專利名稱：一種含雙歧桿菌的組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙歧桿菌制品，特別是涉及一種含雙歧桿菌的組合物及其應(yīng) 用，屬于雙歧桿菌制品制備技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明制得的含雙歧桿菌的組合物具有輔助降血 脂和抗氧化的功能，可以制成膠囊劑、沖劑、顆粒劑、片劑等形式，應(yīng)用于食品、保健 品和藥品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
衰老是生命周期中隨時間進展而表現(xiàn)出機體功能不斷惡化直到死亡的復雜動態(tài) 過程。在此過程中，機體的代謝發(fā)生變化，各個系統(tǒng)都相應(yīng)的出現(xiàn)退行性改變，導致與 衰老相關(guān)的慢性病的發(fā)病率和死亡率出現(xiàn)上升趨勢。如果機體內(nèi)一種或幾種脂類代謝失 調(diào)致使血中的一種或者幾種脂質(zhì)成分出現(xiàn)明顯異常，就會引發(fā)高脂血癥，它是一種發(fā)病 率高、潛在危害嚴重的慢性疾病，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人們生活水平的提高和方式的 改變，以及人口老齡化，高脂血癥引發(fā)的動脈粥樣硬化、冠心病、腦中風等心腦血管疾 病患病率在全球范圍內(nèi)居于首位，成為威脅人類生命和健康最突出的衛(wèi)生問題之一。雙歧桿菌是1899年在法國巴斯德研究所由Tisser.H博士首次從健康的母乳哺育 嬰兒的糞便中發(fā)現(xiàn)并分離出來的，是人體腸道內(nèi)重要的生理性細菌。經(jīng)研究證實，雙歧 桿菌可以顯著降低血清膽固醇和三酯酰甘油含量，具有降血脂、降血壓及預防心、腦血 管疾病的作用。能夠明顯增加體內(nèi)超氧化物歧化酶的含量及其生物活性，有效促進機體 內(nèi)超氧化自由基發(fā)生歧化、封閉和降解，加速體內(nèi)自由基的清除，從而增強機體的抗氧 化能力，延緩機體衰老。基于雙歧桿菌的抗氧化、提高免疫力、降低膽固醇及其臨床功 效的肯定，國內(nèi)外研究者相繼開發(fā)出多種雙歧桿菌食品和微生態(tài)藥品，通過外源方式增 加人體腸道中雙歧桿菌數(shù)量，促進人體健康。雖然雙歧桿菌制品的開發(fā)層出不窮，但在眾多制品中存在的最為關(guān)鍵的問題是 產(chǎn)品在貯藏和消費過程中活菌含量下降。研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌在人體內(nèi)的存活和增殖能 力對其益生作用有著重要影響，要獲得所期望的治療效果，雙歧桿菌必須達到足夠的數(shù) 量，以確保進入人體后有足夠的活菌發(fā)揮保健功能。然而，由于雙歧桿菌對營養(yǎng)條件要 求較高，對氧極為敏感，對低pH值的抵抗力差，導致進入市場的產(chǎn)品中雙歧桿菌的數(shù)量 急劇下降。另外，雙歧桿菌對人體產(chǎn)生有益效果，必須在通過胃環(huán)境后仍有大量的存活 菌到達腸道并定殖于腸粘膜上。但在胃酸和膽鹽環(huán)境中，雙歧桿菌菌數(shù)會很快下降，使 得最終在人體內(nèi)沒有足夠的雙歧桿菌發(fā)揮作用。因此，如何提高產(chǎn)品中雙歧桿菌活菌數(shù) 量，確保其在人體腸道內(nèi)定殖而發(fā)揮療效已成為我們亟待解決的問題
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高活性雙歧桿菌及其制備方法，解決目前雙歧桿菌 制品中存在的產(chǎn)品在貯藏和消費過程中活菌含量下降的問題。本發(fā)明的另一目的在于提供一種含雙歧桿菌的組合物及其應(yīng)用，特別是在輔助降血脂和抗氧化方面的應(yīng)用。本發(fā)明給出的技術(shù)解決方案是這種含雙歧桿菌的組合物，其特點是所述組合 物由經(jīng)高密度培養(yǎng)和雙層包埋的雙歧桿菌、低聚糖、維生素、金屬元素和輔料混合配制 而成。為更好的完成本發(fā)明的目的，所述含雙歧桿菌的組合物的組分，按重量百分比 計，雙歧桿菌為0.01 10%，低聚糖為10 50%，維生素為0.01 10%，金屬元素為 0.01 10%，其余為輔料。
為更好的完成本發(fā)明的目的，所述雙歧桿菌至少為嬰兒雙岐桿菌AS 1.2202、短 雙歧桿菌AS 1.2213、長雙歧桿菌CICC 6186、兩歧雙歧桿菌CICC 6071、青春雙歧桿菌 CICC 6070 中的一種。上述雙歧桿菌中的嬰兒雙岐桿菌AS 1.2202、短雙歧桿菌AS 1.2213均由中國普 通微生物菌種保藏管理中心保藏，長雙歧桿菌CICC 6186、兩歧雙歧桿菌CICC6071、青 春雙歧桿菌CICC 6070均由中國微生物菌種保藏管理委員會工業(yè)微生物菌種保藏管理中 心保藏，屬于現(xiàn)有的雙歧桿菌菌種。為更好的完成本發(fā)明的目的，所述低聚糖為低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚 糖、低聚木糖、低聚乳果糖、低聚異麥芽糖等中的一種或多種。為更好的完成本發(fā)明的目的，所述維生素為維生素A、維生素氏、B2, B6, B12,維生素C、維生素D、維生素E等中的一種或多種。為更好的完成本發(fā)明的目的，所述金屬元素為鋅、鐵、鈣、鎂等中的一種或多 種。為更好的完成本發(fā)明的目的，所述輔料為麥芽糊精、乳糖、淀粉等中的一種或 多種。用于本發(fā)明的雙歧桿菌的制備方法如下A、高密度培養(yǎng)(1)菌種活化無菌條件下，挑取安瓿管中菌體接種于液體培養(yǎng)基和瓊脂平板 上，在36 38°C條件下厭氧培養(yǎng)24 48小時，連續(xù)活化2 3代，即得活化菌種。其中，用于本發(fā)明的雙歧桿菌培養(yǎng)基的配制方法如下胰蛋白胨5.0g、酵母提 取物lO.Og、大豆蛋白胨5.0g、葡萄糖lO.Og、L 半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、吐溫801.0mL、 鹽溶液40mL、加水定容至lOOOmL，調(diào)節(jié)pH6.8 7.0，121°C滅菌20min。其中鹽溶液 的成分為氯化鈣0.2g、磷酸二氫鉀l.Og、硫酸鎂0.48g、碳酸氫鈉lO.Og、磷酸氫二鉀 l.Og、氯化鈉2.0g、加水定容至1000mL。(2)種子培養(yǎng)將活化菌種按5% 10%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，在36 38°C條件下厭氧培養(yǎng)20 28小時，作為種子培養(yǎng)物。(3)發(fā)酵培養(yǎng)將種子培養(yǎng)物按5% 10%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，在 36 38 °C條件下進行發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)。(4)發(fā)酵終止培養(yǎng)基pH和葡萄糖含量均不再降低時終止發(fā)酵，獲得雙歧桿菌 高密度發(fā)酵液。2、雙層包埋(1)離心濃縮將雙歧桿菌高密度發(fā)酵液在4°C、6000 8000r/min的條件下離心10 20min，無菌水洗滌2 3次，取下層沉淀即為活性菌泥。(2)添加保護劑按1 4 1 10(V保護劑/V發(fā)酵液)的比例在活性菌泥中加入菌 體冷凍干燥保護劑，無菌條件下150 250r/min攪拌15 30min至均勻，制備菌懸液。其中，用于本發(fā)明的冷凍干燥保護劑的配制方法如下脫脂奶粉8 12g、蔗糖 8 12g、谷氨酸鈉0.5 1.5g、山梨醇0.5 1.5g，加水定容至lOOmL，加熱攪拌使其溶 解，然后115°C滅菌15min。(3)1層包埋按1 1 1 5 (Vljg包埋液/V保護劑)的比例將I層包埋液加入菌懸 液中，無菌條件下150 250r/min攪拌15 30min至均勻。
其中，用于本發(fā)明的I層包埋液為蛋白質(zhì)溶液，至少為酪蛋白、乳白蛋白、卵白 蛋白、卵黃磷蛋白、肌蛋白、大豆分離蛋白、中草藥白蛋白等中的一種(4)11層包埋按1 1 1 5 (V11層包埋液/V保護劑)的比例將II層包埋液加入上 述混合液中，無菌條件下150 250r/min攪拌15 30min至均勻。其中，用于本發(fā)明的II層包埋液為為膠質(zhì)溶液，至少為κ-卡拉膠、黃原膠、瓜 爾膠、果膠、木薯淀粉、瓊脂、海藻酸鈉、刺槐豆膠、魔芋膠等中的一種。3、冷凍干燥將經(jīng)雙層包埋的雙歧桿菌置于_70°C冰箱中預凍2 6h后，在冷阱溫 度-45 -55°C，真空度0.1 10帕下真空冷凍干燥，即得雙歧桿菌菌粉。本發(fā)明給出的含雙歧桿菌的組合物的劑型為膠囊劑、沖劑、顆粒劑、片劑等形式。本發(fā)明給出的含雙歧桿菌的組合物的應(yīng)用是作為輔助降血脂和抗氧化的食品、 保健品、藥品等應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是(1)高密度培養(yǎng)使菌體密度較傳統(tǒng)培養(yǎng)方式有顯著提高，從而達到減少培養(yǎng)體 積，還可以縮短生產(chǎn)周期，最終提高特定產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率，減少設(shè)備投資從而降低生 產(chǎn)成本，提高在市場上的競爭力。(2)雙層包埋的外層膠體在酸性環(huán)境中不溶解，保護菌體安全通過胃部，不受胃 酸及膽鹽的破壞。到達腸道后外層膠體溶解，暴露出內(nèi)層蛋白質(zhì)，協(xié)助菌體黏附在腸壁 絨毛上而在腸道內(nèi)定殖，同時提供營養(yǎng)，促進菌體增殖。(3)真空冷凍干燥技術(shù)在低溫、低壓下進行，基本隔絕空氣，有效抑制產(chǎn)品發(fā)生 理化性質(zhì)改變，可以較好地保存活性物質(zhì)，并賦予產(chǎn)品良好的穩(wěn)定性，便于長期貯存。(4)低聚糖不易被人體胃腸道消化吸收，作為雙歧桿菌的增殖因子，能有效地促 進其生長繁殖，抑制腐敗菌生長。
具體實施方案下面實施例對本發(fā)明作進一步說明，而不是限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1 雙歧桿菌菌粉的制備1、高密度培養(yǎng)(1)菌種活化無菌條件下，挑取安瓿管中菌體接種于液體培養(yǎng)基和瓊脂平板 上，在37°C條件下厭氧培養(yǎng)48小時，連續(xù)活化3代，即得活化菌種。
其中，用于本發(fā)明的雙歧桿菌培養(yǎng)基的配制方法如下胰蛋白胨5.0g、酵母提 取物lO.Og、大豆蛋白胨5.0g、葡萄糖lO.Og、L 半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、吐溫801.0mL、 鹽溶液40mL、加水定容至lOOOmL，調(diào)節(jié)pH6.8 7.0，121°C滅菌20min。其中鹽溶液 的成分為氯化鈣0.2g、磷酸二氫鉀l.Og、硫酸鎂0.48g、碳酸氫鈉lO.Og、磷酸氫二鉀 l.Og、氯化鈉2.0g、加水定容至lOOOmL。(2)種子培養(yǎng)將活化菌種按5%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，在37°C條件下厭 氧培養(yǎng)24小時，作為種子培養(yǎng)物。(3)發(fā)酵培養(yǎng)將種子培養(yǎng)物按5%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，在37°C條件下 進行發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)。發(fā)酵過程主要參數(shù)控制為pH控制接種后NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH至7.0，發(fā)酵期間流加NaOH維持 pH>5.0 ；葡萄糖控制發(fā)酵期間監(jiān)測培養(yǎng)基中葡萄糖濃度，流加葡萄糖維持葡萄糖含量 >4g /L0(4)發(fā)酵終止培養(yǎng)基pH和葡萄糖含量均不再降低時終止發(fā)酵，獲得雙歧桿菌 高密度發(fā)酵液。2、雙層包埋(1)離心濃縮將雙歧桿菌高密度發(fā)酵液在4°C、eOOOr/min的條件下離心 15min,無菌水洗滌2次，取下層沉淀即為活性菌泥。(2)添加保護劑按V保護劑/V發(fā)酵液=1 8的比例在活性菌泥中加入菌體冷凍干 燥保護劑，無菌條件下200r/min攪拌15min至均勻，制備菌懸液。其中，用于本發(fā)明的冷凍干燥保護劑的配制方法如下脫脂奶粉10g、蔗糖 log、谷氨酸鈉l.Og、山梨醇l.Og，加水定容至lOOmL，加熱攪拌使其溶解，然后115°C 滅菌15min。(3) I層包埋按％層包_/乂保護劑=1 2的比例將I層包埋液加入菌懸液中，無 菌條件下200r/min攪拌15min至均勻。其中，用于本發(fā)明的I層包埋液為5%的大豆分離蛋白溶液。(4)11層包埋按V11層包埋液V保護劑=1 2的比例將II層包埋液加入上述混合 液中，無菌條件下200r/min攪拌15min至均勻。其中，用于本發(fā)明的II層包埋液為0.04%的κ-卡拉膠和0.06%的魔芋膠的膠體 混合溶液。3、冷凍干燥將經(jīng)雙層包埋的雙歧桿菌置于_70°C冰箱中預凍4h后，在冷阱溫度_50°C，真空 度0.1 10帕下真空冷凍干燥，即得雙歧桿菌菌粉，活菌數(shù)可達1.0X lO^cfu/g以上。實施例2 組合物配方
組份用量/kg 單位含量/g 日推薦量
兩歧雙歧桿菌(1.0 X IO11CfiVg) 0. 5g 0.5 X IO8Cfu 1.0 X IO8Cfu
青春雙歧桿菌(1. OX IO11CfuZg)0. 5g0. 5X IO8CfU1. OX IO8Cfu
長雙歧桿菌(1.0 X IO11Cfu/g)0. 5g0.5 X IO8Cfu1.0 X 108cfu
低聚木糖350g350mg700mg
維生素A0.4 g0.4 mg0.8 mg
維生素Bl0.6 g0.6 mg1.2 mg
維生素B20.6 g0.6 mg1.2 mg
維生素B60.6g0.6mg1.2 mg
維生素C50g50mg100 mg
維生素E7.5g7.5mg15mg
Fe7.5 g7.5 mg15 mg
Zn7.5g7.5mg15 mg
麥芽糊精573. 8g組合物各組分按上表用量進行混合，制成膠囊劑，0.25g/粒，每次4粒，每日2 次；制成沖劑，Ig/包，每次1包，每日2次。實施例3 對高脂血癥模型大鼠血脂水平的影響動物分組及給藥雄性SD大鼠50只，體重190 220g，隨機分為5組，即正常 對照組、高脂模型組、組合物低、中、高劑量組，每組10只。除正常對照組外，大鼠按 每IOOg體重給予高脂飼料10g(1.5%膽固醇、10%豬油、0.3%膽鹽、10%蛋黃粉、0.2% 甲基硫氧嘧啶，78%普通飼料)，喂飼15d，通過體重及血脂檢測確認高脂血癥模型建立 成功后，每日對組合物低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予0.10、0.25、0.50g/kg的組合 物，對正常對照組和陰性對照組大鼠灌胃給予等量蒸餾水，連續(xù)30d，每周根據(jù)體重變化 調(diào)整給藥劑量。末次給藥后禁食12h，不限飲水，眼眶取血，檢測膽固醇各項血脂指標， 比較給藥前后各項指標的差異。結(jié)果判定在血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇三項指標檢測中 血清總膽固醇和甘油三酯二項指標陽性，可判定該受試樣品輔助降血脂功能動物實驗結(jié) 果陽性。(1)組合物對大鼠體重的影響各組大鼠體重的變化(g，χ士 s，η =10)
權(quán)利要求
1.一種含雙歧桿菌的組合物，其特征在于所述組合物由經(jīng)高密度培養(yǎng)和雙層包埋的 雙歧桿菌、低聚糖、維生素、金屬元素和輔料混合配制而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含雙歧桿菌的組合物，其特征在于所述含雙歧桿菌的組合 物的組分，按重量百分比計雙歧桿菌為0.01 10%，低聚糖為10 50%，維生素為 0.01 10%，金屬元素為0.01 10%，其余為輔料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含雙歧桿菌的組合物，其特征在于所述雙歧桿菌至少為嬰 兒雙岐桿菌AS 1.2202、短雙歧桿菌AS 1.2213、長雙歧桿菌CICC 6186、兩歧雙歧桿菌 CICC 6071、青春雙歧桿菌CICC 6070中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含雙歧桿菌的組合物，其特征在于所述低聚糖至少為低聚果 糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、低聚木糖、低聚乳果糖、低聚異麥芽糖等中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含雙歧桿菌的組合物，其特征在于所述維生素至少為維生素 A、維生素Bp B2, B6, B12,維生素C、維生素D、維生素E中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含雙歧桿菌的組合物，其特征在于所述金屬元素至少為鋅、 鐵、鈣、鎂中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含雙歧桿菌的組合物，其特征在于所述輔料至少為麥芽糊 精、乳糖、淀粉中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含雙歧桿菌的組合物，其特征在于所述經(jīng)高密度培養(yǎng)和雙層 包埋的雙歧桿菌的制備方法為A、高密度培養(yǎng)(1)菌種活化無菌條件下，挑取安瓿管中菌體接種于液體培養(yǎng)基和瓊脂平板上， 在36 38°C條件下厭氧培養(yǎng)24 48小時，連續(xù)活化2 3代，即得活化菌種；(2)種子培養(yǎng)將活化菌種按5% 10%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，在36 38°C 條件下厭氧培養(yǎng)20 28小時，作為種子培養(yǎng)物；(3)發(fā)酵培養(yǎng)將種子培養(yǎng)物按5% 10%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，在36 38 °C條件下進行發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)；(4)發(fā)酵終止培養(yǎng)基pH和葡萄糖含量均不再降低時終止發(fā)酵，獲得雙歧桿菌高密 度發(fā)酵液；B、雙層包埋(1)離心濃縮將雙歧桿菌高密度發(fā)酵液在4°C、6000 8000r/min的條件下離心 10 20min，無菌水洗滌2 3次，取下層沉淀即為活性菌泥；(2)添加保護劑按1 4 1 IO(Vfti^zVssw)的比例在活性菌泥中加入菌體 冷凍干燥保護劑，無菌條件下150 250r/min攪拌15 30min至均勻，制備菌懸液；(3)1層包埋按1 1 1 5 (Vljg包埋液/V保護劑)的比例將I層包埋液加入菌懸液 中，無菌條件下150 250r/min攪拌15 30min至均勻；⑷II層包埋按1 1 1 5 (V11層包埋液/V保護劑)的比例將II層包埋液加入上述混 合液中，無菌條件下150 250r/min攪拌15 30min至均勻；C、冷凍干燥將經(jīng)雙層包埋的雙歧桿菌置于-70 0C冰箱中預凍2 6h后，在冷阱溫 度-45 -55°C，真空度0.1 10帕下真空冷凍干燥，即得雙歧桿菌菌粉。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的含雙歧桿菌的組合物，其特征在于雙歧桿菌培養(yǎng)基的配制方 法如下胰蛋白胨5.0g、酵母提取物lO.Og、大豆蛋白胨5.0g、葡萄糖lO.Og、L-半胱氨酸鹽 酸鹽0.5g、吐溫801.0mL、鹽溶液40mL、加水定容至lOOOmL，調(diào)節(jié)pH6.8_7.0，121°C滅 菌20min。其中鹽溶液的成分為氯化鈣0.2g、磷酸二氫鉀l.Og、硫酸鎂0.48g、碳酸氫 鈉lO.Og、磷酸氫二鉀l.Og、氯化鈉2.0g、加水定容至IOOOmL0
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的含雙歧桿菌的組合物，其特征在于冷凍干燥保護劑的配制 方法如下脫脂奶粉8 12g、蔗糖8 12g、谷氨酸鈉0.5 1.5g、山梨醇0.5 1.5g，加水定 容至IOOmL,加熱攪拌使其溶解，然后115°C滅菌15min。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的含雙歧桿菌的組合物，其特征在于I層包埋液為蛋白質(zhì)溶 液，至少為酪蛋白、乳白蛋白、卵白蛋白、卵黃磷蛋白、肌蛋白、大豆分離蛋白、中草 藥白蛋白中的一種。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的含雙歧桿菌的組合物，其特征在于II層包埋液為膠質(zhì)溶 液，至少為κ-卡拉膠、黃原膠、瓜爾膠、果膠、木薯淀粉、瓊脂、海藻酸鈉、刺槐豆 膠、魔芋膠等中的一種。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含雙歧桿菌的組合物，其特征在于該組合物的劑型為膠囊 齊U、沖劑、顆粒劑、片劑形式。
14.權(quán)利要求1所述的含雙歧桿菌的組合物的用途，其特征在于作為輔助降血脂和抗 氧化的食品或保健品或藥品應(yīng)用。
全文摘要
一種含雙歧桿菌的組合物及其應(yīng)用，其特點是所述含雙歧桿菌的組合物由經(jīng)高密度培養(yǎng)和雙層包埋的雙歧桿菌、低聚糖、維生素、金屬元素和輔料混合配制而成，其中含雙歧桿菌的組合物的組分雙歧桿菌為0.01～10％，低聚糖為10～50％，維生素為0.01～10％，金屬元素為0.01～10％，其余為輔料。本發(fā)明給出的含雙歧桿菌的組合物具有輔助降血脂和抗氧化的功能，可以制成膠囊劑、沖劑、顆粒劑、片劑等形式，應(yīng)用于食品、保健品和藥品領(lǐng)域。
文檔編號A61K31/4415GK102018217SQ200910175659
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月19日
發(fā)明者曾星 申請人:菲伯納生物醫(yī)藥有限責任公司