專(zhuān)利名稱(chēng)：：丹參注射液中的化合物及其在心血管疾病治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種從丹參或丹參注射液中提取的新的酚酸類(lèi)化合物，本發(fā)明還涉及這一新化合物的制備方法及其在制備治療心血管疾病藥物和丹參注射液質(zhì)量控制中的用途。
背景技術(shù)：
：丹參注射液是中藥材丹參經(jīng)過(guò)現(xiàn)代工藝提取加工而成，用于心腦血管疾病預(yù)防和治療，主要應(yīng)用于活血化瘀，通脈養(yǎng)心，冠心病胸悶和心絞痛，臨床應(yīng)用已有20余年，其中的活性成分主要為以丹參素、丹酚酸B為主的酚酸類(lèi)化合物，目前尚有大量有效成分未被發(fā)現(xiàn)。國(guó)內(nèi)已有66個(gè)廠(chǎng)家擁有丹參注射液的藥品批準(zhǔn)文號(hào)，制備方法均參照部頒標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-3766-98-2004，其含測(cè)指標(biāo)和鑒別指標(biāo)均只有原兒茶醛一種有效成分，顯然不能滿(mǎn)足提高中藥注射液治療標(biāo)準(zhǔn)的要求。
發(fā)明內(nèi)容為了全面提高丹參注射劑的安全性、有效性和質(zhì)量可控性，深入研究其活性物質(zhì)基礎(chǔ)，經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究，利用現(xiàn)代分離提取技術(shù)和結(jié)構(gòu)確定手段，在丹參制劑中發(fā)現(xiàn)了一種新的丹酚酸類(lèi)化合物，藥理研究表明化合物有很好的心肌保護(hù)活性和明顯的抗氧化活性。由于該新化合物與已發(fā)現(xiàn)的丹酚酸A、丹酚酸B等酚酸類(lèi)結(jié)構(gòu)相近，故將該化合物命名為丹酚酸M，其結(jié)構(gòu)式為式A所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式A丹酚酸M化學(xué)名稱(chēng)為3_(3，4_dihydroxyphenyl)_2_(3_(3_(3，4_dihydroxyphenyl)_2，7_dihydroxy_2，3_dihydrobenzofu:ran_4_yl)acryloyloxy)propanoicacid5(3-(3，4-二羥基苯基)-2-(3-(3_(3，4_二羥基苯基(-2，7_二羥基_2，3_二氫苯并呋喃-4_)丙烯酰氧基)_丙酸。丹酚酸M:淡黃色粉末，高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MS給出分子量為510.1053，分子式為C^H^OllUV吸收光譜Amax(MeOH)nm(loge):324(3.2)，290(3.16)，旋光[a]25D=8(MeOH，lmg/ml);紅外光譜IR(KBr)，Vmax/cm—1:3387，1696，1612，1518，1448，1265，1172，1072。ESI-MS顯示準(zhǔn)分子離子峰為m/z509[M-H]—，表明該化合物分子量為510，多級(jí)質(zhì)譜碎片離子峰主要有m/z311[M-H-198]—，表明該化合物含有(3，4_二羥基)乳酸(丹參素)結(jié)構(gòu)片段；核磁共振氫譜顯示共有10個(gè)不飽和質(zhì)子信號(hào)和5個(gè)飽和質(zhì)子信號(hào)，其中S7.53和S6.20(J=16.OHz)為一對(duì)雙鍵質(zhì)子信號(hào)。三個(gè)芳香質(zhì)子S6.45(bs)、S6.87(d，J=8.OHz)、S6.50(m，J=8.OHz)和另三個(gè)芳香質(zhì)子S6.70(bs)、S6.73(d，J=8.OHz)以及S6.49(dd，J=8.0，1.5Hz)分別屬于兩個(gè)ABX耦合系統(tǒng)，兩個(gè)芳香質(zhì)子信號(hào)S7.15和S6.82(J=8.OHz)屬于A(yíng)B偶合系統(tǒng)。信號(hào)S3.05(dd，J=14.5，4.OHz)、S2.94(dd，J=14.5，4.OHz)以及S5.09(dd，J=4.OHz)構(gòu)成OCHCH2片段。信號(hào)S4.38(bs)禾PS5.65(bs)構(gòu)成OCHCH片段，其中，信號(hào)S5.65對(duì)應(yīng)的碳信號(hào)為S108.3，推測(cè)該碳信號(hào)為半縮醛或縮醛。利用DMSO-de作為核磁共振溶劑，觀(guān)察到羥基質(zhì)子信號(hào)S7.47(bs)與該碳上質(zhì)子信號(hào)S5.65的力」HCOSY相關(guān)，證實(shí)了為半縮醛結(jié)構(gòu)。利用2D-NMRCHJHCOSY、HMQC、HMBC)，鑒定了該化合物的平面結(jié)構(gòu)，并歸屬了所有碳?xì)湫盘?hào)。查閱了國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)后確定該化合物為未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的新骨架化合物。氫譜和碳譜數(shù)據(jù)歸屬如下丹酚酸M氫譜和碳譜數(shù)據(jù)(CD3OD)，單位S:ppm<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明提供的該化合物的制備方法為丹參藥材加水煎煮，合并煎液，濾過(guò)，濾液減壓濃縮。乙醇沉淀，濾過(guò)，濾液回收乙醇，蒸餾水稀釋?zhuān)^(guò)制備液相分離、純化，冷凍干燥后得到淡黃色粉末，即為該化合物。制備液相分離條件流動(dòng)相由0.05%甲酸-水(A)和乙腈(B)組成，梯度洗脫程序?yàn)?28min，A-B(82:18，v/v);2860min，A-B(82:1865:35，v/v)，流速4mL/min，分離用半制備色譜柱為ZorbaxSB_C18(9.4mmX25cm，5ym)，保留時(shí)間tR=22.lmin。丹酚酸M也可以直接在根據(jù)部頒標(biāo)準(zhǔn)制備的丹參注射液中分離得到，分離條件可參考上述條件。ZORBAXStableBond(SB)反相HPLC系列色譜柱在低pH下具有超常穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。其獨(dú)特的單官能團(tuán)硅烷空間保護(hù)鍵合相在低pH下不被水解，還可以耐受很高的溫度，最高900C。其中的SB-Cw半制備柱(9.4mmX25cm)適用于低毫克級(jí)物質(zhì)的制備，根據(jù)待分離物質(zhì)的量，可是選擇合適的C18半制備型和制備型色譜柱。發(fā)明效果本發(fā)明提供了一種新的酚酸類(lèi)化合物丹酚酸M，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)是新的且具有心肌保護(hù)和抗氧化活性，因而具有進(jìn)一步研制開(kāi)發(fā)成有效的治療心血管疾病藥物的前景，且可以用于丹參注射液質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中。說(shuō)明書(shū)附圖丹參注射液的LC-MS指紋圖譜具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但不以此限制本發(fā)明。實(shí)施例1.丹酚酸M的制備方法以丹參藥材為原料取丹參1500g，加水8倍量煎煮三次，第一次2小時(shí)，第二、三次各1.5小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液減壓濃縮至750m1。加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量為75%，第二次使含醇量為85%，每次均冷藏放置后濾過(guò)，濾液回收乙醇，并濃縮至約250ml，加蒸餾水至400ml，混勻，靜置，濾過(guò)。使用半制備色譜柱為ZorbaxSB-C^(9.4mmX25cm，5i!m)分離、純化，冷凍干燥后得到淡黃色粉末，即獲得該化合物50.lmg。流動(dòng)相由0.05%甲酸-水(A)和乙腈(B)組成，梯度洗脫程序?yàn)?28min，A-B(82:18，v/v);2860min，A-B(82:1865:35，v/v)，流速4ml/min，分離用，保留時(shí)間tK=22.lmin。實(shí)施例2.丹酚酸M的制備方法以丹參藥材為原料取丹參1500g，加6倍量水煎煮三次，每次1.5小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液減壓濃縮至750ml。加乙醇沉淀二次，各使含醇量為75%，靜置后濾過(guò)，濾液回收乙醇，并濃縮至約250ml浸膏。浸膏蒸餾水稀釋?zhuān)o置，濾過(guò)。使用半制備色譜柱分離、純化，冷凍干燥后得到淡黃色粉末，即獲得該化合物48.Omg。半制備色譜柱分離、純化同實(shí)施例1。實(shí)施例3.丹酚酸M的制備方法以丹參藥材為原料取丹參1500g，加10倍量水煎煮三次，每次2.0小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液減壓濃縮至750ml。加乙醇沉淀二次，各使含醇量為85%，靜置后濾過(guò)，濾液回收乙醇，并濃縮至約250ml浸膏。浸膏蒸餾水稀釋?zhuān)o置，濾過(guò)。使用半制備色譜柱分離、純化，冷凍干燥后得到淡黃色粉末，即獲得該化合物44.lmg。半制備色譜柱分離、純化同實(shí)施例1。實(shí)施例4.丹酚酸M的制備方法以丹參藥材為原料取丹參1500g，加12倍量水煎煮二次，每次2.0小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液減壓濃縮至700ml。加乙醇沉淀二次，各使含醇量為85%，靜置后濾過(guò)，濾液回收乙醇，并濃縮至約250ml浸膏。浸膏蒸餾水稀釋?zhuān)o置，濾過(guò)。使用半制備色譜柱分離、純化，冷凍干燥后得到淡黃色粉末，即獲得該化合物37.Omg。半制備色譜柱分離、純化同實(shí)施例1。實(shí)施例5.丹酚酸M的制備方法以1200ml丹參注射液制劑為原料通過(guò)半制備ODS-HPLC分離、純化，獲得該化合物。分離條件同實(shí)施例1，即獲得該化合物50.lmg實(shí)施例6.丹酚酸M的制備方法以1200ml丹參注射液制劑為原料通過(guò)半制備ODS-HPLC分離、純化，獲得該化合物。使用半制備色譜柱為ZorbaxSB-C18(9.4mmX15cm，5ym)，流速2ml/min，其他分離條件同實(shí)施例l，僅獲得該化合物15.3mg。實(shí)施例7.丹酚酸M的制備方法以1200ml丹參注射液制劑為原料通過(guò)半制備ODS-HPLC分離、純化，獲得該化合物。使用半制備色譜柱為SB-C18(21.2mmX250mm，10iim)，流速10ml/min，流動(dòng)相為0.1%甲酸-水(A)和甲醇(B)，洗脫程序?yàn)?，55XB;45min，65XB;tK二24.lmin，僅獲得該化合物6.3mg。實(shí)施例5至7的丹參注射液由正大青春寶制藥有限公司提供，屬于按照部頒標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-3766-98-2004制備的上市產(chǎn)品。實(shí)施例8.活性測(cè)定MTT法體外培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞種于96孔板上。種板24h后，加入該化合物，給藥濃度為100、40、16、6.4、2.56、1.28uM。每個(gè)濃度設(shè)定三復(fù)孔，平行兩板，陽(yáng)性藥為100uM的維生素C。加藥12h后，洗去培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入600uM雙氧水損傷3h。損傷結(jié)束后，吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入MTT試劑，孵育4小時(shí)，吸去上清，加入匿SO溶解，分光光度法(550nm)測(cè)定細(xì)胞存活率。根據(jù)模型組計(jì)算藥物的保護(hù)率，采用SPSS軟件計(jì)算得到該化合物保護(hù)雙氧水損傷心肌細(xì)胞的半數(shù)有效劑量(EC50)為23uM。另外DPK1法(l，l-二苯基苦基苯肼法)測(cè)試該化合物的抗氧化作用，結(jié)果顯示其EC50為52uM。實(shí)施例9丹參注射液的指紋圖譜構(gòu)建方法儀器與試劑AgilentllOO型高效液相色譜儀(德國(guó)Agilent公司)，配四元梯度泵、在線(xiàn)脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器、ChemStation工作站控制系統(tǒng)；AgilentllOO型質(zhì)譜檢測(cè)器與HPLC聯(lián)用。分離用色譜柱為AgilentZorbaxSB-C18(4.6mmX250mm，5iim)。流動(dòng)相為乙月青(德國(guó)Meek公司，色譜純)和Milli-Q超純水(Millipore公司，美國(guó))；甲酸(色譜純，美國(guó)TEDIA公司)。各批次丹參注射液由正大青春寶制藥有限公司提供，均為市售產(chǎn)品。樣品預(yù)處理。丹參注射液50iiL，重蒸水稀釋至200iU，HPLC進(jìn)樣量20iU。色譜條件。色譜柱AgilentZorbaxSB-C18(4.6mmX250mm，5iim)，流速0.5mL/min，柱溫3(TC;流動(dòng)相為0.05%甲酸水(A相)和0.05%甲酸乙腈(B相)，采用梯度洗脫010min，10%B20%B，10min30min，20%B47%B，30min50min，47%B100%B，即0—10min—30min—50min，B:10%—20%—47%—100%;DAD檢測(cè)器(190400nm)。質(zhì)譜檢測(cè)器，ESI電離源，負(fù)離子，采用全掃描模式(TICmode)，掃描范圍m/z1001000，電力電壓150V，干燥氮?dú)饬魉?.5L/min，干燥氣體溫度350°C，毛細(xì)管電壓3000V。根據(jù)上述條件獲得丹參注射液的LC-MS指紋圖譜，其特征峰包括了目前已發(fā)現(xiàn)的丹參注射液中的大部分有效成分，包括丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B等，還包括了本發(fā)明中在丹參注射液中新發(fā)現(xiàn)的丹酚酸M，使丹參注射液質(zhì)量控制技術(shù)有上了一個(gè)新的臺(tái)階。該指紋圖譜中各特征峰表示如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求一種酚酸類(lèi)化合物丹酚酸M，其結(jié)構(gòu)式為F2009101548417C0000011.tif2.—種制備丹酚酸M的方法，其特征在于取丹參注射液，過(guò)半制備色譜柱分離、純化，冷凍干燥后得到淡黃色粉末，即獲得該化合物。流動(dòng)相由0.05%甲酸-水和乙腈組成，梯度洗脫程序?yàn)?—28min—60min:乙腈18%—18%—35X，流速4ml/min，分離用半制備色譜柱為ZorbaxSB_C18(9.4mmX25cm)，保留時(shí)間tK=22.lmin。3.—種制備丹酚酸M的方法，其特征在于丹參藥材加6-8倍量水煎煮二三次，每次1.52小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液減壓濃縮。乙醇沉淀二次，是每次含醇量在75%85%，濾過(guò)，濾液回收乙醇，蒸餾水稀釋?zhuān)o置過(guò)濾，過(guò)制備液相分離、純化，冷凍干燥后得到淡黃色粉末，即為該化合物；制備液相分離條件為流動(dòng)相由0.05%甲酸-水和乙腈組成，梯度洗脫程序?yàn)?—28min—60min，乙腈18%—18%—35%，流速4ml/min，分離用半制備色譜柱為SB-C18，9.4mmX25cm，5iim，保留時(shí)間tK=22.lmin。4.權(quán)利要求2所述的一種制備丹酚酸M的方法，其特征在于取丹參1500g，加水8倍量煎煮三次，第一次2小時(shí)，第二、三次各1.5小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液減壓濃縮至750ml;加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量為75%，第二次使含醇量為85%，每次均冷藏放置后濾過(guò)，濾液回收乙醇，并濃縮至約250ml，加蒸餾水稀釋至400ml，混勻，靜置，濾過(guò)。使用半制備色譜柱分離、純化，冷凍干燥后得到淡黃色粉末，即獲得該化合物；流動(dòng)相由0.05%甲酸-水和乙腈組成，梯度洗脫程序?yàn)?—28min—60min:乙腈18%—18%—35X，流速4mL/min，分離用半制備色譜柱為ZorbaxSB_C18(9.4mmX25cm)，保留時(shí)間tK=22.lmin。5.丹酚酸M在制備治療心血管疾病藥物中的應(yīng)用。6.—種丹參注射液指紋圖譜構(gòu)建方法，其特征是指紋圖譜中包含丹酚酸M的特征峰，丹酚酸M的保留時(shí)間為17.Omin;丹參注射液50iiL，重蒸水稀釋至200iiL，HPLC進(jìn)樣量20yL;色i普條^(牛色i普柱AgilentZorbaxSB_C18(4.6mmX250mm，5um)，、流速0.5ml/min，柱溫30。C;流動(dòng)相為0.05%甲酸-水和0.05%甲酸_乙腈，采用梯度洗脫0—10min—30min—50min，0.05%甲酸-乙腈10%—20%—47%—100%;DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)190400nm;質(zhì)譜檢測(cè)器，ESI電離源，負(fù)離子，采用全掃描模式，掃描范圍m/z1001000，電力電壓150V，干燥氮?dú)饬魉?.5L/min，干燥氣體溫度35(TC，毛細(xì)管電壓3000V。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種從丹參中提取的新的酚酸類(lèi)化合物丹酚酸M，該新化合物也可以從丹參注射液中提取，發(fā)明同時(shí)公開(kāi)了分別從丹參和丹參注射液中該新化合物的提取方法。藥理研究表明丹酚酸M具有心肌保護(hù)和抗氧化活性，因而具有進(jìn)一步研制開(kāi)發(fā)成有效的治療心血管疾病藥物的前景，且可以用于丹參注射液質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中。文檔編號(hào)A61P39/00GK101717384SQ20091015484公開(kāi)日2010年6月2日申請(qǐng)日期2009年11月24日優(yōu)先權(quán)日2009年11月24日發(fā)明者周天芳,張曉麗,徐金鐘,王木蘭,王治,瞿海斌,程翼宇,聶晶,范驍輝,莫必琪申請(qǐng)人:正大青春寶藥業(yè)有限公司