專利名稱：一種糖皮質(zhì)激素接枝的基因給藥載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種給藥載體的制備方法，尤其涉及一種用糖皮質(zhì)激素接枝的聚陽(yáng)離
子修飾脂質(zhì)體的基因給藥載體的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，特別是人類基因庫(kù)的建立和人類疾病相關(guān)基因的闡明， 疾病的基因治療應(yīng)運(yùn)而生，并已發(fā)展為當(dāng)代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的一個(gè)新的研究領(lǐng)域，被認(rèn)為是 治療遺傳性先天疾病、惡性腫瘤、傳染病等最有希望的治療方案之一 。 目前的轉(zhuǎn)染載體基本上可分為兩類病毒載體與非病毒載體。非病毒基因載體能 夠克服病毒基因載體的許多內(nèi)在問(wèn)題，諸如無(wú)免疫原性、無(wú)遺傳毒性、細(xì)胞毒性低、成本低 等等，是治療基因體內(nèi)給藥不可替代的傳遞系統(tǒng)，具有重要的臨床實(shí)用潛力。但是，相比于 病毒載體，非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率低，限制了其實(shí)際應(yīng)用。 陽(yáng)離子脂質(zhì)體和陽(yáng)離子聚合物是目前應(yīng)用最廣泛的非病毒基因載體。脂質(zhì)體是 由脂質(zhì)雙層構(gòu)成的內(nèi)部為水相的閉合囊泡，作為基因載體主要是利用脂質(zhì)體能夠促進(jìn)極性 大分子穿透細(xì)胞膜的原理。陽(yáng)離子脂質(zhì)體的生物相容性好，制備簡(jiǎn)單，但穩(wěn)定性差，具有一 定的細(xì)胞毒性。聚乙烯亞胺(Polyethylenimine， PEI)是一種陽(yáng)離子聚合物，PEI的單體 為_(kāi)CH2-CH2-NH-，結(jié)構(gòu)骨架中每三個(gè)原子中含一個(gè)氨基，具有很高的正電荷密度，具有較強(qiáng) 的DNA結(jié)合能力和細(xì)胞吸附能力。PEI具有強(qiáng)大的緩沖能力，S卩"質(zhì)子海綿"效應(yīng)。PEI的 分子量范圍很寬，其分子量對(duì)其轉(zhuǎn)染效果和細(xì)胞毒性影響很大。分子量越高，PEI表面的電 荷密度越大，轉(zhuǎn)染效率越高，毒性越大。低分子量PEI的毒性較低，其轉(zhuǎn)染效率也較低。PEI 進(jìn)入細(xì)胞后不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核。糖皮質(zhì)激素是一種強(qiáng)疏水性的類固醇激素，能與細(xì)胞中的糖 皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合，形成激素-受體復(fù)合物，瞬間轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，因此可以選擇糖皮質(zhì) 激素作為NLS，提高基因載體的轉(zhuǎn)染效率。將糖皮質(zhì)激素與小分子量PEI連接，得到糖皮質(zhì) 激素接枝的聚陽(yáng)離子，是一種轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性較低的基因載體材料，但由于聚陽(yáng)離子 在體內(nèi)不可降解，其生物相容性較低。利用糖皮質(zhì)激素接枝的聚陽(yáng)離子上的疏水性糖皮質(zhì) 激素，與脂質(zhì)體結(jié)合，以提高聚合物的生物相容性，又提高脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種糖皮質(zhì)激素接枝的基因給藥載體 的制備方法。 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種糖皮質(zhì)激素接枝的基因給藥載 體的制備方法，該方法包括以下步驟 (1)按摩爾比36 : 9 36 : 4 84稱取磷脂、膽固醇和糖皮質(zhì)激素接枝聚乙烯 亞胺； (2)將磷脂和膽固醇溶于氯仿中，糖皮質(zhì)激素接枝聚乙烯亞胺溶于體積為氯仿體 積1/3的蒸餾水后，加入上述氯仿中，旋渦振蕩或超聲10 30分鐘，形成乳劑；
(3)在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)，除去氯仿，得到脂質(zhì)體混懸液； (4)脂質(zhì)體混懸液經(jīng)過(guò)超聲和擠壓過(guò)膜，即得用糖皮質(zhì)激素接枝的聚陽(yáng)離子修飾 脂質(zhì)體的基因給藥載體。 進(jìn)一步地，所述糖皮質(zhì)激素接枝聚乙烯亞胺為曲安奈德接枝聚乙烯亞胺。 本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子帶正電，可以有效壓縮
DNA，糖皮質(zhì)激素具有細(xì)胞核定位信號(hào)的作用，可以提高低分子量聚陽(yáng)離子的基因轉(zhuǎn)染效
率；脂質(zhì)體具有與細(xì)胞膜類似的磷脂雙層結(jié)構(gòu)，因此具有一定的細(xì)胞親和性和組織相容性；
將糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子與脂質(zhì)體結(jié)合，可以提高脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率，又可以增加聚合
物的生物相容性，降低毒性，還可以通過(guò)對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行靶向修飾，提高載體的靶向性傳遞。
本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理，制備工藝簡(jiǎn)單，具有很好的體內(nèi)應(yīng)用前景。


圖1是曲安奈德修飾聚乙烯亞胺的合成路線圖； 圖2是曲安奈德21位甲磺酸酯的^-NMR圖譜； 圖3是曲安奈德_聚乙烯亞胺的力-NMR圖譜； 圖4是糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子修飾的脂質(zhì)體的形態(tài)觀察圖； 圖5是糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子修飾的脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性圖； 圖6是糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子修飾的脂質(zhì)體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率測(cè)定圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明利用糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子上糖皮質(zhì)激素的疏水性，與脂質(zhì)體結(jié)合，制
備糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子修飾的脂質(zhì)體。本發(fā)明糖皮質(zhì)激素接枝的基因給藥載體的制 備方法具體為按摩爾比36 : 9 36 : 4 84稱取磷脂、膽固醇和糖皮質(zhì)激素接枝聚乙 烯亞胺，將磷脂和膽固醇溶于氯仿中，糖皮質(zhì)激素接枝聚乙烯亞胺溶于體積為氯仿體積1/3 的蒸餾水后，加入上述氯仿中，旋渦振蕩或超聲10 30分鐘，形成乳劑，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減 壓蒸發(fā)，除去氯仿，得到脂質(zhì)體混懸液。脂質(zhì)體混懸液經(jīng)過(guò)超聲和擠壓過(guò)膜，即得用糖皮質(zhì) 激素接枝的聚陽(yáng)離子修飾脂質(zhì)體的基因給藥載體。 本發(fā)明所涉及的糖皮質(zhì)激素為具有21位羥基的糖皮質(zhì)激素，包括但不限于曲安 奈德。 曲安奈德接枝聚乙烯亞胺(TA-PEI)的合成通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)
1.將曲安奈德上的C-21羥基用甲磺酰氯酯化，合成曲安奈德21位甲磺酸酯。
取C-21羥基的曲安奈德用無(wú)水吡啶溶解，溶液于0°C ， N2保護(hù)，攪拌下，慢慢滴加 過(guò)量的甲磺酰氯，反應(yīng)于ot:進(jìn)行5h，反應(yīng)溶液加入0°C的過(guò)量的純水終止反應(yīng)，抽濾，冰水 洗滌，真空干燥，得到白色固體，即曲安奈德21位甲磺酸酯。 2.曲安奈德21位甲磺酸酯與低分子量PEI用Traut' s試劑連接合成目標(biāo)產(chǎn)物。
將曲安奈德21位甲磺酸酯和Traut' s試劑溶于無(wú)水匿SO中，將低分子量PEI 1800溶于無(wú)水匿SO中，在N2保護(hù)下滴加入前者溶液中，邊加邊攪拌。反應(yīng)室溫下進(jìn)行4h， 然后加入過(guò)量的冰的乙酸乙酯，過(guò)濾得到淡黃色沉淀，加入適量純水溶解，0. 45 ii m微孔濾 膜過(guò)濾，純水透析(截留分子量1000)48小時(shí)。冷凍干燥得淡黃色固體，即為目標(biāo)產(chǎn)物。
4
聚陽(yáng)離子的種類繁多，其他種類的聚陽(yáng)離子也適用于本發(fā)明的脂質(zhì)體修飾
下面根據(jù)實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。
實(shí)施例1 : 取磷脂10mg、膽固醇0 4.83mg溶于15mL氯仿中，取糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子 3. 2 67. 45mg溶于相對(duì)于氯仿1/3體積的蒸餾水(5mL)中，用逆向蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體。具 體為將水相加入有機(jī)相中，旋渦振蕩或超聲10 30分鐘，形成乳劑，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減 壓除去氯仿，得到脂質(zhì)體混懸液。脂質(zhì)體溶液經(jīng)過(guò)水浴超聲5 20min，擠壓過(guò)膜，孔徑為 0. 1 0. 22iim，既得。
實(shí)施例2 : 取曲安奈德217. 25mg用無(wú)水吡啶溶解，溶液于0°C， N2保護(hù)，攪拌下，慢慢滴加過(guò) 量的甲磺酰氯78 ii L，反應(yīng)于Ot:進(jìn)行5h，反應(yīng)溶液加入0°C的過(guò)量的冰水(約80mL)終止 反應(yīng)，抽濾，冰水洗滌，真空干燥，得到白色固體，為曲安奈德21位甲磺酸酯。
將4倍過(guò)量的曲安奈德21位甲磺酸酯133. 9mg和Traut' s試劑34. 4mg溶于無(wú)水 DMSO 2mL中，將低分子量PEI 1800 112. 5mg溶于無(wú)水DMSO 2mL中，在N2保護(hù)下滴加入前 者溶液中，邊加邊攪拌。反應(yīng)室溫下進(jìn)行4h，然后加入過(guò)量的冰的乙酸乙酯80mL，過(guò)濾得到 淡黃色沉淀，加入適量純水溶解，0. 45 y m微孔濾膜過(guò)濾，純水透析(截留分子量1000) 48h。 冷凍干燥得淡黃色固體，即為曲安奈德-聚乙烯亞胺。合成反應(yīng)方程式參見(jiàn)附圖1。
實(shí)施例3 :曲安奈德21位甲磺酸酯和曲安奈德_聚乙烯亞胺(TA-PEI)的核磁共 振表征 將適量曲安奈德21位甲磺酸酯溶于氖代匿SO中，進(jìn)行500腿z 1H-NMR掃描。將
適量TA-PEI溶于氖水中，進(jìn)行500MHz 1H-NMR掃描。曲安奈德21位甲磺酸酯的核磁圖參
見(jiàn)附圖2。曲安奈德-聚乙烯亞胺的核磁圖參見(jiàn)附圖3。
實(shí)施例4 :本發(fā)明的測(cè)定試驗(yàn)如下 1.糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子修飾的脂質(zhì)體的形態(tài)觀察 取適量糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子修飾的脂質(zhì)體加適量的雙蒸水稀釋后，加至專用 銅網(wǎng)上，2%磷鎢酸染色0. 5 2min，透射電子顯微鏡下觀察粒子的大小和形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)附 圖4。 2.糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子修飾的脂質(zhì)體的粒徑與電位 取適量糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子修飾的脂質(zhì)體加適量的雙蒸水稀釋至適當(dāng)濃度， 按不同質(zhì)量比與pDNA混合，室溫下孵育30min，動(dòng)態(tài)光散射粒徑電位測(cè)定儀測(cè)定修飾后脂 質(zhì)體的粒徑分布與電位，結(jié)果見(jiàn)表1。 表1曲安奈德_聚乙烯亞胺修飾脂質(zhì)體及與pDNA復(fù)合物的粒徑與電位(n = 3)
_ 粒徑(nm) 電位(mV)
曲安奈德-聚乙烯亞胺修飾脂質(zhì)體 曲安奈德-聚乙烯亞胺修飾脂質(zhì)體與PDNA
復(fù)合物(質(zhì)量比=0.3:1) 曲安奈德-聚乙烯亞胺修飾脂質(zhì)體與PDNA
復(fù)合物(質(zhì)量比=1:1) 曲安奈德-聚乙烯亞胺修飾脂質(zhì)體與PDNA
復(fù)合物(質(zhì)量比=2:1) 曲安奈德-聚乙烯亞胺修飾脂質(zhì)體與PDNA _復(fù)合物(質(zhì)量比=4:1)_ 3.糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子修飾的脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性 H印G 2細(xì)胞(1X10V孔)接種于96孔培養(yǎng)板，過(guò)夜培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，匯合度為 60 80%。取適量糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子修飾的脂質(zhì)體加適量的雙蒸水稀釋至適當(dāng)濃 度，按不同質(zhì)量比與PDNA混合，室溫下孵育30min，形成復(fù)合物。以糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng) 離子/DNA復(fù)合物為對(duì)照。細(xì)胞用PBS洗滌后加入無(wú)血清培養(yǎng)基，加入不同質(zhì)量比的復(fù)合 物、PEI 1800(質(zhì)量比=5. 3 : 1)、PEI 25K(質(zhì)量比二1.33 : 1)，每孔DNA的質(zhì)量固定為 0. 2 ii g，每孔總體積為100 ii L/孔，空白對(duì)照組加100 ii L無(wú)血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h 之后移去培養(yǎng)基，加入180 y L無(wú)血清培養(yǎng)基和20 ii L MTT (5mg/mL)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后， 加入100iiLDMS0每孔，振搖10min，酶標(biāo)儀上，于570nm測(cè)定A值。按以下公式計(jì)算細(xì)胞生 存率。 細(xì)胞生存率(％ ) = (A樣品/A空白)X100% 結(jié)果表明在不同的質(zhì)量比時(shí)，糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子修飾脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性均 小于糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子，結(jié)果參見(jiàn)附圖5。 4.糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子修飾脂質(zhì)體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率測(cè)定
pGL-3轉(zhuǎn)染細(xì)胞 H印G 2細(xì)胞(1X107孔)接種于24孔培養(yǎng)板，過(guò)夜培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，匯合度為 60 80%。取適量糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子修飾的脂質(zhì)體與糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子加 適量的雙蒸水稀釋至適當(dāng)濃度，與pDNA按質(zhì)量比3 : 1混合，室溫下孵育30min，形成復(fù) 合物。細(xì)胞用PBS洗滌后加入無(wú)血清培養(yǎng)基或含10%血清培養(yǎng)基，加入不同質(zhì)量比的復(fù)合 物、PEI 1800(質(zhì)量比=5. 3 : 1)、PEI 25K(質(zhì)量比二1.33 : 1)，每孔DNA的質(zhì)量固定為 2yg，每孔總體積為500iiL/孔。放入37t: C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)6小時(shí)，吸去轉(zhuǎn)染液，每孔加入 500 ii L含10%小牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。吸去培養(yǎng)基，PBS洗一次，每孔加入500 y L 細(xì)胞裂解液，裂解30min，轉(zhuǎn)移至EP管中，12000rpm， 4。C離心5min。取100 y L上清液，加入 100 iiL Luc if erase (Promega)測(cè)定相對(duì)光單位。其蛋白含量用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。 以相對(duì)光單位/蛋白含量作為轉(zhuǎn)染效率的評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)附圖6。結(jié)果表明糖皮質(zhì)激素接 枝聚陽(yáng)離子修飾的脂質(zhì)體在有血清時(shí)轉(zhuǎn)染效率大于糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子，表明其生物
6
162.0±8. 5 225. 3±13. 1
183. 3±15. 0
150. 3±6. 4
97. 03±8. 1
25. 0±3. 0 -35. 8 ± 3.3
4. 7±2. 1 16. 3±2. 3 19. 3±2.9相容性更好。 承表示P < 0. 05，存在顯著性差異。 上述實(shí)施例用來(lái)解釋說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和 權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種糖皮質(zhì)激素接枝的基因給藥載體的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)按摩爾比36∶9～36∶4～84稱取磷脂、膽固醇和糖皮質(zhì)激素接枝聚乙烯亞胺。(2)將磷脂和膽固醇溶于氯仿中，糖皮質(zhì)激素接枝聚乙烯亞胺溶于體積為氯仿體積1/3的蒸餾水后，加入上述氯仿中，旋渦振蕩或超聲10～30分鐘，形成乳劑。(3)在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)，除去氯仿，得到脂質(zhì)體混懸液。(4)脂質(zhì)體混懸液經(jīng)過(guò)超聲和擠壓過(guò)膜，即得用糖皮質(zhì)激素接枝的聚陽(yáng)離子修飾脂質(zhì)體的基因給藥載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述糖皮質(zhì)激素接枝的基因給藥載體的制備方法，其特征在于，所 述糖皮質(zhì)激素接枝聚乙烯亞胺為曲安奈德接枝聚乙烯亞胺。
全文摘要
本發(fā)明提供一種糖皮質(zhì)激素接枝的聚陽(yáng)離子修飾脂質(zhì)體的基因給藥載體的制備方法，是利用糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子上糖皮質(zhì)激素的疏水性，與脂質(zhì)體結(jié)合。糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子修飾的脂質(zhì)體由糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子、中性磷脂、膽固醇、蒸餾水組成，用逆向蒸發(fā)法制備。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于將糖皮質(zhì)激素接枝聚陽(yáng)離子與脂質(zhì)體結(jié)合，可以提高脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率，又可以增加聚合物的生物相容性，降低毒性，還可以通過(guò)對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行靶向修飾，提高載體的靶向性傳遞。本發(fā)明方法設(shè)計(jì)合理，制備工藝簡(jiǎn)單，具有很好的體內(nèi)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101703783SQ200910154930
公開(kāi)日2010年5月12日 申請(qǐng)日期2009年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日
發(fā)明者王成潤(rùn), 胡敏新, 金 一, 馬昆, 齊巖 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)