗(yàn)結(jié)果見圖1。由此證明順式-二氯二氨合鉑對(duì)結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性具有明顯的抑制作用，其ICso約為2.6pM。實(shí)施例2具體實(shí)驗(yàn)方法和原理同實(shí)施例l,檢測(cè)出鉑類配合物二氨環(huán)丁烷二羥酸鉑的抑制作用，其ICso約為30pM。二氨環(huán)丁烷二羥酸鉑的結(jié)構(gòu)式為實(shí)施例3具體實(shí)驗(yàn)方法和原理同實(shí)施例l，檢測(cè)出鉑類配合物氯化一氯.二氨'咪唑合鉑([cis-Pt(NH3)2(im)Cl]Cl)的抑制作用，其IC5Q約為77pM。氯化一氯-二氨，咪唑合鉑的結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>N實(shí)施例4具體實(shí)驗(yàn)方法和原理同實(shí)施例1，檢測(cè)出鉑類配合物環(huán)己二胺'草酸合鉑的抑制作用，其IC5。約為23(aM。環(huán)己二胺.草酸合鉑的結(jié)構(gòu)式為。、、、、n"^H實(shí)施例5具體實(shí)驗(yàn)方法和原理同實(shí)施例1,檢測(cè)出鉑類配合物二氯，鄰菲咯啉合鉑([Pt(phen)Cl2])的抑制作用，其ICso約為10pM。二氯.鄰菲咯啉合鉑的結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>、N實(shí)施例6通過基因突變的大腸桿菌檢驗(yàn)鉑類配合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)Intein活性的影響。乙酰乳酸合成酶是植物和細(xì)菌生長(zhǎng)所依賴的酶，在所突變的菌林中，不具有乙酰乳酸合成酶活性。因而，細(xì)菌的生長(zhǎng)將依賴于外來的質(zhì)粒DNA所表達(dá)的乙酰乳酸合成酶。構(gòu)建的乙酰乳酸合成酶的質(zhì)粒DNA所表達(dá)的蛋白質(zhì)是由Intein序列的插入而失去活性，這樣乙酰乳酸合成酶的活性只有在Intein發(fā)生蛋白剪接時(shí)才能出現(xiàn)，因而細(xì)菌的生長(zhǎng)將依賴于Intein的蛋白剪接所產(chǎn)生的乙酰乳酸合成酶。這一體系提供了通過細(xì)菌生長(zhǎng)檢驗(yàn)Intein抑制劑在胞內(nèi)作用效率的方法。在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)上述大腸桿菌的體系中加入不同濃度的順式-二氯二氨合賴([cis-Pt(NH3)2Cl2])，30°C，250轉(zhuǎn)每分鐘搖床上培養(yǎng)24小時(shí)后,檢測(cè)600納米處培養(yǎng)液的吸光度獲得細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)杲見表1。表1不同濃度的順式-二氯二氨合鉑對(duì)基因突變大腸桿菌生長(zhǎng)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由此可見順式-二氯二氨合鉑對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白剪接具有明顯的抑制作用，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，其ICm)為18(^M。實(shí)施例7具體實(shí)驗(yàn)方法和原理同實(shí)施例6,檢測(cè)出鉑類配合物二氯'鄰菲咯啉合鉑([Pt(phen)Cl2〗)的抑制作用，其ICs。約為50[xM。實(shí)施例8測(cè)試順式-二氯二氨合鉑對(duì)結(jié)核桿菌生長(zhǎng)的抑制作用。在4mL培養(yǎng)液中接入從斜面16D培養(yǎng)物上直接刮取一環(huán)結(jié)核桿菌菌種，用玻璃J朱充分震蕩混勻，在4ml培養(yǎng)液中加入體積比2%的菌種，同時(shí)加入不同濃度的順式-二氯二氨合鉑。37°C，250轉(zhuǎn)每分鐘搖床上溫育培養(yǎng)14天，測(cè)試培養(yǎng)液在600納米處的吸光度以獲得結(jié)核菌的生長(zhǎng)情況。結(jié)杲表明，其ICs。約為15pM，在40pM時(shí)結(jié)核菌的生長(zhǎng)完全被抑制。表2不同濃度的順式-二氯二氨合鉑對(duì)結(jié)核桿菌生長(zhǎng)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。權(quán)利要求1、一種抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的方法，包括下述步驟提供鉑類配合物；將該鉑類配合物作用于含有蛋白質(zhì)內(nèi)含子的微生物，從而直接抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子的活性。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的方法，其中，所述含有蛋白質(zhì)內(nèi)含子的微生物包括結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌、鳥分枝桿菌、蟾分枝桿菌、新型隱球菌、煙曲霉菌、構(gòu)巢曲霉。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的方法，其中，所述鉑類配合物為四配位，且其中的Pt為二價(jià)金屬，至少有兩個(gè)配位原子為氮原子，所述鉑類配合物結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>，其中，Am,、Am2、Am3是氨或胺衍生物，L和L'為以氧或氯配位的配體分子。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的方法，其中，所述鉑類配合物為四gew立的平面四邊形結(jié)構(gòu)。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的方法，其中，所述胺衍生物包括具有環(huán)烷基胺類化合物和含氮的雜環(huán)化合物。6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的方法，其中，所述Am,、Am2、Am3是不同的分子，或者是一個(gè)雙齒配體中的不同配位基團(tuán)。7、根據(jù)權(quán)利要求3所述的抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的方法，其中，所述L和L'是不同的分子，或者是一個(gè)雙齒配體中的不同配位基團(tuán)。8、根據(jù)權(quán)利要求3-8所述的抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的方法，其中，所述鉑類配合物包括順式-二氯二氨合鉑、二氨環(huán)丁烷二羥酸鉑、氯化一氯'二氨-咪唑合鉑、環(huán)己二胺.草酸合鉑、二氯.鄰菲咯啉合鉑、順式一氯.二氨.吡啶合鉑、順式一氯.二氨'3-甲醇基吡咬合鉑。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的方法，其中，所述鉑類配合物的IC5。小于100pM。10、鉑類配合物在制備藥物中的應(yīng)用，所述柏類配合物可與載體或賦形劑相結(jié)合，制備成為治療與蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性相關(guān)疾病的藥物。11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的鉑類配合物在制備藥物中的應(yīng)用，所述應(yīng)用為所述鉑類配合物在制備治療結(jié)核病的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了一種抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性的方法，其特征在于，將鉑類配合物作用于含有蛋白質(zhì)內(nèi)含子的微生物上，通過直接抑制蛋白質(zhì)內(nèi)含子的活性，從而抑制所述微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)剪接作用，進(jìn)而抑制相應(yīng)蛋白質(zhì)的成熟和功能。該方法具有抑制劑使用濃度低、應(yīng)用廣泛、不易產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)點(diǎn)，在眾多與微生物相關(guān)的疾病中，特別是抗結(jié)核桿菌方面具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明還提供了鉑類配合物在制備治療與蛋白質(zhì)內(nèi)含子活性相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用，特別是在制備治療結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。文檔編號(hào)A61K33/24GK101618046SQ20091015064公開日2010年1月6日申請(qǐng)日期2009年6月23日優(yōu)先權(quán)日2009年6月23日發(fā)明者劉揚(yáng)中,張立云,羅昭鋒申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)