專利名稱：IFN-γ受體基因(B8R)缺失的天壇株重組痘苗病毒及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及IFN-y受體基因(B8R)缺失的天壇株重組痘苗病毒減毒載 體以及基于此載體構(gòu)建的表達(dá)HIV-1各種抗原(單價及多價)的IFN-y受體 基因(B8R)缺失的天壇株重組痘苗病毒艾滋病疫苗。本發(fā)明的天壇株重 組痘苗病毒減毒載體能夠顯著降低痘苗病毒載體的毒力，可以用于構(gòu)建表 達(dá)同一病原多種抗原、不同病原多種抗原的多價重組痘苗病毒。本發(fā)明的 重組痘苗病毒艾滋病疫苗能夠誘導(dǎo)高水平的抗人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，并有效提高重組痘 苗病毒艾滋病疫苗的安全性及免疫原性。
背景技術(shù)：
痘苗病毒天壇株(vaccine virus TianTan strain，VTT)為我國消滅天花 作出巨大貢獻(xiàn)，在活載體疫苗研究應(yīng)用也十分活躍，重組痘苗病毒疫苗具 有效果好、對熱穩(wěn)定性好，接種方便，不需佐劑等優(yōu)點，然而痘苗病毒接 種人體后產(chǎn)生較重的局部反應(yīng)，特別是在一定比例的免疫缺陷患者中可引 起嚴(yán)重的并發(fā)癥。表達(dá)某些免疫原的重組痘苗病毒未能達(dá)到理想的免疫效 果，如何能在增強(qiáng)重組痘苗病毒的免疫原性同時進(jìn)一步提高痘苗病毒載體 的安全性，學(xué)者們作出很多深入的研究。隨著新的病毒疾病不斷出現(xiàn)，對 宿主抗病毒免疫機(jī)理的深入了解，構(gòu)建表達(dá)同一病原多種抗原、不同病原 多種抗原的多價重組痘苗病毒載體，尋找更多穩(wěn)定有效的外源基因插入?yún)^(qū) 意義重大。
痘苗病毒基因組編碼一些特殊蛋白抑制宿主免疫系統(tǒng)，據(jù)文獻(xiàn)報道和
基因分析，可知痘苗病毒天壇株B8R基因與IFN-y受體膜外區(qū)域具有高度同 源性[1]。 IFN-y在抗病毒及免疫調(diào)節(jié)方面具有重要的作用。本發(fā)明構(gòu)建缺失 IFN-y受體基因的天壇株重組痘苗病毒載體，研究其毒力改變及B8R缺失區(qū) 插入外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性。進(jìn)一步提高天壇株痘苗病毒載體安全性、研制表達(dá)多價抗原重組痘苗病毒載體。
HIV—1全球流行導(dǎo)致了極高的致病率和病死率，為防治HIV—1的感
染，傳統(tǒng)的化學(xué)藥物治療、免疫治療以及新的方法得以不斷研究、發(fā)展，
對多數(shù)HIV感染者進(jìn)行HAART，雖可有效抑制病毒血癥，延緩病程，但不 能清除潛伏的病毒。保護(hù)性的疫苗接種是解決防治HIV-1感染全球性問題 的最佳途徑?？茖W(xué)家們開展了減毒活疫苗、滅活疫苗、重組亞單位疫苗、 各種活載體疫苗(腺病毒、金絲雀痘病毒、流感病毒、痘苗病毒、狂犬病 毒、VSV、傷寒桿菌、鏈球菌等載體)的研究，傳統(tǒng)的減毒活疫苗及滅活 疫苗在HIV防治中存在一些問題。雖然減毒活疫苗在SIV模型證實有效， 但在初免疫成年獼猴中存在一定致死率。被HIV-1感染的猩猩仍可被第二 種不相關(guān)的HIV-1感染。由于活減毒株風(fēng)險性以及有證據(jù)表明無廣泛保護(hù) 性，減毒活疫苗應(yīng)用的爭議尚待進(jìn)一步研究。在猩猩模型有研究表明，滅 活疫苗不能保護(hù)HIV-1攻擊，不能誘導(dǎo)CTL反應(yīng)。病毒活載體疫苗和DNA 疫苗都既可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，又可以誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，表達(dá)HIV-1抗原 重組痘苗病毒和HIV-1DNA疫苗的聯(lián)合免疫成為新的疫苗研究策略。

發(fā)明內(nèi)容
為了進(jìn)一步提高重組痘苗病毒疫苗的安全性及有效性，本發(fā)明目的在 于提供一種同源重組構(gòu)建B8R基因缺失區(qū)插入外源基因的的IFN-Y受體基 因(B8R)缺失的天壇株重組痘苗病毒VTTAB8RlacZ及其在制備重組痘 苗病毒疫苗中的應(yīng)用。
具體涉及一種B8R基因缺失、表達(dá)HIV-l抗原的VTKgpeAB8R (B8R基 因缺失不帶lacZ選擇標(biāo)記，TK區(qū)插入B7C型CN54株HIV-1 gagpol env 基因)的天土云株重組痘苗病毒 com6/"贈vacc/m'a vzWms VTKgpe的艾滋病 疫苗，該重組痘苗病毒recom6,"贈vacc/"/a vzWws VTKgpe于2004年2月24 日在北京保藏，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心，其保藏號為CGMCC No.l099;涉及一種B8R基因缺失表達(dá)HIV-1抗原 的VTKgpeAB8RlacZ (B8R基因缺失為lacZ所取代，TK區(qū)插入BVC型 CN54株HIV-1 gagpol env基因)的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病疫苗； 還涉及一種B8R基因缺失、表達(dá)乙型肝炎病毒HBSAg抗原，IL-2的(B8R基因缺失插入HBSAg抗原，TK區(qū)插入IL-2基因)的天壇株重組痘苗病毒 的乙型肝炎病疫苗。
本發(fā)明的目的在于提供用于以痘苗病毒VTT為母本病毒，構(gòu)建B8R區(qū)缺 失，同時在該區(qū)插入各種外源基因的重組痘苗病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R、 pSKB8RLacZ 、 pSKB8RNeo、 pSKB8RPNeo和它們的構(gòu)建方法。
本發(fā)明提供了一種用于轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ構(gòu)建的質(zhì)粒pSC65，含有 該質(zhì)粒的大腸埃希氏菌￡^^士/^"http://已于2004年2月24日在北京保藏,保藏 單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為 CGMCC No. 1097。
本發(fā)明提供了一種用于轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8Rneo構(gòu)建的質(zhì)粒pVI75，含有該 質(zhì)粒的大腸埃希氏菌^/^n'c/n'a co/z'已于2004年2月24日在北京保藏，保藏 單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為 CGMCC No. 1098。
本發(fā)明所涉及的一種B8R基因缺失為kcZ所取代的重組病毒 VTTAB8RlacZ可以作為同源重組構(gòu)建B8R基因缺失區(qū)插入外源基因的疫 苗株的親本毒株。VTTAB8RlacZ構(gòu)建方法即將痘苗病毒天壇株VTT (北 京生物制品所保藏，Tiantan株752-1 )與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF 細(xì)胞進(jìn)行同源重組,經(jīng)藍(lán)白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失為 lacZ所取代的重組病毒VTTAB8RlacZ。提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及DOT BLOT鑒定、檢測重組病毒B8R基因缺失的穩(wěn)定性，表明VTTAB8RlacZ 在CEF細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因缺失穩(wěn)定。VTTAB8RlacZ在CEF 細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代插入外源基因lacZ穩(wěn)定表達(dá)。重組缺失病毒 VTTAB8RlacZ在CEF、 TKH43、 CV-1細(xì)胞中的繁殖生長曲線測定，結(jié)果 表明VTTAB8RlacZ的生長曲線與VTT生長曲線相似。B8R基因缺失對重 組缺失病毒在細(xì)胞中的繁殖復(fù)制沒有影響。兔皮內(nèi)毒力實驗表明 VTT752-l形成紅腫痘皰面積顯著大于VTTAB8RlacZ形成痘皰，VTT752-l 形成紅腫痘皰而后出現(xiàn)潰破接痂，VTT厶B8RlacZ形成痘皰無潰破接痂， VTTAB8RlacZ形成痘皰消褪較VTT752-l形成痘皰消褪早。B8R基因缺失 顯著降低痘苗病毒天壇株病毒毒力。
本發(fā)明涉及的一種B8R基因缺失、表達(dá)HIV-l抗原的VTKgpeAB8R (B8R基因缺失不帶lacZ選擇標(biāo)記，TK區(qū)插入B7C型CN54株HIV-1 gagpolenv基因)的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病疫苗及一種B8R基因缺失表達(dá)HIV-l抗原的VTKgpeAB8RlacZ (B8R基因缺失為IacZ所取代，親 本毒株VTTAB8RlacZ的TK區(qū)插入B7C型CN54株HIV-1 gagpol env基 因)的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病疫苗。即將VTKgpe (TK區(qū)插入B7C 型CN54株HIV-1 gagpol env基因的天壇株重組痘苗病毒)與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞進(jìn)行同源重組,經(jīng)藍(lán)白篩選、連續(xù)單斑純化、 鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的重組病毒VTKgpeAB8RlacZ，再以 VTKgpeAB8RlacZ為親本株與pSKB8RNeo共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞進(jìn)行同源重組, 經(jīng)G418壓力篩選、藍(lán)白斑篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失不 帶lacZ選擇標(biāo)記的重組病毒VTKgpeAB8R 。裸鼠毒力實驗表明 VTKgpeAB8R毒力較VTKgpe顯著降低，腹腔接種VTT (104pfo)及VTKgpe (10ifli)15天裸鼠死亡，接種VTKgpeAB8R(107 pfo)裸鼠存活。胞內(nèi)IFN-y. 染色流式細(xì)胞儀分析、T淋巴細(xì)胞增殖、CTL檢測顯示B8R基因缺失顯著 提高表達(dá)HIV-1基因的天壇株重組痘苗病毒特異性細(xì)胞免疫。本發(fā)明上述 所涉及的TK區(qū)
是指Tiantan株Genebank,gi6969640基因組的79799bp-81271 bp的 一 段核苷
酸序列。
本發(fā)明涉及B8R基因缺失、表達(dá)HIV-1和乙型肝炎病毒各種單價或多 價抗原的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病及乙型肝炎病疫苗。
本發(fā)明涉及B8R基因缺失、表達(dá)外源基因單價或多價抗原的天壇株重 組痘苗病毒包括重組疫苗、表達(dá)外源基因重組痘苗病毒以及它們在制 備治療病毒病的重組痘苗病毒疫苗藥物中的應(yīng)用。
以上本發(fā)明所描述的技術(shù)特征目前國內(nèi)外未見任何報道，所以本發(fā)明 具有創(chuàng)造性、新穎性和實用性。對人類病毒病的重組痘苗病毒疫苗藥物治 療將帶來十分重要的意義。


圖l顯示轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R、 pSKB8RLacZ 、 pSKB8RNeo的構(gòu)建路線 圖2顯示pSKB8R酶切確認(rèn)分析結(jié)果，圖中泳道2，3:分子量標(biāo)記DL2000， DL15000 (購自大連寶生物工程有限公司)，泳道l:pSKB8R (Ndel禾口 BgLII)。圖3顯示pSKB8RlacZ酶切確認(rèn)分析結(jié)果，圖中泳道l:分子量標(biāo)記 DL15000，泳道2:pSKB8RLacZ(Spel)，泳道3: pSKB8RLacZ (Sacl), 泳道4: pSKB8RLacZ(Ndel)。
圖4顯示pSKB8RNeo酶切確認(rèn)分析結(jié)果，圖中泳道l:分子量標(biāo)記 DL15000，泳道2: pSKB8RNeo (BamHI和BgLII)。
圖5顯示pSKB8RPNeo酶切確認(rèn)分析結(jié)果，圖中泳道l 2:分子量標(biāo)記 DL2000，15000，泳道3: pSKB8RPNeo (SaLI/SmaLI)。 圖6顯示重組病毒VTTAB8RlacZ、 VTKgpeAB8RlacZ、 VTKgpeAB8R構(gòu)
建示意圖。
圖7顯示PCR擴(kuò)增檢測重組病毒VTTAB8RlacZ B8R基因缺失
1,6: DNA標(biāo)準(zhǔn) 2 : VTTDNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物(引物B8RLF、 B8RRR)
3: VTTDNA擴(kuò)增產(chǎn)物(弓I物B8RF、 B8RRR)
圖8 Dot Blot檢測病毒基因組中B8R基因
提取痘苗病毒VTT752-lDNA及重組病毒VTTAB8RlacZ傳代15代DNA，以 B8R基因地高辛標(biāo)記探針進(jìn)行Dot Blot檢測。VTT752-lDot Blot結(jié)果顯示 雜交印跡斑點，VTTAB8RlacZ傳代15代Dot Blot結(jié)果未顯示雜交印跡斑 點，表明VTTAB8RlacZ在CEF細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因穩(wěn)定缺失 圖9顯示重組缺失病毒VTTAB8RlacZ細(xì)胞中的繁殖曲線測定 以VTTAB8RlacZ重組病毒在CEF中增殖，其不同時間收獲的病毒PFU值， 繪制病毒繁殖曲線(與TK一143、 Wish、 CV-1細(xì)胞上繁殖曲線相似)。結(jié)果 表明VTTAB8RlacZ的繁殖曲線與對照VTT繁殖曲線相似。B8R基因缺失對 重組缺失病毒在細(xì)胞中的繁殖復(fù)制沒有影響。48h病毒繁殖高峰達(dá) 107PFU/ml。(生長曲線縱軸為PFU對數(shù)值)
圖10 顯示兔皮內(nèi)毒力實驗結(jié)果兔背皮內(nèi)左側(cè)接種1X10卞FU的 VTT厶B8RlacZ，右側(cè)接種lXl()6pFlJ/ml的VTT752-l ，將0.1ml lX107pfu/ml VTTAB8RlacZ重組病毒,對兔背皮內(nèi)注射后，逐日觀察皮膚紅腫面積，第5 天可見紅腫痘皰，明顯小于對照痘苗病毒，且無潰破，消褪較早。表明重 組病毒VTTAB8RlaeZ毒力比對照VTT7S2-1顯著減弱。 圖ll顯示PCR擴(kuò)增檢測重組病毒VTKgpeAB8R B8R基因缺失 提取重組病毒DNA為模板，以引物B8RLF、 B8RRR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。重組病毒VTKgpeAB8R由于B8R基因缺失，PCR擴(kuò)增出1244 bp片段，包括B8R基 因外左側(cè)同源序列B8RL片段583 bp、右側(cè)同源序列B8RR片段661 bp。而 對照VTTDNA為模板擴(kuò)增出2Kb片段，包括B8R基因外左側(cè)同源序列BSRL 片段583 bp、 B8R基因818bp、右側(cè)同源序列B8RR片段661 bp。結(jié)果表明 VTKgpeAB8R在CEF細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因穩(wěn)定缺失。
圖12、 Dot Blot檢測病毒VTKgpeAB8R基因組中B8R基因 1、 VTT752-1 2、 VTKgpeAB8R
提取痘苗病毒VTT752-lDNA及重組病毒VTKgpeAB8R傳代15代DNA，以 B8R基因地高辛標(biāo)記探針進(jìn)行Dot Blot檢測。VTT752-lDot Blot結(jié)果顯示 雜交印跡斑點，VTKgpeAB8R傳代15代Dot Blot結(jié)果未顯示雜交印跡斑點， 表明VTKgpeAB8R在CEF細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因穩(wěn)定缺失 圖13顯示胞內(nèi)IFN-Y.染色流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。DNA + VTKgpeAB8R免疫 組小鼠脾細(xì)胞T淋巴細(xì)胞，在體外經(jīng)表位肽刺激后，分泌正1^丫的008+T淋 巴細(xì)胞占脾臟總CD8+T淋巴細(xì)胞的百分比數(shù)顯著高于DNA +VTKgpe免疫 組。VTKgpeAB8R免疫組小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-y.CD8百分比數(shù)顯著高于 VTKgpe免疫組。
圖14顯示T淋巴細(xì)胞增殖3H-TdR法檢測結(jié)果。DNA + VTKgpeAB8R免疫 組小鼠脾細(xì)胞T淋巴細(xì)胞，在體外經(jīng)表位肽刺激后，刺激指數(shù)(SI)顯著 高于DNA + VTKgpe免疫組。
圖15顯示CTL乳酸脫氫酶法檢測結(jié)果。DNA + VTKgpeAB8R免疫組小鼠
脾細(xì)胞T淋巴細(xì)胞，特異性殺傷顯著高于DNA + VTKgpe免疫組。
VTKgpeAB8R免疫組高于VTKgpe免疫組
圖16 Western Blot分析VTKgpeAB8R目的基因表達(dá)
1 VTT感染CEF細(xì)胞 2,3,4 VTKgpeAB8R感染CEF細(xì)胞 5預(yù)染蛋白
Marker
具體實施方案
實施例一、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建 1.質(zhì)粒pBR-SK的構(gòu)建5'PBR322畫SACI畫FOR
GGAGCTCCGACCGATGCCCTTGAGAGCC
3,PBR322-KPNI-RE
GGGGTACCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATG PCR擴(kuò)增商業(yè)質(zhì)粒pBR322包括全部功能元件的序列，記為pBR。 反應(yīng)體系
反應(yīng)條件94。C預(yù)變性2min; 94°C30s，68°C5 min,共35個循環(huán)；72°C7min; 4°C。
純化并大連寶生物的KpnI和SacI共酶切PCR產(chǎn)物pBR，跑膠回收。
用大連寶生物的KpnI和SacI共酶切質(zhì)粒pBS-SK，得到多克隆位點序列 (小片段)，記為SK，跑1.5%瓊脂糖膠回收。
連接酶切回收產(chǎn)物pBR和SK，轉(zhuǎn)化ToplO大腸桿菌感受態(tài)，并篩選出 正確克隆子，記為pBR-SK。
2.轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R的構(gòu)建
在載體質(zhì)粒pBR-SK插入痘苗病毒天壇株B8R基因外左側(cè)同源序列B8RL 片段、右側(cè)同源序列B8RR片段。見圖l。采用PCR技術(shù)分別以痘苗病毒
10xPyrobest Buffer dNTPMisture (各2.5mM) 3，PBR322-KPNI-RE (50,) 5'PBR322-SACI-FOR (50, pBR322
Pyrobest DNA Polymerase(5U/ml)
5^1 0，
0，
0，
ddH20
10DNA擴(kuò)增痘苗病毒天壇株B8R基因外左側(cè)同源序列B8RL片段(引物 B8RLF、 B8RLR)右側(cè)同、源序列B8RR片段(引物B8RRF、 B8RRR)， B8RL 片段、B8RR片段分別用BgLI徹連接，以連接產(chǎn)物為模板PCR擴(kuò)增(引物 B8RLF、 B8RRR) B8R基因外左右側(cè)同源序列連接大片段B8RLR。大片段 B8RLR、 pBRSK質(zhì)粒分別以Kpnl/BamHI酶切、T4DNALigase連接構(gòu)建帶 有天壇株B8R基因外左右側(cè)同源臂的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R。引物序列 B8RLF : gtaataggtaccgtagcatcctattcg B8RLR : tataatagatcttatggtgttgtttg B8RRF: aactaaagatctcggtagcac B8RRR: attcgtggatccattgtaacaagatatc
B8RL片段(引物B8RLF、B8RLR) ,B8RR片段(引物B8RRF、B8RRR)，， 連接大片段B8RLR (引物B8RLF、 B8RRR) PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用大連寶生物 工程有限公司的試劑盒，反應(yīng)體系如下
模板DNA lpl
正、反向引物 各lpl
10xPyrobest緩沖液 5;al dNTP混合物(各2.5mM) 5(il
Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5pl ddH20 37,5pl
PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性2 min; 94。C30s,58。C30s,72。C30s，共20個 循環(huán);72。C7min; 4'C。
大片段B8RLR延伸產(chǎn)物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit進(jìn)行純 化回收，回收產(chǎn)物Kpnl/BamHI共酶切(Takara公司產(chǎn))。。pBRSK質(zhì)粒載體 Kpnl/BamHI共酶切(Takara公司產(chǎn))。用Omega公司E.Z.N.A. Gel Extraction Kit進(jìn)行電泳純化回收.。二者T4DNALigase(Takara公司產(chǎn))連接構(gòu)建帶有天 壇株B8R基因外左右側(cè)同源臂的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感 受態(tài)大腸桿菌T叩IO，涂含氨芐青霉素的LB平板，37'C培養(yǎng)12-16小時。提 取質(zhì)粒，用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析鑒定，酶切鑒定結(jié)果分別參見圖2。
3.轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ的構(gòu)建
在pSKB8R左側(cè)同源序列B8RL片段、右側(cè)同源序列B8RR片段間插入痘苗 病毒啟動子序列pE/L、 p7.5及下游LacZ序列。以質(zhì)粒pSC65為模板擴(kuò)增痘苗病毒啟動子序列pE/L、 p7.5及下游LacZ序歹(J(引物pSC65F、 pSC65R)。 pE/L、 p7.5及下游LacZPCR擴(kuò)增片段(引物pSC65F、 pSC65R)以BamHI酶 切、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R以BgLII酶切，二者T4DNALigase連接構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pSKB8RLacZ。 pSKB8RLacZ帶有痘苗病毒啟動子序歹UpE/L、 p7,5和p7.5下 游的LacZ序列以及兩側(cè)的B8R基因夕卜同源臂。pSC65F : tctttcggatccttgttgaattagatcg pSC65R: gtttgccatacgctcacagaag
pE/L、 p7.5及下游LacZPCR擴(kuò)增片段PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用大連寶生物工 程有限公司的試劑盒，反應(yīng)體系如下
質(zhì)粒pSC65 1^1 正、反向引物(pSC65F、 pSC65R) 各1|^1
10xPyrobest緩沖液 5pl dNTP混合物(各2.5mM) 5^1
Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0，
ddH20 37，
PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性2 min; 94。C30s，58。C30s,72。C30s，共20個 循環(huán)；72。C7min; 4°C。
pE/L、 p7.5及下游LacZPCR擴(kuò)增片段延伸產(chǎn)物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物BamHI酶切(Takara公司產(chǎn))。轉(zhuǎn)移質(zhì) 粒pSKB8R載體BgLII酶切(Takara公司產(chǎn))。用Omega公司E.Z.N.A. Gel Extraction Kit進(jìn)行電泳純化回收.。二者T4DNALigase(Takara公司產(chǎn))連接構(gòu) 建pSKB8RlacZ。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ToplO，涂含氨節(jié)青霉 素的LB平板，37'C培養(yǎng)12-16小時。提取質(zhì)粒，用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切 分析鑒定，酶切鑒定結(jié)果分別參見圖3。
4轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8Rneo的構(gòu)建
即在pSKB8R左側(cè)同源序列B8RL片段、右側(cè)同源序列B8RR片段外側(cè)插入 痘苗病毒啟動子序列pH6及下游Neo序列。以質(zhì)粒pVI75為模板擴(kuò)增痘苗病 毒啟動子序歹UpH6及下游Neo序歹!j(引物NeoF， NeoR)， BamHI、 SacII酶切 pH6+Neo片段、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RBamHI、 SacII酶切，二者T4DNALigase 連接構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RNeo 。 弓|物NeoF :cgcggatcctcgatccccagattacaaacaactagg ， 弓l 物 NeoR :
tccccgcggacagatttctccgtgatagggatcg
pH6及下游Neo序列PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用大連寶生物工程有限公司的試 劑盒，反應(yīng)體系如下
質(zhì)粒 lpl 正、反向引物(NeoF， NeoR) 各lpl 10xPyrobest緩沖液 5^1 dNTP混合物(各2.5mM) 5^1 Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5^1 ddH20 37，
PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性2 min; 94°C30s,58°C30s,72°C60s，共20個 循環(huán)；72。C7min; 4°C。
pH6及下游Neo序列PCR擴(kuò)增片段延伸產(chǎn)物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物SacII/BamHI酶切(Takam公司產(chǎn))。 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R載體SacII/BamHI酶切(Takara公司產(chǎn))。用Omega公司 E.Z.N.A. Gel Extraction Kit進(jìn)行電泳純化回收.。二者T4DNALigase(Takara 公司產(chǎn))連接構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RNeo。連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿 菌ToplO，涂含氨芐青霉素的LB平板，37'C培養(yǎng)12-16小時。提取質(zhì)粒，用 相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析鑒定，酶切鑒定結(jié)果分別參見圖4。
5轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RPNeo的構(gòu)建
即在pSKB8RNeo左側(cè)同源序列B8RL片段、右側(cè)同源序列B8RR片段間插 入兩個互為反向的痘苗病毒啟動子序列pE/L、 p7.5。以質(zhì)粒pSC65為模板 擴(kuò)增痘苗病毒啟動子序列pE/L、 p7.5及多克隆位點。pE/L、 p7.5及多克隆 位點擴(kuò)增片段(引物PMF， PMR)以BamHI酶切、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8R以BgLH 酶切，二者T4DNALigase連接構(gòu)建pSKB8RP。質(zhì)粒pSKB8RPSacII/BamHI 酶切，pH6及下游Neo序列PCR擴(kuò)增片段延伸產(chǎn)物用SacII/BamHI酶切 (Takara公司產(chǎn))，二者T4DNALigase連接構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RPNeo。 PMF: cgggatccgtcgacttcgaacttattt PMR: cgggatcccccgggctcgagttatgatctt pE/L、 p7.5及多克隆位點擴(kuò)增片段PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用大連寶生物工程有限公司的試劑盒，反應(yīng)體系如下: 質(zhì)粒pSC65
正、反向引物(PMF， PMR) 10xPyrobest緩沖液 dNTP混合物(各2.5mM) Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml)
1|J 5^1
5^1 37，
ddH20
PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性2 min; 94°C30s,58°C30s，72°C30s，共20個 循環(huán)；72。C7min; 4°C。
pE/L 、 p7.5及多克隆位點擴(kuò)增片段延伸產(chǎn)物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物BamHI酶切(Takara公司產(chǎn))。轉(zhuǎn)移質(zhì) 粒pSKB8R載體BglII酶切(Takara公司產(chǎn))。用Omega公司E.Z.N.A. Gel Extraction Kit進(jìn)行電泳純化回收.。二者T4DNALigase(Takara公司產(chǎn))連接構(gòu) 建pSKB8RP。
質(zhì)粒pSKB8RP SacII/BamHI酶切，pH6及下游Neo序列PCR擴(kuò)增片段(如前) 用SacII/BamHI酶切(Takara公司產(chǎn))，二者T4DNALigase連接構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pSKB8RPNeo。圖5。
實施例二 B8R基因缺失為lacZ所取代的重組病毒VTTAB8RlacZ的構(gòu)建。 圖6。
將痘苗病毒天壇株VTT與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞進(jìn)行同源 重組，經(jīng)藍(lán)白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的 重組病毒VTT厶B8RlacZ。以0.1 0.01PFU/cell病毒量VTT752-l感染80。/。成 片CEF細(xì)胞吸附l 1.5h后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)(參照美國INVITROGEN 公司Lipofectin試劑盒)將重組質(zhì)粒pSKB8RLacZ轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞中。48小時 后收獲重組病毒液，用含200 )ig/mlX-gal營養(yǎng)瓊脂鋪斑，隨機(jī)挑取孤立藍(lán) 斑病毒，連續(xù)單斑純化5代，以待鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的重 組病毒VTTAB8RlacZ。
提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及DOTBLOT鑒定、檢測重組病毒B8R基因缺失 的穩(wěn)定性，表明VTTAB8RlacZ在CEF細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因缺失穩(wěn)定。VTTAB8RlacZ在CEF細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代插入外源基因lacZ穩(wěn) 定表達(dá)。VTTAB8RlacZ在CEF細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代，VTTAB8RlacZ傳 代第5、 15代分別感染CEF細(xì)胞，檢測其樣品中(3-半乳糖苷酶活性，同時設(shè) 立VTT感染細(xì)胞對照。第5代J3-半乳糖苷酶活測定OD420nJl為3.027，第15 代0042。肌值為2.819。 VTT感染細(xì)胞對照OD42Q肌值為0.04。結(jié)果表明 VTTAB8RlacZ在CEF細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代插入外源基即acZ穩(wěn)定表達(dá).(圖 7，圖8)和表l。
表l
5passegeVTTAB8尺lacZ15passegeVTT厶B8RlacZVTT
0.D420nm3.0272.8190.04
重組缺失病毒VTTAB8RlacZ在CEF、 TK'143、 CV-1細(xì)胞中的繁殖生長曲 線測定，結(jié)果表明VTTAB8RlacZ的生長曲線與VTT生長曲線相似(圖90。 B8R基因缺失對重組缺失病毒在細(xì)胞中的繁殖復(fù)制沒有影響。兔皮內(nèi)毒力 實驗表明VTT752-l形成紅腫痘皰面積顯著大于VTTAB8RlacZ形成痘皰， VTT752-1形成紅腫痘皰而后出現(xiàn)潰破接痂，VTTAB8RlacZ形成痘皰無潰 破接痂，VTTAB8RlacZ形成痘皰消褪較VTT752-l形成痘皰消褪早。B8R 基因缺失顯著降低痘苗病毒天壇株病毒毒力。見圖IO。
實施例三B8R基因缺失表達(dá)HIV-l抗原的VTKgpe厶B8RlacZ (B8R基因 缺失為lacZ所取代，TK區(qū)插入B，/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因)
的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病疫苗。
即將VTKgpe (TK區(qū)插入B7C型CN54株HIV-1 gagpol env基因的天壇株 重組痘苗病毒)與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞進(jìn)行同源重組,經(jīng) 藍(lán)白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失為IacZ所取代的重組病 毒VTKgpeAB8RlacZ 。以0.1 ~0.01 PFU/cel1病毒量VTKgpe感染80%成片 CEF細(xì)胞吸附l 1.5h后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)(參照美國INVITROGEN公 司Lipofectin試劑盒)將重組質(zhì)粒pSKB8RLacZ轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞中。48小時后收獲重組病毒液，用含200嗎/ml X-gal營養(yǎng)瓊脂鋪斑，隨機(jī)挑取孤立藍(lán)斑 病毒，連續(xù)單斑純化5代，以待鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的重組 病毒VTKgpeAB8RlacZ
提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及DOTBLOT鑒定、檢測重組病毒B8R基因缺失 的穩(wěn)定性，表明VTKgpeAB8RlacZ在CEF細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因 缺失穩(wěn)定。VTKgpeAB8RlacZ在CEF細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代插入外源基 因gagpol env禾急定表達(dá)。
實施例四B8R基因缺失、表達(dá)HIV-l抗原的VTKgpeAB8R (B8R基因缺 失不帶lacZ選擇標(biāo)記，TK區(qū)插入B，/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因)
的天壇株重組痘苗病毒的艾滋病疫苗。
再以VTKgpeAB8RlacZ為親本株與pSKB8RNeo共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞進(jìn)行同源 重組,經(jīng)G418壓力篩選、藍(lán)白斑篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺 失不帶lacZ選擇標(biāo)記的重組病毒VTKgpeAB8R。以0.1 0.01PFU/cell病毒量 VTKgpeAB8RlacZ感染8(P/。成片CEF細(xì)胞吸附l 1.5h后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 技術(shù)(參照美國INVITROGEN公司Lipofectin試劑盒)將重組質(zhì)粒 pSKB8RNeo轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞中。48小時后收獲重組病毒液，以400ug/mlG418 壓傳三代。用含200昭/mlX-gal營養(yǎng)瓊脂鋪斑，隨機(jī)挑取孤立白斑病毒， 連續(xù)單斑純化5代，以待鑒定獲得B8R基因缺失不帶lacZ選擇標(biāo)記的重組病 毒VTKgpeAB8R。
提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及DOTBLOT鑒定、檢測重組病毒B8R基因缺失 的穩(wěn)定性，表明VTKgpe厶B8R在CEF細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因缺失 穩(wěn)定。VTKgpeAB8R在CEF細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代插入外源基因gagpo1 env禾急定表達(dá)。
裸鼠毒力實驗表明VTKgpeAB8R毒力較VTKgpe顯著降低，腹腔接種VTT (104pfii)及VTKgpe (1()6pfii)15天裸鼠死亡，接種VTKgpeAB8R(l()7pfij)裸 鼠存活(表2)。胞內(nèi)IFN-Y.染色流式細(xì)胞儀分析、T淋巴細(xì)胞增殖、CTL 檢測顯示B8R基因缺失顯著提高表達(dá)HIV-1基因的天壇株重組痘苗病毒特 異性細(xì)胞免疫(圖n， 14， 15)。表2
VirusDose (pfu>Number of death
VTT1020/4
1031/4
1044/4
VTKgpe1040/4
1050/4
1063/4
VTKgpe厶B服1050/4
1060/4
1070/4
實施例五PCR擴(kuò)增檢測重組病毒VTKgpeAB8R B8R基因缺失。Western blot檢測VTKgpeAB8R傳代15代插入外源基因gagpo1 env穩(wěn)定表達(dá)
提取重組病毒DNA為模板,以引物B8RLF、 B8RRR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。重組病 毒VTKgpeAB8R由于B8R基因缺失，PCR擴(kuò)增出1244 bp片段，包括B8R基 因外左側(cè)同源序列B8RL片段583bp、右側(cè)同源序列B8RR片段661 bp。而 對照VTTDNA為模板擴(kuò)增出2Kb片段，包括B8R基因外左側(cè)同源序列B8RL 片段583 bp、 B8R基因818bp、右側(cè)同源序列B8RR片段661 bp (圖ll)。 結(jié)果表明VTKgpeAB8R在CEF細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因穩(wěn)定缺失。 Dot Blot檢測病毒VTKgpeAB8R基因組中B8R基因，提取痘苗病毒 VTT752-lDNA及重組病毒VTKgpeAB8R傳代15代DNA，以B8R基因地高 辛標(biāo)記探針進(jìn)行Dot Blot檢測。VTT752-lDot Blot結(jié)果顯示雜交印跡斑 點，VTKgpeAB8R傳代15代Dot Blot結(jié)果未顯示雜交印跡斑點，表明 VTKgpeAB8R在CEF細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代15代B8R基因穩(wěn)定缺失。見圖12。 VTKgpeAB8R感染CEF細(xì)胞，48小時后收獲細(xì)胞和上清，以人多抗血清 (美國國立衛(wèi)生研究院艾滋病研究和參比試劑項目提供)進(jìn)行Westem
17Blot分析，出現(xiàn)了特異的反應(yīng)條帶(gpl40,p55)說明所構(gòu)建的疫苗可以正確 的表達(dá)目的基因(圖16)。
實施例六、重組痘苗病毒艾滋病疫苗的效果實驗
本例中使用無菌飼養(yǎng)的6 —8周齡BALB/c(H-2d)雌性小鼠(體重19一25 克，購自中國藥品生物制品檢定所)檢測本發(fā)明疫苗的效力。各DNA疫苗 用lxPBS制備成lmg/ml的注射液。每種免疫組含10只小鼠。免疫前24小時 每只小鼠左右后肢脛骨前肌各注射50ul 25% (w/v)蔗糖高滲溶液以增加 肌肉細(xì)胞的通透性，提高攝取質(zhì)粒效率，同時，蔗糖還有一定的佐劑的作 用。蔗糖處理24小時后，脛骨前肌注射DNA 100ug/只(每后肢50ug)。每 間隔2周以同樣劑量加強(qiáng)免疫3次。第6周時1， 2組分別用VTKgpeAB8R 、 VTKgpe重組痘苗病毒加強(qiáng)，1(^pfti/鼠。第4,6周時3，4組分別用 VTKgpeAB8R 、 VTKgpe重組痘苗病毒免疫，1(fpfU/鼠。在第9周時取血 清及脾淋巴細(xì)胞檢測抗體以及細(xì)胞因子。對照使用pCDN A空載體、不插 入目的基因的痘苗病毒天壇株(天花疫苗，由北京生物制品所惠贈)以及 空白鼠對照(表3)。
表3
0 week2 week4 week6 week
DNA+ VTKgpeAB8RpcDNA-syngag, pcDNA-ngp120pcDNA陽syngag, pcDNA-ngp120pcDNA-syngag, pcDNA-ngp120VTKgpe厶B8R
VTKgpeAB服VTKgpeAB8RVTKgpe厶B8R
DNA+ VTKgpepcDNA-syngag, pcDNA，120pcDNA-syngag, pcDNA-ngp120pcDNA-syngag, pcDNA-ngp120VTKgpe
VTKgpeVTKgpeVTKgpe
VTTVTTVTT
DNA+VTTpcDNApcDNApcDNAVTT
18相關(guān)實驗及結(jié)果如下-
1、血清Gag特異性抗體IgG水平的檢測
為檢測不同重組痘苗病毒單獨(dú)免疫和加強(qiáng)免疫所誘導(dǎo)的特異性體液
免疫水平，在第四次免疫后兩周及取小鼠血清，用GagP55抗原(美國國立 衛(wèi)生研究院艾滋病研究和參比試劑項目惠贈)包被酶標(biāo)板，間接ELISA法進(jìn) 行Gag特異性IgG抗體水平的檢測。各免疫組Gag特異性IgG抗體滴度列于 表4。
表4
DNA + VTKgpeDNA + VTKgpAB8RVTKgAB8RVTKgpe
3 week35481316222560021134
4 week31622512002560025600
2、流式細(xì)胞儀檢測體外抗原表位肽剌激后分泌1 1^1的€08+ T淋巴細(xì)胞 CD8+T淋巴細(xì)胞是一種最重要的抗病毒效應(yīng)細(xì)胞，所以檢測了免疫后 脾淋巴細(xì)胞中分泌IFN-Y的HIV-1特異性CD8+ T淋巴細(xì)胞。脾淋巴細(xì)胞用 MHC-I限制性HIV (gag p24(AMQILKDTI), V3(SIRIGPGQTF YATGD ) and pol (NPDIVIYQYMDDLYVGSDL， YMDDLYVGSDLEIGQHRTK, KEPPFLWMGY ELHPDKWTV )刺激12小時后，對細(xì)胞內(nèi)IFN-Y和CD8， CD3分子進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特公司產(chǎn)品)進(jìn)行分析。 DNA + VTKgpeAB8R免疫組小鼠脾細(xì)胞T淋巴細(xì)胞，分泌圧^丫的€08+ T 淋巴細(xì)胞占脾臟總CD8+T淋巴細(xì)胞的百分比數(shù)顯著高于DNA +VTKgpe免 疫組。VTKgpeAB服免疫組小鼠脾細(xì)胞分泌IFNi.CD8百分比數(shù)顯著高于 VTKgpe免疫組。
實施例七、B8R基因缺失、表達(dá)乙型肝炎病毒HBSAg抗原，IL-2的(B8R 基因缺失插入HBSAg抗原，TK區(qū)插入IL-2基因)的天壇株重組痘苗病毒 的乙型肝炎病疫苗的構(gòu)建。
構(gòu)建過程將重組痘苗病毒VTKIL-2 ( TK區(qū)插入IL-2基因)與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞進(jìn)行同源重組，經(jīng)藍(lán)白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失為lacZ所取代的重組病毒VTKIL-2AB8RlacZ。將HBSAg基因插入轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PSKB8RPNeo中(PSKB8RPNeoSaLI酶切補(bǔ)平，T4DNA連接酶連接HBSAg基因與PSKB8RPNeo)構(gòu)建質(zhì)粒PSKB8RPSNeo，HBSAg基因置于轉(zhuǎn)移質(zhì)粒痘苗病毒啟動子下。將VTKIL-2AB8RlacZ與PSKB8RPSNeo共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞進(jìn)行同源重組,經(jīng)藍(lán)白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因，缺失lacZ為HBSAg基因所取代的重組病毒VTKIL-2AB8RS。具體方法參見前述的方法。
權(quán)利要求
1.一種天壇株重組痘苗病毒減毒載體，其是B8R基因缺失的天壇株重組痘苗病毒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其中缺失的B8R基因為lacZ所取代。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其為天壇株重組痘苗病毒 VTTAB8RlacZ，其構(gòu)建方法包括以下步驟構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ; 將痘苗病毒天壇株VTT與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞進(jìn)行同 源重組，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因缺失且為lacZ 所取代的天壇株重組痘苗病毒減毒載體VTTAB8RlacZ。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其中轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ是在質(zhì)粒 pBR-SK中插入B8R基因左側(cè)同源序列B8RL片段、右側(cè)同源序列B8RR 片段、痘苗病毒啟動子序列pE/L、 p7.5以及LacZ基因序列得到的。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其中轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ中的痘苗 病毒啟動子序列pE/L、 p7.5及下游LacZ序列來源于pSC65， pSC65的保 藏號是CGMCCNo.1097。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其為VTTAB8R。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項所述的載體在制備重組痘苗病毒疫苗中 的應(yīng)用。
8. —種天壇株重組痘苗病毒艾滋病疫苗，其是通過在根據(jù)權(quán)利要求1 至6任一項所述的載體中表達(dá)HIV-1抗原而獲得的。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的艾滋病疫苗，其中所述HIV-1抗原是單價或 多價的。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的艾滋病疫苗，其中所述HIV-1抗原是HIV-1 gagpol禾口 env基因。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8至io任一項所述的艾滋病疫苗，其中所述mv-i抗原是插入TK區(qū)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的艾滋病疫苗，其為重組痘苗病毒 VTKgpeAB8RlacZ，其構(gòu)建方法包括以下步驟轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RLacZ 與TK區(qū)插入HIV-1 CN54株gagpol和env基因的天壇株重組痘苗病毒VTKgpe進(jìn)行同源重組，經(jīng)藍(lán)白篩選、連續(xù)單斑純化、鑒定獲得B8R基因 缺失為lacZ所取代的重組痘苗病毒VTKgpeAB8RlacZ。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的艾滋病疫苗，其為重組痘苗病毒 VTKgpeAB8R，其構(gòu)建方法包括以下步驟轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RNeo與權(quán)利 要求12所述的重組病毒VTKgpeAB8RlacZ再次同源重組，獲得B8R基 因缺失不帶lacZ選擇標(biāo)記，TK區(qū)插入HIV-1CN54株gagpol和env基因 的天壇株重組痘苗病毒艾滋病疫苗VTKgpeAB8R。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的艾滋病疫苗，其中轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSKB8RNeo 是在pBR-SK中插入左側(cè)同源序列B8RL片段、右側(cè)同源序列B8RR片段, 并在同源序列外側(cè)插入痘苗病毒啟動子序列pH6及Neo基因序列的一種 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。
15. 根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一項所述的艾滋病疫苗，其中VTKgpe 的保藏號為CGMCCNo. 1099。
16. —種天壇株重組痘苗病毒疫苗，其是通過在根據(jù)權(quán)利要求1至6 任一項所述的載體中表達(dá)外源基因而獲得的。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的疫苗，其中所述外源基因是病毒抗原基因。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的疫苗，其中在B8R基因缺失區(qū)插入外源 基因。
19. 根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項所述的疫苗，其中所述病毒抗原 是單價或多價的。
20. —種天壇株重組痘苗病毒乙型肝炎病疫苗，其是通過在根據(jù)權(quán)利 要求1至6任一項所述的載體中表達(dá)乙型肝炎病毒抗原而獲得的。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的乙型肝炎病疫苗，其中所述乙型肝炎病毒 抗原是HBSAg。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的乙型肝炎病疫苗，其中缺失的B8R 基因為HBSAg基因所取代。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的乙型肝炎病疫苗，其中在TK區(qū)插入IL-2基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及IFN-γ受體基因(B8R)缺失的天壇株重組痘苗病毒減毒載體以及基于此載體構(gòu)建的表達(dá)HIV-1各種抗原(單價及多價)的IFN-γ受體基因(B8R)缺失的天壇株重組痘苗病毒艾滋病疫苗，一種天壇株重組痘苗病毒recombinant vaccinia virius VTKgpe毒recombinant vacciniavirus VTKgpe CGMCC.NO.1099和另外一種乙型肝炎病毒HBSAg抗原，IL-2的天壇株重組痘苗病毒的乙型肝炎病疫苗。本發(fā)明在制備治療病毒病的重組痘苗病毒疫苗藥物中的應(yīng)用有著重要的意義。
文檔編號A61K39/275GK101671695SQ20091015778
公開日2010年3月17日 申請日期2004年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月10日
發(fā)明者穎 劉, 邵一鳴, 薇 黃 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心