專利名稱：：雞球蟲散及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗雞球蟲病的雞球蟲散及其制備方法。
背景技術(shù)：
：雞球蟲病是病原為艾美耳科的原蟲寄生蟲病，雞球蟲主要寄生于雞腸道,部分球蟲寄生于雞肝臟。球蟲發(fā)病以多種類型的球蟲亂囊混合感染，及與其他疾病混合感染，誘發(fā)其他疾病為特征；球蟲亂囊具有高濃度耐藥性，交叉耐藥性、多重耐藥性等特點(diǎn)(參看2009年第03期《中國禽業(yè)導(dǎo)刊》中的"雞球蟲病難控制的原因及對策")。球蟲病的發(fā)生導(dǎo)致腸道出血，腸粘膜損傷，輕者導(dǎo)致雞營養(yǎng)不良，生長緩慢，重者導(dǎo)致雞的死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的損失。目前雞球蟲病主要以預(yù)防為主，其中主要以化學(xué)藥物為主，但化學(xué)藥物長期添加具有肝臟和腸毒性，并且容易產(chǎn)生耐藥性，也給食品業(yè)帶來嚴(yán)重的藥殘，毒素殘留等食品安全隱患；由于球蟲的生活史比較復(fù)雜，不同時(shí)期具有不同的抗原，因此沒有球蟲亞單位疫苗，其弱毒苗容易反強(qiáng)，有潛在的危害(參看2006年第11期《家禽科學(xué)》中的"雞球蟲病藥物防治存在的問題及對策")。中草藥往往含有多種有效成分，由多種中草藥原料制作的中藥的成分更加復(fù)雜，是名符其實(shí)的聯(lián)合用藥，可以解決使用化學(xué)藥物易產(chǎn)生耐藥性的缺陷，又中草藥為純天然物質(zhì)，經(jīng)精選組方的中藥抗球蟲紅物的安全性高。目前含有青蒿素(青蒿中的主要成分青蒿素有強(qiáng)力抗原蟲作用)的用于抗雞球蟲的中藥，存在以下局限性產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、高溫下不不穩(wěn)定(青蒿素具有熱不穩(wěn)定性，6(TC以上就分解)，而飼料制粒時(shí)的溫度在卯。C左右，所以導(dǎo)致該類產(chǎn)品中的青蒿素含量大大降低，用藥量大(在詞料中的添加比例為12%)，用藥成本高的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種毒性小、抗球蟲指數(shù)高、用藥成本低的抗雞球蟲病的雞球蟲散及其制備方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明所述雞球蟲散包含下列重量配比的原料藥青蒿300800份、常山100200份、馬鞭草100400份、滑石粉50100份、苦參50100份、e—環(huán)糊精2464份。優(yōu)選的，所述原料藥的重量配比為青蒿400份、常山200份、馬鞭草200份、滑石粉100份、苦參100份、環(huán)糊精64份。本發(fā)明所述雞球蟲散的制備方法是按以下步驟進(jìn)行的(1)取所述重量配比的常山、馬鞭草、苦參用600目篩進(jìn)行超微粉碎，備用；(2)取所述重量配比的青蒿干燥莖葉碎成粗粉，加入35倍石油醚回流提取4次，每次1小時(shí)，趁熱濾過，合并濾液，減壓回流石油醚至浸膏，浸膏加510倍量的70%乙醇熱溶，2.5%活性炭回流脫色l小時(shí)，濃縮至浸膏，在60'C下干燥得青蒿素；粉碎后以青蒿素與丙酮的重量配比為l:60的比例與丙酮混合；然后勻速逐滴加入到轉(zhuǎn)速為500r/m的飽和e—環(huán)糊精中，青蒿素與環(huán)糊精的摩爾比為l:1,加完后攪拌48小時(shí)，放入4'C冰箱冷藏，析出結(jié)晶；抽濾；沉淀物用純化水洗滌3次，以除去殘留主體，于干燥箱中6(TC干燥2小時(shí)即得青篙素一P—CD包合物；(3)將步驟(l)、(2)所得粉末與所述重量配比的滑石粉混勻包裝即可。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所述雞球蟲散的內(nèi)容物主要由青蒿、常山、馬鞭草、滑石粉、苦參、e—環(huán)糊精等做原料藥制成，其中青蒿含有青蒿素，青蒿素有強(qiáng)力的抗原蟲、清熱涼血作用，常山含有常山堿，對雞瘧有顯著療效，馬鞭草含有馬鞭草甙，有清熱解毒、截瘧殺蟲作用，苦參含有苦參堿，具有清熱燥濕、祛風(fēng)殺蟲的作用，滑石粉具有清熱解暑、祛濕斂瘡作用，因此本發(fā)明產(chǎn)品具有清熱祛濕、殺球蟲、抗菌、促生長的功效，對雞球蟲病具有良好的預(yù)防作用，且毒性小，特別適用于雞球蟲??；制作中青蒿素被環(huán)糊精包被，高溫加速試驗(yàn)后，其有效成分沒有下降，具有光、熱穩(wěn)定性，因此產(chǎn)品在飼料中的添加量小(在飼料中的添加比例為為0.05%),抗球蟲指數(shù)高、用藥成本低。以下通過實(shí)驗(yàn)來闡述本發(fā)明所述雞球蟲散的有益效果試驗(yàn)例一、雞球蟲散的主要藥效學(xué)試驗(yàn)摘要實(shí)驗(yàn)選用嶺南黃快大雞進(jìn)行了飼料添加球蟲攻毒試驗(yàn)、球蟲的抗藥性試驗(yàn)、雞的生產(chǎn)性能試驗(yàn)和免疫水平試驗(yàn)。選用羅氏308進(jìn)行了飼料添加球蟲攻毒試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明該雞球蟲散對嶺南黃快大雞和羅氏308的抗球蟲指數(shù)均為有效；攻毒球蟲無抗藥性；嶺南黃快大雞生產(chǎn)性能與對照組相比有顯著提高(p〈0.05)，雞球蟲散對雞的臟器無任何不良影響。試驗(yàn)?zāi)康牟捎脴?biāo)準(zhǔn)的球蟲卵囊攻毒試驗(yàn)，和生產(chǎn)性能試驗(yàn)，以ACI和抗藥性、生產(chǎn)性能為指標(biāo)確定雞球蟲散的抗球蟲病的能力和球蟲對該藥的敏感性，以證實(shí)該藥的抗球蟲能力、提高生產(chǎn)性能的能力以及對腸道的無害化。。1雞球蟲散抗雞球蟲的效果1.1試驗(yàn)材料l丄l試驗(yàn)藥物受試藥物復(fù)方中草藥添加劑超微粉(按照本發(fā)明申請中實(shí)施例1所述配方配制的雞球蟲散，由本公司配制)；陽性抗球蟲對照藥物癸氧喹酯、鹽霉素、二硝托胺(由珠海溢盛飼料有限公司提供)試驗(yàn)動(dòng)物240羽1日齡羅氏308(東莞正大提供)；1500羽1日齡嶺南黃快大雞(由佛山高明種雞場提供)主要儀器顯微鏡，細(xì)胞計(jì)數(shù)器，電子天平，電子秤1.2試驗(yàn)方法與結(jié)果1.2.1動(dòng)物分組與給藥180只一日齡的羅氏308(東莞正大)，經(jīng)檢測無球蟲，于12日齡時(shí)，選出144只體重相近的雞(265±10)g，隨機(jī)分為8組，(不感染不用藥，感染不用藥，陽性藥及受試藥組)；每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4只。其其試驗(yàn)分組及飼喂飼料種類如下表所示(見下表)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>1.2.2實(shí)驗(yàn)步驟將雞按照常規(guī)生產(chǎn)管理，自由采食(第12日齡起用各組配制雞飼料)，飲水，網(wǎng)上養(yǎng)殖，并于第5日齡滴鼻免疫新支、法氏囊三聯(lián)苗，1.5頭份/羽；第11日齡注射免疫禽流感1頭份/羽。12日齡時(shí)，除空白組外按照預(yù)試劑量進(jìn)行攻毒(每羽經(jīng)口人工感染1.0X103個(gè)艾美爾球蟲孢子化卵囊)，于20日齡稱重，解剖對腸道病變進(jìn)行記分，于第19天收集糞便進(jìn)行球蟲計(jì)數(shù)。1.2.3實(shí)驗(yàn)指標(biāo)于第1220日齡早上空腹重，記錄實(shí)驗(yàn)期間死亡率，所有宰殺的雞均進(jìn)行腸道病變記分，第19天收集糞便進(jìn)行球蟲計(jì)數(shù)，宰殺時(shí)的重量。1.5藥效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)藥效評價(jià)指標(biāo)用下列公式計(jì)算。死亡率=(每組因感染球蟲致死的雞數(shù)/組內(nèi)雞總數(shù))X100%增重率=(每個(gè)感染組的平均增重/不感染不給要組的平均增重)X100%病變記分參照J(rèn)ohnson等的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)剖檢后腸道病變的嚴(yán)重程度分別計(jì)分。病變值參照MerckSharp的標(biāo)準(zhǔn)，即每組實(shí)驗(yàn)雞的病變記分的平均數(shù)X10。卵囊計(jì)數(shù)由每組在感染卵囊后第7天排泄的糞便中，分多點(diǎn)選取新鮮糞便各5克，然后加10ml生理鹽水，用研缽輕輕研磨幾下，然后加入10ml生理鹽水，放入帶刻度試管中沉積30分鐘，根據(jù)沉積物的體積調(diào)節(jié)生理鹽水的量，使其比例為1:2，然后加入飽和食鹽水，使其做IO倍稀釋，混勻后用McMaster計(jì)數(shù)室，隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察計(jì)數(shù)，最后求平均值。卵囊比值=(健康組或試驗(yàn)組卵囊數(shù)/感染不給藥組的卵囊數(shù))X100%卵囊值參照角田青的標(biāo)準(zhǔn)，即卵囊比數(shù)為01%時(shí)，卵囊值為0，2%~25%時(shí)為5，26%~50%時(shí)為10，51%~75%時(shí)為10，76%100%時(shí)為40。抗球蟲指數(shù)(ACI):采用merek公司的標(biāo)準(zhǔn)，即抗球蟲指數(shù)=(增重百分率+存活率)-(病變值+卵囊值)。如ACI《120為無效；；ACI在120-160為中等有效；ACI在160-180為良好；ACI>180為優(yōu)秀。同時(shí)抗藥性的判斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)孔繁瑤報(bào)道，以最適抗球蟲活性百分率(POAA)、病變記分減少率(RLS)、計(jì)算相對卵囊產(chǎn)量(ROP)值3項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)判斷球蟲對藥物的抗藥性。POAA-(感染用藥組GSR-感染不用組GSR)/(不感染不用藥組GSR-感染不用藥組GSR)xi00%。其中GSR=每組平均末重/每組平均初重。POAA《50，有抗藥性；POAA>50，無抗藥性。RLS-(感染不用藥對照組平均病變記分-感染用藥組平均病變記分)/(感染不用藥對照組平均病變記分)xl00%。RLS》50,無抗藥性；RLS<50，有抗藥性。110=感染用藥組平均卵囊產(chǎn)量/感染不用藥組平均卵囊產(chǎn)量x100。/。。R0P》15,有抗藥性；ROP<15，無抗藥性。1.2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.2.4.1各給藥組抗球蟲的效果的評價(jià)感染不用藥組雞只在接種孢子化卵囊后第3天，出現(xiàn)精神狀態(tài)差，采食量減少。第4天開始出現(xiàn)血便。給藥組中草藥復(fù)方0.05%添加組(超0.05%)和癸氧喹酯組第6天出現(xiàn)血糞；其他組均于第5天開始出現(xiàn)血糞?？骨蛳x藥物的抗球蟲指數(shù)如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從上表可見，在平均增重方面，各感染組與不感染組有顯著性差異，中草藥復(fù)方0.05%添加組和癸氧喹酯添加組與感染不用藥組有顯著性差異。在抗球蟲指數(shù)方面，中草藥復(fù)方0.05%添加組藥效在抗球蟲中為優(yōu)秀，癸氧喹酯為良好，其余各用要組具有中等的藥效。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從上表可見，感染球蟲對中草藥復(fù)方0.05%添加組沒有抗藥性，對其他給藥組有部分抗藥性。2雞球蟲散對雞生產(chǎn)性能的影響2.1試驗(yàn)材料2丄1受試藥物復(fù)方中草藥添加劑超微粉(按照本發(fā)明申請中實(shí)施例1所述配方配制的雞球蟲散，由本公司配制)；陽性抗球蟲對照藥物奎氧喹酯、鹽霉素、二硝托胺(由珠海溢盛飼料有限公司提供)。2丄2試驗(yàn)動(dòng)物1260羽快大型一日齡三黃快大雞，體重(34+3)g，由佛山高明種雞場提供。2丄3試驗(yàn)主要儀器電子天平，電子秤。2.2試驗(yàn)方法與結(jié)果2.2.1動(dòng)物分組與給藥1260羽快大型一日齡三黃快大雞(由佛山高明種雞場提供)，均只體重(34+3)g，隨機(jī)分為7個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30羽雞。試驗(yàn)期為7周，分為二個(gè)階段(0-3周和4-7周)其試驗(yàn)分組及飼喂飼料種類如下表所示實(shí)驗(yàn)分組及藥物添加劑量組別飼料種類復(fù)方中草藥添加劑超微粉復(fù)方中草藥添加劑超微粉0.05%+基礎(chǔ)曰糧癸氧喹酯癸氧喹酯0.0003%+基礎(chǔ)日糧鹽霉素鹽霉素0.006%+基礎(chǔ)日糧二硝托胺球痢靈0.0125%+基礎(chǔ)日糧正常對照基礎(chǔ)日糧2.2.2試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧如下表試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧配方原料基礎(chǔ)日糧營養(yǎng)價(jià)值小雞料中大雞料項(xiàng)目小雞料中大雞料玉米5565代謝能28503150豆粕28.519粗蛋白2117.5次粉52.5鈣10.8玉米蛋白粉35總磷0.750.5進(jìn)口魚粉(62)42賴氨酸1.150.95豬油0.53.20.250,25食鹽0.150.2蛋氨酸0.50.45磷酸氫鈣1.50.65白石粉11賴氨酸0.20.3蛋氨酸0.150.15預(yù)混料11<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注預(yù)混料可為每千克配合飼料提供VA1800IU;VD34000IU;VE40mg;VK38mg;VB14mg;VB212mg;VB68mg;VB1240mg;鹽酸80mg;泛酸24mg;葉酸2mg;生物素0.2mg;鐵30mg;銅6mg;鋅50mg;錳60mg;碘0.3mg;中大雞料添加植酸酶100克。2.2.3飼養(yǎng)管理與免疫程序用籠養(yǎng)育雛，大生產(chǎn)管理方式管理，自由采食、飲水，注意做好保溫、通風(fēng)和及時(shí)清理糞便。按如下的免疫程序接種2.2.4測定項(xiàng)目2.2.4.1生產(chǎn)性能的影響(日增重、采食量、料肉比、成活率)每日記錄投料量及余料，計(jì)算日采食量，每試驗(yàn)階段始末(1、22、49日齡時(shí))以重復(fù)為單位于清晨空腹進(jìn)行稱重，并記錄雞死亡情況，計(jì)算平均日增重、料重比、發(fā)病率、死亡率。2.2.4.2雞球蟲散對臟器的影響于52日齡時(shí)進(jìn)行每個(gè)重復(fù)殺一羽盡心病理解剖，觀察抗球蟲藥物對各個(gè)臟器的損傷。2.2.5統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS11.5軟件的單因素方差分析進(jìn)行分析，以P<0.05表示顯著性水平。2.2.6試驗(yàn)結(jié)果2.2.6.1雞球蟲散對雞生產(chǎn)性能的影響組別超0.05%癸氧喹酯鹽霉素二硝托胺正常對照采食量(g)33.84±0.7233.0±0.4233.29±0.6232.5±0.3532.5±0.70o日增重(g)20.15±0.2719.7±0.4519.82±0.4618.4±0.2019.6±0.54周料肉比％1.68±0.031.67±0.031.68±0.011.77±0.011.66±0.07成活率o/。1.51±0.131.51±0.131.51±0.131.57±01.27±0.20采食量(g)96.57±0.2087.9±0.2889.46±0.1186.5±0.25狄9±0.4310<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>雞球蟲散0.05。/。添加組的全期日均只增重為33g，與正常對照組31.4g及其他給藥組有顯著性差異。3.雞球蟲散對雞臟器的影響52日齡解剖，發(fā)現(xiàn)陽性對照給藥組特別是癸氧喹酯組，其肝臟淤血，呈黑色，整個(gè)腸道嚴(yán)重出血，腫脹甚至壞死。其他給藥組與正常組無此病變。結(jié)語雞球蟲散的抗球蟲指數(shù)為182.52，為優(yōu)秀的抗球蟲效果藥，球蟲對其無抗藥性，其具有增加雞平均日增重的作用，對其他生產(chǎn)性能無不良影響，對臟器無不良影響，因此相對其他藥物而言，雞球蟲散具有抗球蟲能力，對動(dòng)物沒有應(yīng)急作用。試驗(yàn)例二急性毒性試驗(yàn)摘要觀察雞球蟲散口服給藥途徑，測定雞球蟲散最大給藥量試驗(yàn)。結(jié)果表明小鼠口服雞球蟲散水混懸液，最大給藥量為生藥15000.0mg/kg，相當(dāng)于用量的50倍用量，小白鼠仍未出現(xiàn)死亡，表明中藥粉劑雞球蟲散對小白鼠經(jīng)口LD5O15000.0mg/kg。試驗(yàn)?zāi)康挠^察雞球蟲散口服給予動(dòng)物后，所產(chǎn)生的毒性反映及死亡情況，或最大給藥劑量，或推算臨床雞用量安全倍數(shù)，綜合評價(jià)該藥的安全性。l.材料與方法1.1藥物復(fù)方中草藥添加劑超微粉(按照本發(fā)明中實(shí)施例1所述配方配制的雞球蟲散)，500g袋裝，批號(hào)20080302，由廣東溢多利生物科技股份有限公司提供。1.2動(dòng)物小白鼠60只，昆明種，雌雄各半，體重均為1822g。由廣州軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.3分組與藥物配制小白鼠購回后正常飼養(yǎng)觀察3d，隨機(jī)分為6組，每組10只。先制備0.2%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液，按1:K稀釋法制成5種濃度的雞球蟲散混懸液，最高藥物濃度為25%(取雞球蟲散中藥粉與0.2%CMC-Na溶液按1:3混合研磨而成)，組間濃度劑量比為1:1.2。1.4半數(shù)致死量(LD50)測定小白鼠灌胃給藥前禁食6h。在24h內(nèi)給藥3次，每次間隔6h，每次灌胃量為0.2mL/10g體重，最高單次劑量為5000mg/kg。第6組為混懸液溶媒CMC-Na溶液的對照組。給藥后按正常飼養(yǎng)并連續(xù)7d觀察其中毒情況和動(dòng)物死亡數(shù)。按簡化寇氏法計(jì)算LD50及其95%可信限。2.結(jié)果2.1小白鼠在24h內(nèi)給藥3次后連續(xù)7d的觀察期內(nèi)，所有小白鼠均未出現(xiàn)明顯的中毒癥狀，也未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。2.2各組動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)觀察情況見下表急性毒性試驗(yàn)結(jié)果組別單劑量(mg/kg)3次總劑量(mg/kg)動(dòng)物數(shù)死亡數(shù)死亡率12411.37233.9100022893.58680.5100033472.210416.6100044166.712500100055000.015000100060010002.3由上表可以看出，當(dāng)給藥總劑量達(dá)到15000.0mg/kg時(shí)，小白鼠仍未出現(xiàn)死亡，表明中藥粉劑雞球蟲散對小白鼠經(jīng)口LD50>15000.0mg/kg。3.結(jié)論根據(jù)毒理學(xué)試驗(yàn)原則，當(dāng)受試物的一般急性毒性試驗(yàn)的LD5O10000.0mg/kg時(shí)，可不必再進(jìn)行其他毒性試驗(yàn)。按聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織(WHO)的五級標(biāo)準(zhǔn)和我國有關(guān)急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，中藥粉劑雞球蟲散對小白鼠經(jīng)口LD50>15000.0mg/kg，表明雞球蟲散屬于微毒級(實(shí)際無毒級)物質(zhì)。試驗(yàn)例三、雞球蟲散長期毒性試驗(yàn)資料摘要大鼠連續(xù)給生藥于0.05%、0.5%和1%高、中、低三種劑量，分別為正常用量的l、5、IO倍的雞球蟲散灌胃12周，停藥兩周；三種劑量的給藥組與給予蒸餾水灌胃的正常組比較，各組大鼠進(jìn)食量、體重均逐日增長，無明顯差異；各組大鼠行為、活動(dòng)、皮毛、大小便、血液細(xì)胞、血液生化(肝、腎功能)無異常變化。各組大鼠主要器官心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺及性腺器官等，病理組織檢査未見異常。1目的觀察較大劑量、較長時(shí)間給予大鼠重復(fù)灌胃雞球蟲散12周，對大鼠產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，嚴(yán)重程度及首先出現(xiàn)的癥狀，毒性反應(yīng)的靶器官及恢復(fù)和發(fā)展的情況，確定無毒反應(yīng)劑量，為臨床最大用藥劑量提供依據(jù)。2材料與方法2.1藥物和儀器受試藥物雞球蟲散(按照本發(fā)明中實(shí)施例1所述配方配制的雞球蟲散)，由廣東溢多利生物科技股份有限公司提供。電子天平、全自動(dòng)血液學(xué)分析儀、全自動(dòng)血液生化分析儀、生物顯微鏡等由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院提供使用。2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組大(白)鼠，SD系，共選擇80只，體重為87.7±3.8g，雌雄各半，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，購買后正常飼養(yǎng)一周，在觀察健康后進(jìn)行試驗(yàn)用。將大鼠隨機(jī)分為4組，每組20只(每組雌雄各10只)，分籠飼養(yǎng)。第l組設(shè)為空白對照組(不給藥組)，第2、3、4組分別設(shè)為高、中、低的不同劑量試驗(yàn)組。2.3給藥將"雞球蟲散"中藥散劑分別按0.05%、0.5%和1%三種劑量，分別相當(dāng)于雞推薦使用量的l倍、5倍和10倍，折算成給藥濃度分別為每lkg的鼠料中加入0.5、5g和10g的雞球蟲散。均勻混入基礎(chǔ)鼠料中制成條狀料，空白對照組喂不含藥物的基礎(chǔ)飼料。各組均自由飲用自來水。2.4試驗(yàn)的檢測指標(biāo)在連續(xù)給藥后分別于試驗(yàn)的第30天和第60天，在每組各隨機(jī)抽檢宰殺8只大鼠(公母各4只)，各任取l只為病理組織學(xué)檢査用。2.4.1—般情況觀察每天觀察各組大鼠的一般生活狀況，如采食、飲水是否異常等。在試驗(yàn)的每10天時(shí)，稱取各組大鼠的體重和飼料消耗量，求出詞料利用率。2.4.2器官系數(shù)和含水量取每組8只大鼠的心、肝、脾、肺、腎等五個(gè)器官，用濾紙吸干表面后，稱取器官濕重，求得器官系數(shù)(器官濕重與體重之比)；然后置于9(TC烘箱中烘干至恒重(約34h)，用器官濕重減去干重，得到各器官的含水量。2.4.3血液學(xué)指標(biāo)測定分別采集各組8只大鼠的血液(加入抗凝劑)，利用全自動(dòng)血液學(xué)分析儀測定白細(xì)胞數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、血小板數(shù)(PLT)、血細(xì)胞比容(HCT)、中性粒細(xì)胞數(shù)(MID)和淋巴細(xì)胞數(shù)(LYM)等指標(biāo)。2.4.4血液生化指標(biāo)測定分別采集各組8只大鼠的血液并制備血清，利用全自動(dòng)血液生化分析儀測定天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血蛋白質(zhì)(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、血葡萄糖(GLU)等指標(biāo)。2.4.5病理組織學(xué)檢查在試驗(yàn)第30、60天時(shí)，每組各宰殺8只大鼠，先剖解肉眼觀察，再任取1只大鼠的肝、肺、脾、腎作組織切片，顯微觀察其組織學(xué)變化。2.5數(shù)據(jù)處理用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較試驗(yàn)第30、60天時(shí)各試驗(yàn)組與對照組間各指標(biāo)的差異顯著性。3結(jié)果3.1試驗(yàn)觀察各組大鼠在試驗(yàn)期間的臨床觀察表現(xiàn)為健康，采食、飲水均正常。各試驗(yàn)組與對照組間飼料利用率的差異較小。高、中、低劑量組、對照組的飼料利用率在各期間依次表現(xiàn)為第110天期間公鼠0.333、0.329、0.337、0.340;母鼠0.329、0.334、0.340、0.338。第1120天期間:公鼠0.339、0.342、0.343、0.348;母鼠0.337、0.340、0.341、0.339。第2130天期間公鼠0.199、0.211、0.208、0.214;母鼠0.124、0.135、0.138、0.129。第3140天期間公鼠0.211、0.217、0.220、0.216;母鼠0.149、0.155、0.146、0.151。第4150天期間公鼠0.177、0.182、0.180、0.177;母鼠0.112、0.119、0,120、0.116。第5160天期間公鼠0.127、0.126、0.134、0.126;母鼠0.117、0.113、0.124、0.120。由結(jié)果可見，雖然大鼠在各階段的飼料利用率數(shù)值有變化，這可能是由于各階段生理特點(diǎn)決定的，但各試驗(yàn)期間內(nèi)的各組公母大鼠的詞料利用率均無明顯的差異。3.2器官系數(shù)和器官含水量試驗(yàn)期內(nèi)各組公母大鼠器官系數(shù)和器官含水量的測定結(jié)果見表1和表2。在試驗(yàn)第30天時(shí)，高、中、低劑量組的肝、心、脾、肺、腎的器官系數(shù)和器官含水量出現(xiàn)一定程度或輕度的升高或降低變化，但與對照組比較，均表現(xiàn)差異不顯著(P>0.05)。第60天時(shí)，試驗(yàn)高、中、低劑量組的肝臟器官系數(shù)和含水量與對照組比較時(shí)，均表現(xiàn)一定程度的升高變化，但差異均不顯著(P>0.05)。表l試驗(yàn)第30天和第60天時(shí)各試驗(yàn)組的器官系數(shù)值(》±^，n=8)試驗(yàn)器官對照組低劑量中劑量高劑量天數(shù)(0.5g/kg)(5g/kg)(10g/kg)15<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>和對照組間均無顯著性差異(P>0.05)。第60天時(shí)，血液學(xué)指標(biāo)中的紅細(xì)胞數(shù)(RBC)和血細(xì)胞比容(HCT)在中劑量和高劑量組，與對照組比較均有一定的升高趨勢但差異不顯著(P>0.05)，其它各指標(biāo)在試驗(yàn)組和對照組間均無顯著性差異。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>3.4血液生化指標(biāo)的檢驗(yàn)大白鼠的血液生化指標(biāo)值見表4。在試驗(yàn)第30天時(shí)，各劑量組的ALT(谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶)均表現(xiàn)為輕度降低，但差異不顯著(P〉0.05)。第60天時(shí)，中、低劑量組的尿素氮(BUN)均表現(xiàn)一定的升高，但差異比較不顯著(P>0.05)但高劑量組表現(xiàn)差異顯著(P<0.05)。第30、60天時(shí)血液生化的其它各指標(biāo)均無顯著性變化。表4試驗(yàn)期內(nèi)各試驗(yàn)組的血液生化指標(biāo)(f±s.￡n=8)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注表中同行相同指標(biāo)的數(shù)據(jù)后字母相同(a)表示差異不顯著(P〉0.05),字母不同(b)表示差異顯著(P<0.05),字母不同(c)表示差異極顯著(P<0.01)3.5病理學(xué)檢查肉眼病理學(xué)觀察結(jié)果各組大白鼠各臟器均無異常變化；病理學(xué)切片檢查表明，大白鼠肝臟的肝細(xì)胞在高、中劑量的后期(60天)，出現(xiàn)輕度的腫脹、水泡變性，其它組織與對照組間無明顯差異。4結(jié)論在雞球蟲散對大白鼠的亞急性毒性試驗(yàn)中，大白鼠按0.05%、0.5%和1%三種劑量，即分別為臨床上豬的推薦使用量的1、5和10倍用量，以混飼方式，連續(xù)給藥60天，通過飼料利用率、器官系數(shù)和含水量、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)、病理組織學(xué)檢查等檢測指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果表明中藥制劑"雞球蟲散"對大白鼠的亞急性毒性較小，無明顯的劑量-反應(yīng)和時(shí)間-反應(yīng)關(guān)系，是一種安全的豬用中藥伺料添加劑。試驗(yàn)例四雞球蟲散的穩(wěn)定性試驗(yàn)資料雞球蟲散是一種抗雞球蟲的中獸藥。為了考察產(chǎn)品的穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)對雞球蟲散(按照本發(fā)明申請實(shí)施例1配方生產(chǎn))的3批樣品，按照穩(wěn)定性試驗(yàn)所規(guī)定的考察條件，分別對熱、光、濕、加速等處理后，進(jìn)行樣品的性狀、水分、PH、含量的考察和分析，旨在為客觀地評價(jià)雞球蟲散產(chǎn)品的穩(wěn)定性提供依據(jù)，現(xiàn)將試驗(yàn)報(bào)告結(jié)果報(bào)告如下l.熱穩(wěn)定性試驗(yàn)1.1方法將3各批次的樣品分別置于一清潔趕走的帶蓋的培養(yǎng)皿中，每批次樣品均勻分裝成3份，厚度5mm，分別置于4(TC，60°C，8(TC的恒溫培養(yǎng)箱中，連續(xù)加溫處理10天。每天觀察溫度，IO天后取出，測定各樣品各項(xiàng)指標(biāo)，(性狀、PH、水分、含量)。l丄l外觀性狀觀察經(jīng)各條件處理前后，外觀色澤、狀態(tài)。l丄2水分測定采用烘干法(《中國獸藥典》二000五年版附錄57頁烘干法)。1丄3PH測定取樣品l.Og,加水100ml，超聲處理20分鐘，按PH測定法測定(《中國獸藥典》二000五年版附錄46頁烘干法)。l丄4鑒定精密稱取黃花蒿樣品粉末1.0g于250ml具塞錐形瓶中，精密量取石油醚(3060°C)60ml，超聲處理(功率250W，頻率40kHz)15min，立即用流水冷卻至室溫；將超聲后的石油醚提取液搖勻，濾過，倒入量筒，記錄石油醚的體積V。精密量取黃花蒿提取液0.4ml于10ml的具塞刻度試管中，放入不再加熱的沸水中揮干，得到含青蒿素的浸膏，加入2ml的95。/。乙醇，溶解殘?jiān)?，?.2。/。氫氧化鈉溶液定容至10ml，搖勻，置(50士1)"C恒溫水浴中微溫30min，取出，流水冷卻至室溫，待液面回復(fù)至刻度，用0.22^1111微孔濾膜濾過，即得。對照品溶液的制備精密稱取8(TC干燥至恒重的青蒿素對照品100mg，置100ml量瓶中，加入95%乙醇稀釋至刻度，得到1mg/ml的青蒿素對照品母液，4"C冰箱保存?zhèn)溆谩＞芰咳∏噍锼貙φ掌纺敢?0.0ml于100ml量瓶中，以95%乙醇補(bǔ)充至20ml，用0.2%氫氧化鈉溶液定容至100ml，搖勻，置(50士1)"C恒溫水浴中微溫30min，取出，流水冷卻至室溫，待液面回復(fù)至刻度，用0.22^1111微孔濾膜濾過，即得?？瞻兹芤旱闹苽淙?0m195。/。乙醇置于100ml量瓶中，用0.2%氫氧化鈉溶液定容至100ml，搖勻，置(50土l)'C恒溫水浴中微溫30min,取出，流水冷卻至室溫，待液面回復(fù)至刻度，用0.22pm微孔濾膜濾過，即得。以空白溶液為參比，在292nm處分別測得青蒿素對照品溶液和供試品溶液吸光度值A(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)和A樣品，代入青蒿素含量計(jì)算公式M(mg/g)=(A樣品xVxrx2)/(A標(biāo)準(zhǔn)x3)，其中，A樣品為樣品測得吸光度值，V為超聲后樣品石油醚的體積，A標(biāo)準(zhǔn)為0.1mg/ml青蒿素對照品吸光度值，r為轉(zhuǎn)換系數(shù)。將上述數(shù)據(jù)分別代入青蒿素含量計(jì)算公式計(jì)算各樣品中青蒿素含量。1.2熱穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(見下表)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>干燥器內(nèi)維持相對濕度為80%，將干燥器放置于4(TC恒溫箱中并每天觀察溫度及濕度、連續(xù)處理10天。處理10天后，按熱處理后的各項(xiàng)檢查方法，測定各批樣品與原始樣品的質(zhì)量比較。3.2濕穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(見下表)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>4.加速保存試驗(yàn)4.1方法為了觀察該制劑在加濕條件下進(jìn)行加速保存穩(wěn)定性的考察，將以上加濕穩(wěn)定性試驗(yàn)的樣品，繼續(xù)在相對濕度為80。/。及40'C恒溫條件下連續(xù)處理45天后再按照熱穩(wěn)定性處理后的各項(xiàng)檢查方法測定樣品各項(xiàng)指標(biāo)。4.2加速保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見下表)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>5小結(jié)5.1由表1試驗(yàn)結(jié)果可知，該制劑在熱穩(wěn)定性試驗(yàn)中，在40'C、60'C加熱處理10天后，外觀性狀、薄層鑒定基本上無差異，在8(TC處理10天后，含量也基本上五變化。故可判定在此條件下是穩(wěn)定的。5.2由表2試驗(yàn)結(jié)果可知，該制劑對光穩(wěn)定性試驗(yàn)在2500LX光照10天后，基本上各項(xiàng)指標(biāo)無變化，說明該制劑對光基本穩(wěn)定。5.3該制劑對濕穩(wěn)定試驗(yàn)是在相對濕度80%，40'C恒溫條件下處理10天后，樣品測定結(jié)果除各批水分明顯增加外，薄層鑒定與原樣相比基本無差異，應(yīng)屬對濕穩(wěn)定。5.4該制劑的加速保存試驗(yàn)，是在加濕試驗(yàn)的條件下繼續(xù)處理45天。測定結(jié)果，樣品PH無變化，水分明顯上身，外觀性狀顯示全部結(jié)塊。薄層鑒定，與原始樣相比，其含量無顯著性差異，尚屬基本穩(wěn)定，但應(yīng)注意吸潮對外觀的影響。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:青蒿400Kg、常山200Kg、馬鞭草200Kg、滑石粉100Kg、苦參100Kg、e—環(huán)糊精64Kg。制備步驟如下(1)取常山、馬鞭草、苦參用600目篩進(jìn)行超微粉碎，備用；(2)青蒿干燥莖葉碎成粗粉，加入3倍石油醚回流提取4次，每次l小時(shí)，趁熱濾過，合并濾液，減壓回流石油醚至浸膏，浸膏加10倍量70%乙醇熱溶，2.5%活性炭回流脫色1小時(shí)，濃縮至浸膏，在6(TC下干燥得青蒿素；粉碎后以青蒿素與丙酮的重量配比為1:60的比例與丙酮混合；然后勻速逐滴加入到轉(zhuǎn)速為500r/m的飽和P—環(huán)糊精中，青蒿素與環(huán)糊精的摩爾比為1:1，加完后攪拌4小時(shí)，放入4'C冰箱冷藏，析出結(jié)晶；抽濾；沉淀物用純化水洗滌3次，以除去殘留主體，于干燥箱中6(TC干燥2小時(shí)即得青篙素一P一CD包合物；(3)將步驟(1)、(2)所得粉末與滑石粉混勻包裝即可。實(shí)施例2:青蒿300Kg、常山100Kg、馬鞭草100Kg、滑石粉50Kg、苦參50Kg、e—環(huán)糊精24Kg。制備步驟如下(1)取常山、馬鞭草、苦參用600目篩進(jìn)行超微粉碎，備用；(2)青蒿干燥莖葉碎成粗粉，加入3倍石油醚回流提取4次，每次1小時(shí)，趁熱濾過，合并濾液，減壓回流石油醚至浸膏，浸膏加5倍量70%乙醇熱溶，2.5%活性炭回流脫色1小時(shí)，濃縮至浸膏，在6(TC下干燥得青蒿素；粉碎后以青蒿素與丙酮的重量配比為1:60的比例與丙酮混合；然后勻速逐滴加入到轉(zhuǎn)速為500r/m的飽和e—環(huán)糊精中，青蒿素與環(huán)糊精的摩爾比為1:1，加完后攪拌4小時(shí)，放入4-C冰箱冷藏，析出結(jié)晶；抽濾；沉淀物用純化水洗滌3次，以除去殘留主體，于干燥箱中60'C干燥2小時(shí)即得青篙素一e一CD包合物；(3)將步驟(1)、(2)所得粉末與滑石粉混勻包裝即可。實(shí)施例3:取青蒿800Kg、常山200Kg、馬鞭草400Kg、滑石粉100Kg、苦參100Kg、e—環(huán)糊精64Kg。制備步驟如下(1)常山、馬鞭草、苦參用600目篩進(jìn)行超微粉碎，備用；(2)青蒿干燥莖葉碎成粗粉，加入5倍石油醚回流提取4次，每次l小時(shí)，趁熱濾過，合并濾液，減壓回流石油醚至浸膏，浸膏加10倍量70%乙醇熱溶，2.5%活性炭回流脫色1小時(shí)，濃縮至浸膏，在6(TC下干燥得青蒿素；粉碎后以青蒿素與丙酮的重量配比為1:60的比例與丙酮混合；然后勻速逐滴加入到轉(zhuǎn)速為500r/m的飽和P—環(huán)糊精中，青蒿素與環(huán)糊精的摩爾比為1:1，加完后攪拌8小時(shí)，放入4'C冰箱冷藏，析出結(jié)晶；抽濾；沉淀物用純化水洗滌3次，以除去殘留主體，于干燥箱中6(TC干燥2小時(shí)即得青篙素一P一CD包合物；(3)將步驟(1)、(2)所得粉末與滑石粉混勻包裝即可。權(quán)利要求1、一種雞球蟲散，其特征在于，它包含以下重量配比的原料藥青蒿300～800份、常山100～200份、馬鞭草100～400份、滑石粉50～100份、苦參50～100份、β-環(huán)糊精24～64份。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞球蟲散，其特征在于，所述原料藥的重量配比為青蒿400份、常山200份、馬鞭草200份、滑石粉100份、苦參100份、e—環(huán)糊精64份。3、一種權(quán)利要求1所述的雞球蟲散的制備方法，其特征在于，它是按以下步驟進(jìn)行的(1)取所述重量配比的常山、馬鞭草、苦參用600目篩進(jìn)行超微粉碎，備用；(2)取所述重量配比的青蒿干燥莖葉碎成粗粉，加入35倍石油醚回流提取4次，每次1小時(shí)，趁熱濾過，合并濾液，減壓回流石油醚至浸膏，浸膏加510倍量的70%乙醇熱溶，2.5%活性炭回流脫色l小時(shí)，濃縮至浸膏，在60'C下干燥得青蒿素；粉碎后以青蒿素與丙酮的重量配比為l:60的比例與丙酮混合；然后勻速逐滴加入到轉(zhuǎn)速為500r/m的飽和P—環(huán)糊精中，青蒿素與環(huán)糊精的摩爾比為1:1,加完后攪拌48小時(shí)，放入4'C冰箱冷藏，析出結(jié)晶；抽濾；沉淀物用純化水洗漆3次，以除去殘留主體，于干燥箱中60'C干燥2小時(shí)即得青篙素一P—CD包合物；(3)將步驟(1)、(2)所得粉末與滑石粉混勻包裝即可。全文摘要本發(fā)明公開了一種毒性小、抗球蟲指數(shù)高、用藥成本低的抗雞球蟲病的雞球蟲散及其制備方法。所述雞球蟲散包含重量配比的青蒿400份、常山200份、馬鞭草200份、滑石粉100份、苦參100份、β-環(huán)糊精64份；所述雞球蟲散的制備方法是取青蒿干燥莖葉碎成粗粉，加入石油醚回流提取4次，取合并濾液減壓回流石油醚至浸膏，浸膏加70％乙醇熱溶，2.5％活性炭回流脫色，濃縮至浸膏，在60℃下干燥得青蒿素；粉碎后與丙酮混合；再勻速逐滴加入到飽和β-環(huán)糊精中，攪拌冷藏，析出結(jié)晶；抽濾；沉淀物用純化水洗滌于干燥箱中60℃干燥得青篙素-β-CD包合物；再與滑石粉及超微粉碎的常山、馬鞭草、苦參粉末混勻包裝即可。文檔編號(hào)A61K33/06GK101579451SQ20091015781公開日2009年11月18日申請日期2009年7月7日優(yōu)先權(quán)日2009年7月7日發(fā)明者孟瓊?cè)A,林林申請人:廣東溢多利生物科技股份有限公司