專利名稱：：去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽及其合成方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽及其合成方法與用途，屬于斑蝥素衍生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：斑蝥素(cantharidin)是我國民間中藥，是治療惡性腫瘤藥物的有效成份?，F(xiàn)代研究證明，其對原發(fā)性肝癌有一定療效，而且有升高白細胞，不抑制免疫系統(tǒng)等優(yōu)點，因此，具有很高的藥用研究價值，引起人們的廣泛關(guān)注。但斑蝥素的毒性較大，合成很復雜，近來研究表明，去甲斑蝥素(norcantharidin)中少了2，3位的兩個甲基，去甲斑蝥素不僅保持了較強的抗腫瘤活性和獨特的升高白細胞作用，而且毒性大大降低，基本上消除了斑蝥素對泌尿系統(tǒng)毒剌激副作用。之后，人們進行了一系列的結(jié)構(gòu)改造的探索。截止本發(fā)明作出之前，對斑蝥素衍生物結(jié)構(gòu)改造工作中，我們還沒有看到有關(guān)在C5或C6上進行環(huán)加成的改造，一般都只是在C5或C6上引入取代基，藥理測試結(jié)果也都不夠理想?？茖W家研究發(fā)現(xiàn)，異噁唑、吡唑、1，2，3-三唑類雜環(huán)衍生物也具有強烈的生理和藥理活性。正是在這啟示之下，鑒于不同活性雜環(huán)在同一分子中聚集能明顯改善或增強化合物的生物活性這一特征，以及生物電子等排原理，我們設(shè)計合成在去甲斑蝥素取代芳胺結(jié)構(gòu)中。5和Ce雙鍵上進行l(wèi)，3[3+2]偶極環(huán)加成引入五元雜環(huán)異噁唑、吡唑、l，2，3-三氮唑結(jié)構(gòu)，得到一系列含N-取代去甲去氫斑蝥酰亞胺的異噁唑、吡唑、1，2，3-三氮唑衍生物，以期實現(xiàn)生物活性的完美組合，制得了純品，進行了結(jié)構(gòu)分析，分別對六種腫瘤細胞株進行了藥理活性測試，發(fā)現(xiàn)了一些未見文獻報道的具有較強抗腫瘤活性和選擇性的新化合物，為抗腫瘤抑癌類藥物提供潛在的選擇。本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)，上述三個系列化合物的水溶性都不夠理想，吡唑系列尚能溶于乙醇，而異噁唑和1，2，3-三氮唑雜環(huán)系列的衍生物在測藥理活性時，都必須以匿SO為溶劑，高濃度情況下會有析出現(xiàn)象，嚴重了影響了其潛在的應用可能性。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明通過將磷酸基基團引入去甲斑蝥素衍生物的結(jié)構(gòu)中，合成一種去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽，經(jīng)測試，其水溶性大大提高，從而達到本發(fā)明之目的。本發(fā)明的另一目的在于提供該去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽的合成方法。本發(fā)明還有一目的在于將該去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽用于合成抗腫瘤的藥物上。為達到上述目的，本發(fā)明采取了如下的技術(shù)方案—種去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽，磷酸基基團引入連接有異噁唑、吡唑或1，2，3-三氮唑雜環(huán)的去甲斑蝥素衍生物結(jié)構(gòu)中，結(jié)構(gòu)通式如說明書附圖l所示。其中系列一X=0，Y=N，即為含異噁唑環(huán)的去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽為無；R2為C6H4C1，C6H2(0CH3)3，C6H40CH3或C6H4S0CH3。系列二X=N，Y=C，即為含吡唑環(huán)的去甲斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽為C6H5;R2為C6H5，C6H4C1或(^3(:12。系列三X=N，Y=N，即為含1，2，3-三氮唑雜環(huán)的去甲斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽為CH2C00Et，C6H5或C6H4N02;R2為無。本發(fā)明的合成方法分四步進行(1)去甲去氫斑蝥素的合成。將順丁烯二酸酐研細，加入一定量乙醚，室溫條件下攪拌至溶解，滴入呋喃，室溫攪拌24-48小時。呋喃與順丁烯二酸酐發(fā)生Diels-Alder反應，制得去甲去氫斑蝥素。(2)N-(4'-羥基苯)-7_氧雜雙環(huán)[2.2.1]_庚烯_2，3_酰亞胺的合成。方法一(DCC脫水)將去甲去氫斑蝥素溶于一定量乙腈，加入4-氨基苯酚，室溫攪拌0.5-1.5小時，生成沉淀。抽濾，濾餅用乙腈和乙醇各洗2次，真空干燥后溶于干燥DMF中，冷卻至0t:。加入二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)，很快出現(xiàn)渾濁冰水浴條件下攪拌5小時；冷凍，濾去不溶物，濾液倒入冰水中，有白色沉淀析出。過濾，濾餅用冰水洗2次，甲醇重結(jié)晶，真空干燥。方法二(一鍋法)將去甲去氫斑蝥素溶于一定量丙酮溶劑中，在攪拌下滴加4_氨基苯酚_丙酮溶液。反應1小時后加入醋酸錳、三乙胺和醋酐，升溫溶解。在50-60°C下反應2-9小時。濾去不溶物，將濾液冷凍，倒入冰水混合物中，析出固體，過濾，濾餅用冰水洗滌，甲醇重結(jié)晶，真空干燥。(3)Cs和Ce雙鍵上進行1，3[3+2]偶極環(huán)加成，引入五元雜環(huán)異噁唑、吡唑或1，2，3-三氮唑結(jié)構(gòu)，得到一系列含酚羥基的N-取代去甲去氫斑蝥酰亞胺的異噁唑、吡唑或1，2，3-三氮唑衍生物。1，3-偶極環(huán)加成反應，其中間步驟產(chǎn)生偶極子。偶極子的生成有兩種方法。方法一在無水的乙醚溶液中加入肟(或腙)和干燥的三乙胺，得到1，3-偶極子氧化腈。方法二月虧(或腙)與氯胺T在無水乙醇溶液中回流，得到1，3-偶極子氧化腈。此方法簡潔，產(chǎn)率較之常規(guī)方法并沒有降低。此外，在氮氣保護下，3種疊氮化合物與去甲去氫衍生物直接就可以進行[3+2]環(huán)加成反應。(4)將含酚羥基的N-取代去甲去氫斑蝥酰亞胺的異噁唑、吡唑或1，2，3-三氮唑衍生物溶于干燥的二氯甲烷，加入新蒸三氯氧磷，攪拌情況下滴加入新蒸三乙胺，室溫攪拌2小時，TLC跟蹤確定反應完全，有機層用水洗三次后減壓旋蒸后得到油狀物，加入NaOH15%水溶液，保持^值為10，保溫4(TC攪拌4小時后室溫攪拌過夜，減壓下旋蒸除去水層，剩余物用甲醇和丙酮重結(jié)晶，得目標終產(chǎn)物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明設(shè)計了一種含磷酸基基團的新型斑蝥素衍生物，成功將磷酸基基團引入連接有異噁唑、吡唑或1，2，3-三氮唑雜環(huán)的去甲基斑蝥素衍生物結(jié)構(gòu)中，形成去甲基斑蝥素衍生物磷酸鹽。它提高或保持原去甲基斑蝥素衍生物的抗癌活性，顯著提高水溶性，具有廣泛的應用前景。圖1為本發(fā)明的去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽的結(jié)構(gòu)通式；圖2為去甲去氫斑蝥素的合成方程式；圖3為N-(4'-羥基苯)-7-氧雜雙環(huán)[2.2.1]_庚烯_2，3_酰亞胺的合成方程式；圖4為外，外-4，8-氧雜_3a，4，4a，7a，8，8a_六氫_3_(對氯苯基)_吡咯并[3，4-f]-l，2-苯異噁唑(化合物1-1)的合成方程式；圖5為外，外-4，8-氧雜_3a，4，4a，7a，8，8a_六氫_3_(對氯苯基)_吡咯并[3，4-f]-l，2-苯異噁唑-6-苯基-4'-o-磷酸氫二鈉(化合物1-2)的合成方程式；圖6為吡唑類去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽的合成方法；圖7為1，2，3-三氮唑類去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽的合成方法。具體實施例方式下面實施例進一步說明本發(fā)明，且僅用于說明本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。合成實施例夕卜，外-4，8-氧雜_3a，4，4a，7a，8，8a_六氫_3_(對氯苯基)_吡咯并[3，4_f]_1，2-苯異噁唑-6-苯基-4'-o-磷酸氫二鈉(化合物1-2)的合成。步驟1:去甲去氫斑蝥素(化合物a)的合成。反應式如說明書附圖2所示。在lOOmL的錐形瓶中，加入充分研磨細的20.OOg(O.20mol)順丁烯二酸酐至50mL乙醚中；待完全溶解后，加入14.OOg(O.21mol)呋喃；充分攪拌，室溫放置24-48小時后，減壓過濾，得白色結(jié)晶27.14g，產(chǎn)率83.12%，熔點118-119°C。備用。步驟2:N-(4'-羥基苯)-7-氧雜雙環(huán)[2.2.1]_庚烯_2，3_酰亞胺(化合物b)的合成。反應式如說明書附圖3所示。步驟2采用方法二。取步驟l中所制的化合物a3.20g(0.02mo1)溶于30mL丙酮；攪拌下將含有2.18g(0.02mol)4-氨基苯酚的丙酮溶液滴入去甲去氫斑蝥素反應瓶中，反應放熱并逐步有大量沉淀生成；室溫反應1小時后，一次加入0.2g醋酸錳，14mL三乙胺和120mL醋酐；升溫后，沉淀逐步溶解，在50-6(TC下反應2-9小時；溶液逐漸澄清，濾去不溶物，將濾液冰凍，倒入100mL冰水混合物中，有白色固體析出，過濾，冰水洗滌2次，甲醇重結(jié)晶，真空干燥。得產(chǎn)物4.42g，產(chǎn)率86%，熔點166-167。C。IR(KBr)v:3305(-0H);3063，3021(ArH);1772，1708(C=0);1624(C=C);1187(C-0-C);713(=C_H)cm—、丄H-NMR(DMS0_d6)S:7.49(dd，J=7.3Hz，2H，ArH)，7.21(d，J=7.3Hz，2H，ArH)，6.60(s，2H，C5_H，C6_H)，5.24(s，2H，C「H，C4-H)，3.09(s，2H，C2-H，C3_H)。步驟3:外，外-4，8-氧雜-3a，4，4a，7a，8，8a-六氫-3-(對氯苯基)-吡咯并[3，4-f]-l，2-苯異噁唑(化合物1-1)的合成。反應式如說明書附圖4所示，步驟3采用方法二。取步驟2中制得的化合物b2.60g(10mmo1)和2.lOg(llmmol)對氯苯甲醛肟溶6于200mL乙醇，加入3.40g(12mmo1)氯胺T，加熱回流4_15小時，隨著反應進行出現(xiàn)沉淀越來越多，TLC跟蹤確定反應是否完全。抽濾，濾餅用水洗，丙酮重結(jié)晶，真空干燥。得白色固體3.80g，產(chǎn)率92%。熔點177-178。C。IRv(KBr，cm—1):3298(-0H)，30573021(ArH)，17861719(C=0)，1536(C=N)，1238(C-O-C)。步驟4:外，外-4，8-氧雜_3a，4，4a，7a，8，8a_六氫_3_(對氯苯基)_吡咯并[3，4-f]-1，2-苯異噁唑-6-苯基-4'-o-磷酸氫二鈉(化合物1-2)的合成。反應式如說明書附圖5所示。取步驟3中制得的化合物1-12.05g(5mmo1)，溶于15ml干燥的二氯甲烷；加入新蒸三氯氧磷2.30g(15mmo1);攪拌情況下滴入新蒸三乙胺(2mL)，室溫攪拌2小時，TLC跟蹤確定反應完全。有機層用水洗3次后減壓旋蒸后得到黃色油狀物，加入15%NaOH水溶液，保持ra值為10，保溫4(TC攪拌4小時后室溫攪拌過夜。減壓下旋蒸除去水層，剩余物用甲醇和丙酮重結(jié)晶，得黃色產(chǎn)物1.95g，產(chǎn)率73X。熔點66-67。C。IRv(KBr，cm—0:3402(磷酸基)，30563021(ArH)，17831721(C=0)，1535(C=N)，1239(C-0-C)。采用上訴類似方法合成下列有機物(表1):①外，外-4，8-氧雜-3a，4，4a，7a，8，8a_六氫_3_(3，4，5_三甲氧基取代苯基)-妣咯并[3，4-f]-l，2-苯異噁唑-6-苯基-4'-o-磷酸氫二鈉(2-2);②外，外-4，8-氧雜-3a，4，4a，7a，8，8a-六氫-3-(對甲氧基苯基)-吡咯并[3，4-f]-l，2-苯異噁唑-6-苯基-4'-o-磷酸氫二鈉(3-2);③外，外-4，8-氧雜_3a，4，4a，7a，8，8a_六氫_3_(對甲磺酰苯基)_妣咯并[3，4-f]-l，2-苯異噁唑-6-苯基-4'-o-磷酸氫二鈉(4-2);4，8_氧橋妣咯并[3，4-f]口引唑并_5，7_(1H，6H)-二酮，3a，4，4a，7a，8，8a_六氫-1-苯基-4，t磷酸氫二鈉-3-苯基-6-對羥苯基_(3aa，4b，4aa，7aa，8b，8aa)(5-2);⑤4，8-氧橋妣咯并[3，4-f]口引唑并_5，7_(1H，6H)-二酮，3a，4，4a，7a，8，8a_六氫-1-苯基-4't磷酸氫二鈉-3-(鄰氯取代苯基)-6-對苯基-(3aa，4b，4aa，7aa，8b，8aa)(6-2);4，8-氧橋妣咯并[3，4-f]口引唑并_5，7_(1H，6H)-二酮，3a，4，4a，7a，8，8a_六氫-1-苯基-3-(2，3-二氯取代苯基)-6-苯基-4，t磷酸氫二鈉_(3aa，4b，4aa，7aa，8b，8aa)(7-2);⑦4，8-氧橋妣咯并[3，4-f]苯并三唑_5，7_(lh，6h)-二酮，3a，4，4a，7a，8，8a_六氫-6-對羥苯基-4'-o-磷酸氫二鈉-(2-乙氧基-2-氧乙醛基)(8-2);⑧4，8-氧橋妣咯并[3，4-f]苯并三唑_5，7_(lh，6h)-二酮，3a，4，4a，7a，8，8a_六氫-6-苯基-4'-o-磷酸氫二鈉-1-芐基(9-2);⑨4，8-氧橋妣咯并[3，4-f]苯并三唑_5，7_(lh，6h)-二酮，3a，4，4a，7a，8，8a_六氫-6-苯基-4'-o-磷酸氫二鈉-1-對硝基取代節(jié)基(10-2)。表1:去甲斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽及其中間體的編號和結(jié)構(gòu)式<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>抗腫瘤活性測定1、腫瘤細胞離體培養(yǎng)腫瘤細胞用RPMI1640培養(yǎng)液打勻后種入50ml培養(yǎng)瓶中，7m1/瓶，加入10%新生牛血清，于37°C、5%C02細胞培養(yǎng)箱中孵育，待細胞密度長到7090%時傳代(貼壁細胞用Puck'sEDTA消化后傳代)，用于以后實驗所需。2、MTT法測定22個化合物對不同瘤株的體外抑制作用將化合物用匿S0溶解，稀釋，腫瘤細胞ECA109(腸癌細胞)、A549(肺癌細胞)、SMMC7721(肝癌細胞)、K562(白血病細胞)、MCF-7(乳腺癌細胞)在96孔板上種入4000個/200iiL/孔，每孔加入化合物2iiL，終濃度為12.0iiM，6.0iiM，3.0iiM，1.5iiM，共同于37°C、5%C02細胞培養(yǎng)箱中孵育72小時，以MS0(1%)為空白對照。72小時后，加入終濃度為0.25mg/mL的MTT，置于37°C、5%C02細胞培養(yǎng)箱中4小時，之后吸干溶劑，每孔加入1001DMSO，用酶聯(lián)免疫儀于570nm處測定吸光度(0D值)，所得數(shù)據(jù)用于計算IC5。值。3、不同濃度的化合物作用時間不同對細胞細胞Bel7402周期和凋亡的影響取指數(shù)生長期的人肝癌細胞Bel7402，用Puck'sEDTA液消化10min，離心(800lOOOrpm，5min)，棄去上清液，加入RPMI1640培養(yǎng)液打勻制成細胞懸液，計數(shù)后以4X105個/瓶種于5瓶50mL培養(yǎng)瓶中，7mL/瓶，24小時后加藥，終濃度為匿S00.1%(l瓶)，化合物(4瓶)。分別于24小時、48小時消化收集細胞，用D'Hanks溶液洗滌2次，之后用70%乙醇固定后，在流式細胞儀上檢測細胞周期。4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計用GWBASIC計算22個化合物對不同瘤株的IC5。值，結(jié)果見表2。表2:去甲斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽及其中間體活性測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求一種去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽，其結(jié)構(gòu)通式如式I所示式1中當X＝O，Y＝N；R1為無；R2為C6H4Cl、C6H2(OCH3)3、C6H4OCH3或C6H4SOCH3；或者當X＝N，Y＝C；R1為C6H5；R2為C6H5、C6H4Cl或C6H3Cl2；或者當X＝N，Y＝N；R1為CH2COOEt、C6H5或C6H4NO2；R2為無。F2009101542355C00011.tif2.—種如權(quán)利要求1所述去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽的合成方法，其特征在于包括如下步驟(1)、去甲去氫斑蝥素的合成；(2)、N-(4'-羥基苯)-7-氧雜雙環(huán)[2.2.1]-庚烯-2，3-酰亞胺的合成；(3)、C5和C6雙鍵上進行1，3偶極環(huán)加成，引入五元雜環(huán)異噁唑、吡唑或1，2，3-三氮唑結(jié)構(gòu)，得到一系列含酚羥基的N-取代去甲去氫斑蝥酰亞胺的異噁唑、吡唑或1，2，3-三氮P坐衍生物；(4)、將含酚羥基的N-取代去甲去氫斑蝥酰亞胺的異噁唑、吡唑或1，2，3-三氮唑衍生物溶于干燥的二氯甲烷，加入新蒸三氯氧磷，攪拌情況下滴加入新蒸三乙胺，室溫攪拌2小時，TLC跟蹤確定反應完全，有機層用水洗三次，減壓旋蒸后得到油狀物，加入Na0H15%水溶液，保持ra值為10，保溫4(TC攪拌4小時后室溫攪拌過夜，減壓下旋蒸除去水層，剩余物用甲醇和丙酮重結(jié)晶，得目標終產(chǎn)物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽的合成方法，其特征在于步驟(1)的去甲去氫斑蝥素的合成為將順丁烯二酸酐研細，加入乙醚，室溫條件下攪拌至溶解，滴入呋喃，室溫攪拌24-48小時；呋喃與順丁烯二酸酐發(fā)生Diels-Alder反應，制得去甲去氫斑蝥素。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽的合成方法，其特征在于步驟(2)中N-(4'-羥基苯)_7-氧雜雙環(huán)[2.2.1]-庚烯-2，3-酰亞胺的合成是將去甲去氫斑蝥素溶于乙腈，加入4-氨基苯酚，室溫攪拌0.5-1.5小時，生成沉淀；抽濾，濾餅用乙腈和乙醇各洗2次，真空干燥后溶于干燥DMF中，冷卻至0°C;加入二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)，很快出現(xiàn)渾濁，冰水浴條件下攪拌5小時；冷凍，濾去不溶物，濾液倒入冰水中，有白色沉淀析出；過濾，濾餅用冰水洗2次，甲醇重結(jié)晶，真空干燥。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽的合成方法，其特征在于步驟(2)中N-(4'-羥基苯)-7-氧雜雙環(huán)[2.2.1]-庚烯-2，3-酰亞胺的合成將去甲去氫斑蝥素溶于丙酮溶劑中，在攪拌下滴加4-氨基苯酚-丙酮溶液；反應1小時后加入醋酸錳、三乙胺和醋酐，升溫溶解。在50-6(TC下反應2-9小時；濾去不溶物，將濾液冷凍，倒入冰水混合物中，析出固體，過濾，濾餅用冰水洗滌，甲醇重結(jié)晶，真空干燥。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽的合成方法，其特征在于步驟(3)中的1，3-偶極環(huán)加成反應，其中間步驟產(chǎn)生偶極子；偶極子的生成是在無水的乙醚溶液中加入肟(或腙)和干燥的三乙胺，得到1，3-偶極子氧化腈。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽的合成方法，其特征在于步驟(3)中的1，3-偶極環(huán)加成反應，其中間步驟產(chǎn)生偶極子；偶極子的生成是肟或腙與氯胺T在無水乙醇溶液中回流，得到1，3-偶極子氧化腈。8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽的合成方法，其特征在于在氮氣保護下，三種疊氮化合物與去甲去氫斑蝥素衍生物直接進行[3+2]環(huán)加成反應。9.權(quán)利要求1所述的去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽在合成抗腫瘤的藥物上的應用。全文摘要本發(fā)明公開了去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽及其合成方法與用途，屬于斑蝥素衍生物
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。本發(fā)明設(shè)計了一種含磷酸基基團的新型斑蝥素衍生物，成功將磷酸基基團引入連接有異噁唑、吡唑或1，2，3-三氮唑雜環(huán)的去甲基斑蝥素衍生物結(jié)構(gòu)中，形成去甲基斑蝥素衍生物磷酸鹽。它提高或保持原去甲基斑蝥素衍生物的抗癌活性，顯著提高水溶性，具有廣泛的應用前景。此外，本發(fā)明還公開了此3個系列去甲基斑蝥素衍生物磷酸二鈉鹽的合成方法。文檔編號A61P35/00GK101717411SQ20091015423公開日2010年6月2日申請日期2009年11月19日優(yōu)先權(quán)日2009年11月19日發(fā)明者鄧莉平申請人:紹興文理學院