專利名稱：化合物和釋放前列環(huán)素類似物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明普遍涉及前列環(huán)素類似物及其用于促進(jìn)血管舒張、抑制血小板聚集和血栓形成、刺激血栓溶解、抑制細(xì)胞增殖(包括血管重建)、提供細(xì)胞保護(hù)作用、預(yù)防動脈粥樣硬化形成及誘導(dǎo)血管生成的方法。通過這些模擬前列環(huán)素的機(jī)制，本發(fā)明化合物可用于治療肺動脈高血壓、缺血性疾病(例如外周血管疾病、雷諾現(xiàn)象、硬皮病、心肌缺血、缺血性中風(fēng)、腎機(jī)能不全)、心力衰竭(包括充血性心力衰竭)、需要抗凝作用的病癥(例如MI后、心臟手術(shù)后)、血栓性微血管病，體外循環(huán)、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞，動脈粥樣硬化、炎性疾病(例如COPD、銀屑病)、高血壓(例如先兆子癇)、生殖和分娩，癌癥或其他不調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞/組織保護(hù)和前列環(huán)素治療似乎具有有益作用的其他新興治療領(lǐng)域的病癥。這些化合物也可顯示附加或與其他心血管藥(例如鈣通道阻斷劑、磷酸二酯酶抑制劑、內(nèi)皮拮抗劑、抗血小板藥)聯(lián)合的協(xié)同作用。

背景技術(shù)：
許多有價值的藥理活性化合物由于各種原因不能有效地口服，而一般通過靜脈內(nèi)或肌內(nèi)途徑給藥。這些給藥途徑一般需要醫(yī)生或其他衛(wèi)生保健專業(yè)人員的干預(yù)，并可使患者遭受相當(dāng)?shù)牟槐阋约皾撛诘木植縿?chuàng)傷。
該化合物的一個實(shí)例為曲前列環(huán)素(treprostinil)，為前列環(huán)素的一種化學(xué)穩(wěn)定類似物。雖然曲前列環(huán)素鈉(Remodulin

)被食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于皮下給藥，而作為游離酸的曲前列環(huán)素具有小于10％的絕對口服生物利用度。因此，有經(jīng)口提供曲前列環(huán)素的臨床需要。
因此，對通過給予曲前列環(huán)素或曲前列環(huán)素類似物增加全身利用度的安全并有效的方法存在需求。


發(fā)明內(nèi)容
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有結(jié)構(gòu)I的化合物、其對映異構(gòu)體、其藥學(xué)上可接受的鹽以及多晶型物
其中， R1獨(dú)立選自H、取代和未取代芐基和其中OR1為取代或未取代氨甲酰基甲酯(glycolamide)的基團(tuán)； R2和R3可相同或不同，且獨(dú)立選自H、磷酸酯基以及其中OR2和OR3形成氨基酸酯或蛋白質(zhì)酯的基團(tuán)，條件是R1、R2和R3不全部為H。
在某些實(shí)施方案中，R1為取代或未取代芐基，例如CH2C6H5。在其他實(shí)施方案中，OR1為取代或未取代氨甲?；柞ィ琑1為-CH2CONR4R5，R4和R5可相同或不同，且獨(dú)立選自H、OH、取代和未取代烷基、-(CH2)mCH3、-CH2OH及-CH2(CH2)nOH，條件是m為0、1、2、3或4，n為0、1、2、3或4。在某些實(shí)施方案中，R4和R5之一或兩者獨(dú)立選自H、-OH、-CH3或-CH2CH2OH。在任一前述實(shí)施方案中，R2和R3之一或兩者可為H。在該化合物的某些對映異構(gòu)體中，R1＝R2＝R3＝H，或R2＝R3＝H及R1＝纈氨酰胺。
在本發(fā)明化合物的還再一些實(shí)施方案中，R2和R3獨(dú)立選自磷酸酯基和其中OR2和OR3為氨基酸酯、二肽酯、三肽酯和四肽酯的基團(tuán)。在某些化合物中，R2或R3中只有一個為磷酸酯基。在其他化合物中，R2和R3獨(dú)立選自其中OR2和OR3為氨基酸酯例如甘氨酸酯或丙氨酸酯的基團(tuán)。在任一上述實(shí)施方案中，R2和R3之一為H。在某些本發(fā)明化合物中，化合物的口服生物利用度大于曲前列環(huán)素的口服生物利用度，例如至少比曲前列環(huán)素口服生物利用度大50％或100％。上述化合物還可包含p-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑。這些化合物的任一種也可進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。
本發(fā)明也提供使用上述化合物的治療方法，該方法用于治療肺動脈高血壓、缺血性疾病、心力衰竭、需要抗凝作用的病癥、血栓性微血管病，體外循環(huán)、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞，動脈粥樣硬化、炎性疾病、高血壓、生殖和分娩，癌癥或其他不調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞/組織保護(hù)和其他前列環(huán)素治療似乎具有有益作用的其他新興治療領(lǐng)域的病癥。一個優(yōu)選的實(shí)施方案為治療患者的肺動脈高血壓和/或外周血管疾病的方法，該方法包括經(jīng)口給予藥學(xué)有效量的結(jié)構(gòu)II化合物及其對映異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽或多晶型物
其中， R1獨(dú)立選自H、取代和未取代烷基、芳烷基和其中OR1形成取代或未取代氨甲?；柞サ幕鶊F(tuán)； R2和R3可相同或不同，且獨(dú)立選自H、磷酸酯基以及其中OR2和OR3形成氨基酸酯或蛋白質(zhì)酯的基團(tuán)，條件是R1、R2和R3不全部為H。
在某些方法中，當(dāng)OR1形成取代或未取代氨甲?；柞r，R1為-CH2CONR4R5，其中R4和R5可相同或不同，且獨(dú)立選自H、OH、取代和未取代烷基、-(CH2)mCH3、-CH2OH及-CH2(CH2)nOH，條件是m為0、1、2、3或4，n為0、1、2、3或4。在其他方法中，R1為C1-C4烷基，例如甲基、乙基、丙基或丁基。在這些公開的方法中，R1也可為取代或未取代芐基。在其他方法中，R1可為-CH3或-CH2C6H5。在還一些其他方法中，R4和R5可相同或不同，且獨(dú)立選自H、OH、-CH3和-CH2CH2OH。在又一些其他方法中，R2和R3之一或兩者為H?；蛘?，R2和R3之一或兩者不為H，R2和R3獨(dú)立選自磷酸酯基和其中OR2和OR3為氨基酸酯、二肽酯、三肽酯和四肽酯的基團(tuán)。在某些方法中，R2或R3中只有一個為磷酸酯基。在另外一些方法中，R2和R3獨(dú)立選自其中OR2和OR3為氨基酸酯例如甘氨酸酯或丙氨酸酯的基團(tuán)。在再一些方法中，R1和R2之一為H。在某些方法中，使用化合物的對映異構(gòu)體，其中R1＝R2＝R3＝H，或R2＝R3＝H及R1＝纈氨酰胺。
在各種方法中，化合物的口服生物利用度比曲前列環(huán)素口服生物利用度大，例如至少比曲前列環(huán)素口服生物利用度大50％或100％。本發(fā)明的方法也可包括同時、序貫給予藥學(xué)有效量的p-糖蛋白抑制劑與結(jié)構(gòu)II化合物，或在給予結(jié)構(gòu)II化合物之前給予藥學(xué)有效量的p-糖蛋白抑制劑。在某些實(shí)施方案中，p-糖蛋白抑制劑經(jīng)口或靜脈內(nèi)給藥。這些公開的方法可用于治療肺動脈高血壓。
本發(fā)明也提供提高曲前列環(huán)素或其藥學(xué)上可接受的鹽的口服生物利用度的方法，該方法包括給予患者藥學(xué)有效量的p-糖蛋白抑制劑及口服給予藥學(xué)有效量的曲前列環(huán)素。在某些實(shí)施方案中，p-糖蛋白抑制劑在給予曲前列環(huán)素之前給予或與曲前列環(huán)素同時給予。p-糖蛋白抑制劑的給藥途徑可不同，例如可口服或靜脈內(nèi)給藥。本發(fā)明也提供包含曲前列環(huán)素或其藥學(xué)上可接受的鹽及p-糖蛋白抑制劑的組合物。
本發(fā)明化合物也可局部給藥或經(jīng)皮給藥。
本發(fā)明提供了藥用制劑，該制劑包括任一上述化合物與藥學(xué)上可接受載體的組合。
上述化合物也可用于治療癌癥。
通過下列詳細(xì)的描述，本發(fā)明進(jìn)一步的目的、特征及優(yōu)勢將是顯而易見的。
附圖簡述

圖1A和1B分別表示如實(shí)施例1所描述的靜脈內(nèi)和門靜脈內(nèi)給予大鼠曲前列環(huán)素二乙醇胺鹽的血漿濃度對時間曲線； 圖2A、2B和2C分別表示如實(shí)施例1所描述的經(jīng)十二指腸內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)和經(jīng)口給予大鼠曲前列環(huán)素二乙醇胺鹽的血漿濃度對時間曲線； 圖3表示對數(shù)標(biāo)度(scle)實(shí)施例1中所描述給藥途徑的平均血漿濃度對時間曲線； 圖4圖示如實(shí)施例2中所描述的經(jīng)口給予大鼠曲前列環(huán)素甲酯后，大鼠中曲前列環(huán)素的血漿濃度對時間曲線； 圖5圖示如實(shí)施例2中所描述的經(jīng)口給予大鼠曲前列環(huán)素芐酯后，大鼠中曲前列環(huán)素的血漿濃度對時間曲線； 圖6圖示如實(shí)施例2中所描述的經(jīng)口給予大鼠曲前列環(huán)素二甘氨酸酯后，大鼠中曲前列環(huán)素的血漿濃度對時間曲線； 圖7圖示如實(shí)施例2中所描述的經(jīng)口給予大鼠曲前列環(huán)素芐酯(0.5mg/kg)及曲前列環(huán)素二甘氨酸酯(0.5mg/kg)后，與曲前列環(huán)素(1mg/kg)相比大鼠中曲前列環(huán)素的血漿濃度對時間曲線； 圖8圖示如實(shí)施例3中所描述的經(jīng)十二指腸內(nèi)給予大鼠曲前列環(huán)素單磷酸酯(環(huán)狀)后，大鼠中曲前列環(huán)素的血漿濃度對時間曲線； 圖9圖示如實(shí)施例3中所描述的經(jīng)十二指腸內(nèi)給予大鼠曲前列環(huán)素單纈氨酸酯(環(huán)狀)后，大鼠中曲前列環(huán)素的血漿濃度對時間曲線； 圖10圖示如實(shí)施例3中所描述的經(jīng)十二指腸內(nèi)給予大鼠曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(環(huán)狀)后，大鼠中曲前列環(huán)素的血漿濃度對時間曲線； 圖11圖示如實(shí)施例3中所描述的經(jīng)十二指腸內(nèi)給予大鼠曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(鏈狀)后，大鼠中曲前列環(huán)素的血漿濃度對時間曲線；及 圖12圖示僅與實(shí)施例1的曲前列環(huán)素相比的各前藥平均血漿濃度對時間曲線，如實(shí)施例3中所描述。曲前列環(huán)素以1mg/kg給藥，而前藥以0.5mg/kg給藥。
圖13A-13D分別表示劑量，每兩小時給藥，四個劑量，每個劑量0.05mg(合計(jì)＝0.2mg)、每個劑量0.125mg(合計(jì)＝0.5mg)、每個劑量0.25mg(合計(jì)＝1.0mg)或每個劑量0.5mg(合計(jì)＝2.0mg)。
圖14表示禁食和進(jìn)食狀態(tài)下的UT-15C緩釋片和緩釋膠囊的藥代動力學(xué)曲線。
圖15表示多晶型物A的X射線粉末衍射圖譜。
圖16表示多晶型物A的IR光譜。
圖17表示多晶型物A的拉曼(Raman)光譜。
圖18表示多晶型物A的熱數(shù)據(jù)。
圖19表示多晶型物A的吸濕數(shù)據(jù)。
圖20表示多晶型物B的X射線粉末衍射圖譜。
圖21表示多晶型物B的熱數(shù)據(jù)。
圖22表示多晶型物B的吸濕數(shù)據(jù)。
發(fā)明詳述 除非另外說明，否則“一個(種)”表示“一個(種)或多個(種)”本發(fā)明提供在患者體內(nèi)誘導(dǎo)前列環(huán)素樣作用的化合物和方法。本文中提供的化合物可配制成用于本發(fā)明方法中的藥用制劑和藥物。本發(fā)明也提供此類化合物在制備藥物和藥用制劑中的用途，及此類化合物在治療如在發(fā)明領(lǐng)域中所描述的、與前列環(huán)素活性不足相關(guān)的生物學(xué)病癥中的用途。本發(fā)明也提供治療癌癥和癌癥相關(guān)疾病的化合物及方法。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物為具有下列結(jié)構(gòu)的(+)-曲前列環(huán)素的化學(xué)衍生物
曲前列環(huán)素為前列環(huán)素化學(xué)上穩(wěn)定的類似物，本身是有效的血管舒張劑和血小板聚集抑制劑。曲前列環(huán)素鈉鹽，即(1R，2R，3aS，9aS)-[[2，3，3a，4，9，9a-六氫-2-羥基-1-[(3S)-3-羥辛基]-1H-苯并[f]茚-5-基]氧基]乙酸單鈉鹽，以Remodulin

注射液銷售，已經(jīng)被食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療肺動脈高血壓。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物為(-)-曲前列環(huán)素的衍生物、(+)-曲前列環(huán)素的對映異構(gòu)體。本發(fā)明一個優(yōu)選的實(shí)施方案為曲前列環(huán)素的二乙醇胺鹽。本發(fā)明還包括上述化合物的多晶型物，有兩種晶型，晶型A和晶型B，將在下述實(shí)施例中描述。在這兩種晶型中，優(yōu)選晶型B。本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案為晶型B曲前列環(huán)素二乙醇胺。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物一般被歸為曲前列環(huán)素的前藥，它例如通過攝取給予患者后轉(zhuǎn)化為曲前列環(huán)素。在某些實(shí)施方案中，前藥本身具有很少活性或無活性，僅在被轉(zhuǎn)化成曲前列環(huán)素后顯示活性。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物通過將曲前列環(huán)素用化學(xué)方法衍生制成穩(wěn)定的酯制備，而在某些情況下，化合物從羥基衍生化。本發(fā)明化合物也可通過以相似的方式修飾美國專利號4,306,075和5,153,222中的化合物來提供。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)構(gòu)I化合物及其對映異構(gòu)體和藥學(xué)上可接受的鹽
其中， R1獨(dú)立選自H、取代和未取代芐基和其中OR1為取代或未取代氨甲?；柞サ幕鶊F(tuán)； R2和R3可相同或不同，且獨(dú)立選自H、磷酸酯基以及其中OR2和OR3形成氨基酸酯或蛋白質(zhì)酯的基團(tuán)，條件是R1、R2和R3不全部為H。
在某些實(shí)施方案中，其中OR1為取代或未取代氨甲?；柞?，R1為-CH2CONR4R5，R4和R5可相同或不同，且獨(dú)立選自H、OH、取代和未取代烷基、-(CH2)mCH3、-CH2OH及-CH2(CH2)nOH，條件是m為0、1、2、3或4，n為0、1、2、3或4。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也將容易地認(rèn)識到以普通方式將各成員分組，例如以馬庫什(Markush)組方式或以上下文中結(jié)構(gòu)I和II的R所描述的組方式，本發(fā)明不僅包括作為整體列出的整個組，也包括單個組的各成員及所有主要組可能的亞組。因此，對于所有目的，本發(fā)明不僅包括主要組，也包括缺少一個或多個組成員的主要組。本發(fā)明也預(yù)期直接排除一個或多個所要求保護(hù)發(fā)明中的任一組成員。例如，R1可特定地排除H、取代和未取代芐基，或其中OR1為取代或未取代氨甲?；柞サ幕鶊F(tuán)。
在某些實(shí)施方案中，R1為取代或未取代芐基，例如-CH2C6H5、-CH2C6H4NO2、-CH2C6H4OCH3、-CH2C6H4Cl、-CH2C6H4(NO2)2或-CH2C6H4F。芐基可以是鄰位、間位、對位、鄰位/對位取代及其組合。芳環(huán)上合適的取代基包括鹵素(氟、氯、溴、碘)、-NO2基團(tuán)、其中R16為H或C1-C4烷基的-OR16基團(tuán)及其組合。
或者，當(dāng)R1為-CH2CONR4R5，那么R4和R5可相同或不同，且獨(dú)立選自H、OH、-CH3和-CH2CH2OH。在這些化合物中，其中R1不為H，通常R2和R3之一或兩者為H。
在某些實(shí)施方案中，R2和R3之一或兩者為H，R1為-CH2CONR4R5，R4和R5之一或兩者為H、-OH、-CH3、-CH2CH2OH。
在其中R2和R3之一或兩者不為H的化合物中，R2和R3可獨(dú)立選自磷酸酯基和其中OR2和OR3為氨基酸酯、二肽酯、三肽酯和四肽酯的基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，R2或R3中只有一個為磷酸酯基。在其中R2和R3中至少一個不為H的化合物中，通常R1為H。在另外的實(shí)施方案中，R2和R3之一為H，因此結(jié)構(gòu)I化合物僅在R2和R3之一上衍生化。在特定的化合物中，R2為H，R3如上所定義。在另外的實(shí)施方案中，R1和R3為H，R2為其中OR2為氨基酸酯或二肽酯的基團(tuán)。在再一些實(shí)施方案中，R1和R2為H，R3為其中OR3為氨基酸酯或二肽酯的基團(tuán)。
當(dāng)OR2和OR3基團(tuán)之一或兩者形成氨基酸酯或肽酯即二肽酯、三肽酯或四肽酯時，它們通?？杀硎緸?COCHR6NR7R8，其中R6選自氨基酸側(cè)鏈，R7和R8可相同或不同，且獨(dú)立選自H和-COCHR9NR10R11。通常，提及氨基酸或肽指天然存在的氨基酸或肽，或氨基酸或肽的L-異構(gòu)體。然而，本發(fā)明化合物和方法不限于此，D-異構(gòu)體氨基酸殘基可取代某些或所有L-氨基酸。類似地，也可使用D-和L-異構(gòu)體的混合物。在其中氨基酸為脯氨酸的實(shí)施方案中，R7與R6一起形成吡咯烷環(huán)結(jié)構(gòu)。R6可為任一天然存在的氨基酸側(cè)鏈，例如-CH3(丙氨酸)、-(CH2)3NHCNH2NH(精氨酸)、-CH2CONH2(天冬酰胺)、-CH2COOH(天冬氨酸)、-CH2SH(半胱氨酸)、-(CH2)2CONH2(谷氨酰胺)、-(CH2)2COOH(谷氨酸)、-H(甘氨酸)、-CHCH3CH2CH3(異亮氨酸)、-CH2CH(CH3)2(亮氨酸)、-(CH2)4NH2(賴氨酸)、-(CH2)2SCH3(蛋氨酸)、-CH2Ph(苯丙氨酸)、-CH2OH(絲氨酸)、-CHOHCH3(蘇氨酸)、-CH(CH3)2(纈氨酸)、
-(CH2)3NHCONH2(瓜氨酸)或-(CH2)3NH2(鳥氨酸)。Ph指定為苯基。
在上述化合物中，R7和R8可相同或不同，并且選自H和-COCHR9NR10R11，其中R9為氨基酸的側(cè)鏈，R10和R11可相同或不同，并且選自H和-COCHR12NR13R14，其中R12為氨基酸側(cè)鏈，R13和R14可相同或不同，并且獨(dú)立選自H和-COCHR15NH2。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到肽鏈可以按下列方案延伸至所需要的長度并包括所需要的氨基酸殘基。
在其中OR2和OR3基團(tuán)之一或兩者形成肽酯例如二肽酯、三肽酯、四肽酯等的實(shí)施方案中，肽可為均肽(homopeptide)，即重復(fù)相同的氨基酸，例如精氨酰-精氨酸，或者可為雜肽(heteropeptide)，即由不同的氨基酸組合組成。雜二肽的實(shí)例包括丙氨酰-谷氨酰胺、甘氨酰-谷氨酰胺、賴氨酰-精氨酸等。
熟練的技術(shù)人員可理解，當(dāng)僅一個R7和R8包含連接更多氨基酸的肽鍵，例如二、三和四肽時，所產(chǎn)生的肽鏈將是直鏈。當(dāng)R7和R8均包含肽鍵時，那么該肽可以是支鏈。
在本發(fā)明化合物的還一些其他實(shí)施方案中，R1為H，R2或R3之一為磷酸酯基或H，而另一個R2或R3為OR2或OR3為氨基酸酯例如甘氨酸酯或丙氨酸酯的基團(tuán)。
本發(fā)明也提供了這些化合物藥學(xué)上可接受的鹽以及這些化合物的藥用制劑。
一般而言，與游離酸形式或其鹽形式的曲前列環(huán)素口服生物利用度相比，本文中所描述的化合物具有更高的口服生物利用度。與曲前列環(huán)素的口服生物利用度相比，本文所描述的化合物具有至少25％、50％、100％、200％、400％或更高的口服生物利用度。當(dāng)口服給藥時，這些化合物的絕對口服生物利用度的范圍可在10％、15％、20％、25％、30％及40％、45％、50％、55％、60％或更高。相比而言，曲前列環(huán)素的絕對口服生物利用度大約為10％，雖然曲前列環(huán)素鈉經(jīng)皮下輸注給藥的絕對生物利用度接近為100％。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解，為了任何和所有目的，特別是在提供書面說明書方面，本文中公開的所有范圍，特別是本文中所描述的生物利用度范圍也包括任何和所有可能的子范圍及其子范圍的組合。僅作為一個實(shí)例，20％-40％的范圍可分成20％-32.5％和32.5％-40％、20％-27.5％和27.5％-40％等的范圍。任何所列出的范圍可容易地認(rèn)為是充分描述并且能使相同范圍分成至少二等分、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作為非限定性實(shí)例，本文中所討論的各范圍可容易地分成下端三分之一、中間三分之一和上端三分之一等。本領(lǐng)域技術(shù)人員也將理解，所有語言例如“最高達(dá)”、“至少”、“大于”、“少于”、“多于”等包括所列舉的數(shù)字并指可進(jìn)一步分成如上所討論的子范圍的范圍。同樣地，本文中公開的所有比率也包括在更寬比率范圍內(nèi)的所有子比率。
這些化合物可以通過化合物將是生物可利用的任何途徑以有效量給藥，包括口服和腸胃外途徑。這些化合物可靜脈內(nèi)給藥、局部給藥、皮下給藥、鼻內(nèi)給藥、直腸給藥、肌內(nèi)給藥、透皮給藥或通過其他腸胃外途徑給藥?？诜o藥時，這些化合物可以任何方便的劑型給藥，包括例如膠囊劑、片劑、液體制劑、混懸劑等。
試驗(yàn)表明曲前列環(huán)素接觸皮膚時可產(chǎn)生刺激。相反，本文中公開的某些化合物，一般為曲前列環(huán)素的前藥，不刺激皮膚。因此，本發(fā)明化合物更適于局部或透皮給藥。
當(dāng)給予患者時，上述化合物、特別是結(jié)構(gòu)I化合物是前列環(huán)素樣化合物，用于治療其中前列環(huán)素顯示有益的血管舒張和/或血小板聚集抑制或其他疾病的病癥或疾病，例如用于治療肺動脈高血壓。因此，本發(fā)明提供誘導(dǎo)患者產(chǎn)生前列環(huán)素樣作用的方法，該方法包括給予有該治療需要的患者藥學(xué)有效量的一種或多種本文中描述的化合物，例如上述結(jié)構(gòu)I的那些化合物，優(yōu)選口服給藥。作為實(shí)例，本發(fā)明化合物的血管舒張作用可用于治療肺動脈高血壓，該病由各種形式的結(jié)締組織疾病，例如狼瘡、硬皮病或混合結(jié)締組織疾病引起。這些化合物因此用于肺動脈高血壓的治療。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明也提供通過給予藥學(xué)有效量的結(jié)構(gòu)II化合物及其對映異構(gòu)體和藥學(xué)上可接受的鹽促進(jìn)患者產(chǎn)生前列環(huán)素樣作用的方法
其中， R1獨(dú)立選自H、取代和未取代烷基、芳烷基和其中OR1形成取代或未取代氨甲?；柞サ幕鶊F(tuán)； R2和R3可相同或不同，且獨(dú)立選自H、磷酸酯基以及其中OR2和OR3形成氨基酸酯或蛋白質(zhì)酯的基團(tuán)，條件是R1、R2和R3不全部為H。
在其中OR1形成取代或未取代氨甲?；柞サ幕鶊F(tuán)中，R1可為-CH2CONR4R5，其中R4和R5可相同或不同，且獨(dú)立選自H、OH、取代和未取代烷基、-(CH2)mCH3、-CH2OH及-CH2(CH2)nOH，條件是m為0、1、2、3或4，n為0、1、2、3或4。
在其他誘導(dǎo)血管舒張或治療高血壓的方法中，R1可為C1-C4烷基，例如甲基、乙基、丙基或丁基。在其他方法中，R1為取代或未取代芐基，例如-CH2C6H5、-CH2C6H4NO2、-CH2C6H4OCH3、-CH2C6H4Cl、-CH2C6H4(NO2)2或-CH2C6H4F。芐基可以是鄰位、間位、對位、鄰位/對位取代及其組合。芳環(huán)上合適的取代基包括鹵素(氟、氯、溴、碘)、-NO2基團(tuán)、其中R16為H或C1-C4烷基的-OR16基團(tuán)及其組合。
或者，當(dāng)R1為-CH2CONR4R5，那么R4和R5可相同或不同，且獨(dú)立選自H、OH、-CH3和-CH2CH2OH。在這些方法中，其中R1不為H，通常R2和R3之一或兩者為H。
在某些實(shí)施方案中，R2和R3之一或兩者為H，R1為-CH3、-CH2C6H5。在其他方法中，當(dāng)R2和R3之一或兩者為H，那么R1為-CH2CONR4R5，R4和R5之一或兩者為H、-OH、-CH3、-CH2CH2OH。
在其中R2和R3之一或兩者不為H的方法中，R2和R3可獨(dú)立選自磷酸酯基和其中OR2和OR3為氨基酸酯、二肽酯、三肽酯和四肽酯的基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，R2或R3中只有一個為磷酸酯基。在其中R2和R3中至少一個不為H的方法中，通常R1為H。在其他方法中，R2或R3之一為H，而另一個R2或R3如本文中別處所定義。在某些方法中，R2為H，而R3不為H。在另外的實(shí)施方案中，R1和R3為H，而R2為其中OR2為氨基酸酯或二肽酯的基團(tuán)。在再一些實(shí)施方案中，R1和R2為H，R3為其中OR3為氨基酸酯或二肽酯的基團(tuán)。
在其中OR2和OR3基團(tuán)之一或兩者形成氨基酸酯或肽酯即二肽酯、三肽酯或四肽酯的方法中，這些肽通?？杀硎緸?COCHR6NR7R8，其中R6選自氨基酸側(cè)鏈，R7和R8可相同或不同，且獨(dú)立選自H和-COCHR9NR10R11。在其中氨基酸為脯氨酸的實(shí)施方案中，R7與R6一起形成吡咯烷環(huán)結(jié)構(gòu)。R6可為任一天然存在的氨基酸側(cè)鏈，例如-CH3(丙氨酸)、-(CH2)3NHCNH2NH(精氨酸)、-CH2CONH2(天冬酰胺)、-CH2COOH(天冬氨酸)、-CH2SH(半胱氨酸)、-(CH2)2CONH2(谷氨酰胺)、-(CH2)2COOH(谷氨酸)、-H(甘氨酸)、-CHCH3CH2CH3(異亮氨酸)、-CH2CH(CH3)2(亮氨酸)、-(CH2)4NH2(賴氨酸)、-(CH2)2SCH3(蛋氨酸)、-CH2Ph(苯丙氨酸)、-CH2OH(絲氨酸)、-CHOHCH3(蘇氨酸)、-CH(CH3)2(纈氨酸)、
-(CH2)3NHCONH2(瓜氨酸)或-(CH2)3NH2(鳥氨酸)。Ph指定為苯基。
在上述方法中，R7和R8可相同或不同，并且選自H和-COCHR9NR10R11，其中R9為氨基酸的側(cè)鏈，R10和R11可相同或不同，并且選自H和-COCHR12NR13R14，其中R12為氨基酸側(cè)鏈，R13和R14可相同或不同，并且獨(dú)立選自H和-COCHR15NH2。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到肽鏈可以按下列方案延伸至所需要的長度并包括所需要的氨基酸殘基。
在其中OR2和OR3基團(tuán)之一或兩者形成肽酯例如二肽酯、三肽酯、四肽酯等的實(shí)施方案中，肽可為均肽，即重復(fù)相同的氨基殘極，或者可為雜肽，即由氨基酸的不同組合組成。
熟練的技術(shù)人員可理解，當(dāng)僅R7和R8之一包含連接更多氨基酸的肽鍵，例如二、三和四肽時，所產(chǎn)生的肽鏈將是直鏈。當(dāng)R7和R8均包含肽鍵時，那么肽可以是支鏈。
在還一些其他方法中，R1為H，R2或R3之一為磷酸酯基或H，而另一個R2或R3為OR2或OR3為氨基酸酯例如甘氨酸酯或丙氨酸酯的基團(tuán)。
在某些方法中，所給予的化合物可具有至少是曲前列環(huán)素口服生物利用度25％、50％、100％、200％、400％的口服生物利用度。通常優(yōu)選給予具有更高絕對口服生物利用度的化合物，例如當(dāng)口服給藥時，其絕對口服生物利用度為15％、20％、25％、30％及40％、45％、50％、55％、60％或更高。
曲前列環(huán)素也被發(fā)現(xiàn)可以如2001年12月10日遞交的美國專利申請順序號10/006,197和2002年1月16日遞交的順序號10/047,802中所公開的那樣抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，這兩個專利申請通過引用結(jié)合到本申請中。因此，上述化合物、特別是那些結(jié)構(gòu)I和II的化合物也可用于癌癥和癌癥相關(guān)疾病的治療，因此本發(fā)明提供治療癌癥的藥用組合物和方法。使用本發(fā)明化合物的合適制劑和方法可通過用本發(fā)明化合物，例如結(jié)構(gòu)I和II的化合物、特別是曲前列環(huán)素的前藥替代2002年1月16日遞交的美國專利申請順序號10/006,197和10/047,802中公開的活性化合物來實(shí)現(xiàn)。
下列結(jié)構(gòu)I和II化合物的合成可按下列方法完成 注以下光譜數(shù)據(jù)中；“and”表示“和”；“adjacent to”表示“鄰近”； 曲前列環(huán)素甲酯(2)和曲前列環(huán)素二磷酸酯的合成
曲前列環(huán)素甲酯(2)的合成 曲前列環(huán)素甲酯(2)通過用50ml干燥鹽酸的飽和甲醇溶液處理1.087g(2.8mmol)的曲前列環(huán)素(1)制備。室溫反應(yīng)24小時后，蒸發(fā)甲醇至干，并將殘?jiān)苡?00ml二氯甲烷。二氯甲烷溶液用10％碳酸鉀水溶液洗滌，然后用水冼至中性pH，用硫酸鈉干燥，過濾并真空除去溶劑，以98％的產(chǎn)率得到黃色油狀曲前列環(huán)素甲酯(2)。在隨后的反應(yīng)中未處理直接使用該粗甲酯。
曲前列環(huán)素二磷酸酯(4)的合成 采用Steroids，2(6)，567-603(1963)中的方法。將曲前列環(huán)素甲酯(2)(60mg，0.15mmol)溶于2ml無水吡啶，于40℃真空濃縮先前制備的1M 2-氰基乙基磷酸吡啶鎓的吡啶鹽溶液(0.3ml，0.3mmol)(參考Enzymology，1971，18(c)，54-57中的方法)至干。加入無水吡啶，再濃縮該反應(yīng)混合物；重復(fù)該操作兩次以完全除去水。最后將殘?jiān)苡?ml無水吡啶，并加入190mg (0.9mmol)二環(huán)己基碳二亞胺的2ml無水吡啶溶液。于室溫磁力攪拌密閉燒瓶中的反應(yīng)混合物48小時。加入1ml水，一小時后，真空濃縮該混合物至稠膏狀。用3ml含35mg氫氧化鈉的1/9水/甲醇溶液，于室溫處理該反應(yīng)混合物過夜。濾去形成的白色固體(二環(huán)己基脲)并用水充分洗滌。真空濃縮該水-甲醇溶液幾乎至干，加入水，用正丁醇(3×2ml)、然后用二氯甲烷(1×2ml)萃取該溶液。通過用磺酸型離子交換樹脂(H+循環(huán)-Dowex)處理，調(diào)節(jié)該溶液的pH至9.0，用Dowex樹脂處理更長時間(～12小時)導(dǎo)致TBDMS基團(tuán)的裂解和游離羧基的恢復(fù)。將樹脂過濾并濃縮該溶液至干，得到相應(yīng)的二磷酸酯4(43mg，產(chǎn)率52％)。
曲前列環(huán)素3′-單磷酸酯(8)和曲前列環(huán)素2-單磷酸酯(10)的合成
單TBDMS保護(hù)曲前列環(huán)素甲酯(5和6)的合成 采用Org.Synth.，1998，75，139-145中的方法。將曲前列環(huán)素甲酯(2)(305.8mg，0.75mmol)溶于15ml無水二氯甲烷中，將該溶液在冰浴中冷卻至0℃。加入咪唑(102mg，1.5mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(226.2mg，1.5mmol)，該混合物維持于0℃攪拌30分鐘，然后室溫?cái)嚢柽^夜。加入水(25ml)并分離有機(jī)層。然后用二氯甲烷(3×50ml)萃取水層。有機(jī)層用Na2SO4干燥，溶液過濾并真空除去溶劑，得到447mg粗反應(yīng)產(chǎn)物。該粗反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)柱層析分離(硅膠，35％乙酸乙酯/己烷)，得到140mg 雙-TBDMS保護(hù)的曲前列環(huán)素甲酯、160mg 2-TBDMS保護(hù)的曲前列環(huán)素甲酯(6)和60mg 3′-TBDMS保護(hù)的曲前列環(huán)素甲酯(5)。
曲前列環(huán)素單磷酸酯8/10的合成 采用Steroids，1963，2(6)，567-603中的方法，(8)和(10)的方法相同，起始原料分別為(6)和(5)。將TBDMS保護(hù)的曲前列環(huán)素甲酯(6)(46mg，0.09mmol)溶于2ml無水吡啶中，于40℃真空濃縮先前制備的1M2-氰基乙基磷酸吡啶鎓的吡啶鹽溶液(0.2ml，0.2mmol)(參考Enzymology，1971，18(c)，54-57中的方法)至干。加入無水吡啶，再濃縮該反應(yīng)混合物；重復(fù)該操作兩次以完全除去水。最后將殘?jiān)苡?ml無水吡啶，加入116mg(0.56mmol)二環(huán)己基碳二亞胺的2ml無水吡啶溶液。于室溫、黑暗、磁力攪拌密閉燒瓶中的反應(yīng)混合物48小時。加入5ml水，一小時后，真空濃縮該混合物至稠膏狀。用10ml含100mg氫氧化鈉的1/9水/甲醇溶液，于室溫處理該反應(yīng)混合物過夜。濾去形成的白色固體(二環(huán)己基脲)并用水充分洗滌。真空濃縮該水-甲醇溶液幾乎至干，加入水，用正丁醇(3×10ml)、然后用二氯甲烷(1×10ml)萃取該溶液。通過用磺酸型離子交換樹脂(H+循環(huán)-Dowex)處理，調(diào)節(jié)該溶液的pH至9.0；用Dowex樹脂處理更長時間(～12小時)導(dǎo)致TBDMS基團(tuán)裂解和游離羧基的恢復(fù)。將樹脂過濾并濃縮溶液至干，得到相應(yīng)的單磷酸酯8(33mg，產(chǎn)率68％)。
曲前列環(huán)素甲酯(2)的合成
將(2)(1g；2.56mmol)加入到預(yù)先用氯化氫氣體飽和的甲醇(50ml)中，旋轉(zhuǎn)該混合物得到澄清溶液，室溫放置過夜。真空除去溶劑，殘留物用20％碳酸鉀溶液中和，用二氯甲烷萃取。有機(jī)層用水洗滌，無水硫酸鎂干燥并蒸發(fā)，得到粗產(chǎn)物(0.96g)。經(jīng)制備薄層層析(tlc)純化(硅膠板；展開劑7∶3(v/v)己烷-乙酸乙酯)，得到2(0.803；77.5％)，無色油狀物。
三曲前列環(huán)素(Tritreprostinil)二乙醇胺(UT-15C)的合成 將曲前列環(huán)素酸溶于1∶1摩爾比率的乙醇∶水混合物中，加入二乙醇胺并使溶解。加熱該溶液，在冷卻過程中加入丙酮作為反溶劑。
曲前列環(huán)素甲酯二甘氨酸酯(12)的合成
向磁力攪拌下的(2)甲酯2(0.268g；0.66mmol)的二氯甲烷(30ml)溶液中依次加入N-芐氧羰基甘氨酸對硝基苯基酯(0.766g；2.32mmol)和4-(二甲氨基)吡啶(250mg；2.05mmol)。于20℃攪拌所得黃色溶液24小時，然后用5％氫氧化鈉溶液(20ml)處理，繼續(xù)攪拌15分鐘。加入二氯甲烷(50ml)，分離各層，有機(jī)相用5％氫氧化鈉溶液(6×20ml)、水(30ml)、10％鹽酸(2×40ml)、5％碳酸氫鈉溶液(40ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥。除去溶劑后得到淺黃色粘稠油狀粗產(chǎn)物(11)(0.61g)。經(jīng)閃式硅膠柱層析純化，9/1-1/2(v/v)己烷-乙醚梯度洗脫，得到0.445g(85.3％)11，白色結(jié)晶， m.p.70-72℃.‘F1-NMR[CDCl3；δ(ppm)]3.786(s)(3H，COOCH3)，3.875(d)(2H)and 3.940(d)(2H)(NH-CH2-COO)，4.631(s)(2H，OCH2COOCH3)，4.789(m)(1H，adjacent to OOC-CH2NHcbz)and 4.903(m)(1H，adjacent toOOCCH2NHcbz)，5.09(s)(4H，C6H5CH2O)，5.378(m)(1H)and 5.392(m)(1H)(NH)，7.295-7.329(m)(10H，C6H5).LR ESI-MS(m/z)787.1[M+H]+，804.1[M+NH4]+， 809.3[M+Na]+，825.2[M+K]+，1590.5[2M+NH4]+，1595.6[2M+Na]+. 甲酯二甘氨酸酯(12) 將酯(11)(0.4g；0.51mmol)的甲醇(30ml)溶液置于帕爾(Parr)氫化儀的壓力瓶中，加入10％鈀碳(0.2g；0.197mmol Pd)，關(guān)閉儀器，用氫氣吹掃三次并以50p.s.i加氫。開始攪拌，氫化反應(yīng)于室溫進(jìn)行5小時。真空抽去裝置中的氫氣并用氬氣置換。催化劑經(jīng)硅藻土濾除，濾液真空濃縮，得到0.240g(91％)4，白色固體，m.p.98-100℃。
曲前列環(huán)素芐酯(13)的合成
向攪拌下的(2)(2g；5.12mmol)的無水四氫呋喃(20ml)溶液中，于室溫依次加入芐溴(0.95ml；7.98mmol)和新鮮蒸餾的三乙胺(1.6ml；11.48mmol)，所得溶液回流攪拌12小時。逐漸形成白色沉淀。真空蒸餾除去溶劑，用水(30ml)處理殘?jiān)?。用二氯甲烷萃取時出現(xiàn)乳化現(xiàn)象。只有在用5％鹽酸溶液(20ml)處理之后，才能將有機(jī)層和水層分離。有機(jī)層用水洗滌、無水硫酸鈉干燥、蒸發(fā)，殘留物進(jìn)一步用五氧化二磷減壓干燥，得到黃色粘稠油狀物(2.32g)，再經(jīng)制備薄層層析純化(硅膠板；展開劑1∶2，v/v，己烷/乙醚)。產(chǎn)率81.2％。
曲前列環(huán)素二甘氨酸酯(15)的合成
芐酯二-芐氧羰基甘氨酸酯(14) 向磁力攪拌下的芐酯13(1g；2.08mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液中加入N-芐氧羰基甘氨酸對硝基苯基酯(2.41g；7.28mmol)和4-(二甲氨基)吡啶(788mg；6.45mmol)。于20℃攪拌所得黃色溶液21小時，然后依次用5％氫氧化鈉溶液(6×45ml)、10％鹽酸(2×40ml)、5％碳酸氫鈉溶液(40ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥。除去溶劑，接著用五氧化二磷減壓干燥，得到淺黃色油狀粗產(chǎn)物14(2.61g)。經(jīng)閃式硅膠柱層析純化，9∶1-1∶2(v/v)己烷-乙醚梯度洗脫，得到無色、非常粘稠的油狀物(14-(1.51g；84.1％)。
二甘氨酸酯(15) 酯(14)(0.4g；0.46mmol)的甲醇(30ml)溶液如酯(12)所描述的那樣用10％Pd/C催化氫化。后處理并用五氧化二磷真空干燥，得到0.170g(72.7％)酯15，白色固體，m.p.155-158℃。
曲前列環(huán)素3′-甘氨酸酯19的合成
芐酯單(叔丁基二甲基甲硅烷基)酯(16) 將叔丁基二甲基氯硅烷(0.45g；2.98mmol)的二氯甲烷(8ml)溶液用10分鐘、于室溫滴加到攪拌下的芐酯13(0.83g；1.73mmol)和咪唑(0.33g；4.85mmol)的二氯甲烷(20ml)溶液中。繼續(xù)攪拌過夜，然后加入水(20ml)，攪拌該混合物一小時，分離各層，有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，真空濃縮，得到微黃色油狀物(1.15g)。該粗產(chǎn)物是單-TBDMS(16)和二-TBDMS酯的混合物(1H-NMR)。硅膠柱層析，9∶1(v/v)己烷-乙酸乙酯混合物洗脫，很容易地在最初的組分中得到二-酯(0.618g)，并在隨后的組分中得到酯16(0.353g；相對于13的產(chǎn)率34.4％)。酯16的硅膠薄層層析分析顯示僅有一個斑點(diǎn)(展開劑3∶2(v/v)己烷-乙醚)。所以，在上述反應(yīng)條件下，未觀察到其他可能的異構(gòu)體(側(cè)鏈羥基上的單-TBDMS酯)。
另一個試驗(yàn)，其中叔丁基二甲基氯硅烷∶酯13的摩爾比率降低到1.49(接著該產(chǎn)物進(jìn)行閃式硅膠柱層析，9.5/0.5-3/1(v/v)己烷-乙醚梯度洗脫)，導(dǎo)致不需要的二-OTBDMS副產(chǎn)物的含量降低(36.5％，純的分離產(chǎn)物)。該單-OTBDMS酯組分(45.1％；分離產(chǎn)物)由酯16(98％)和其側(cè)鏈異構(gòu)體(2％)組成，它們可以明顯分離；后者被證明(tlc，NMR)僅存在于單酯組分的最后組分中。
芐酯單(芐氧羰基-甘氨酸)酯(18) 向磁力攪拌下的酯16(0.340g；0.57mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中依次加入N-芐氧羰基甘氨酸對硝基苯基酯(0.445g；1.35mmol)和4-(二甲氨基)吡啶(150mg；1.23mmol)。于20℃攪拌該溶液40小時。如酯11和14的描述后處理，得到含90％17和10％18的粗產(chǎn)物(0.63g)(1H-NMR)。為了完全除去TBDMS保護(hù)基團(tuán)，將該混合物溶于乙醇(30ml)，于室溫?cái)嚢柽^夜進(jìn)行酸水解(5％HCl，7ml)。然后減壓除去溶劑，殘留物用二氯甲烷(3×50ml)萃??；分離有機(jī)層，用水(50ml)洗滌一次，硫酸鈉干燥并真空濃縮，得到粗酯18(0.51g)。如酯11和14那樣閃式柱層析純化，得到酯18無色粘稠油狀物(0.150g；總產(chǎn)率39.1％)。
單甘氨酸酯(19) 酯18(0.15g；0.22mmol)的甲醇(30ml)溶液如酯12和15所描述的那樣用10％Pd/C催化氫化。后處理并用五氧化二磷真空干燥，得到酯10(0.98g；98.0％)，白色閃亮晶體，m.p.74-76℃。LR ESI-MS(m/z)448.2[M+H]+，446.4[M-H]-。
曲前列環(huán)素3′-L-亮氨酸酯22的合成
芐酯單(叔丁基二甲基甲硅烷基)酯單(芐氧羰基-L-亮氨酸)酯(20) 向攪拌下的酯16(0.38g；0.64mmol)和N-芐氧羰基-L-亮氨酸N-羥基丁二酰亞胺酯(0.37g；1.02mmol)的10ml二氯甲烷溶液中加入4-(二甲氨基)吡啶(0.17g；1.39mmol)，然后于室溫繼續(xù)攪拌2天。真空除去溶劑，粗產(chǎn)物(0.9g)進(jìn)行閃式硅膠柱層析，9∶1己烷-乙酸乙酯洗脫；最初收集的組分得到油狀物(0.51g)，根據(jù)其NMR光譜和tlc，證實(shí)為酯20和起始原料酯16的2∶1混合物。制備硅膠薄層層析(展開劑乙酸乙酯-己烷1∶4)得到無色油狀純20(基于7的總產(chǎn)率62.6％)。
芐酯單(芐氧羰基-L-亮氨酸)酯(21) 除了使用1∶5(v/v)氯仿-乙醇混合物代替單獨(dú)使用乙醇以確保均勻外，按照18所描述的用稀鹽酸溶液處理，對單(叔丁基二甲基甲硅烷基)酯20的環(huán)戊烯基羥基進(jìn)行脫保護(hù)。后處理得到20，無色油狀物，產(chǎn)率87.6％。
單L-亮氨酸酯(22) 按照18進(jìn)行21上的芐基和N-芐氧羰基的氫解。后處理得到22(95.3％)，白色固體，m.p.118-120℃。
曲前列環(huán)素2-L-亮氨酸酯25的合成
芐酯單(芐氧羰基-L-亮氨酸)酯(21，23)和二(芐氧羰基-L-亮氨酸)酯(24) 向攪拌下的酯13(0.53g；1.10mmol)和N-芐氧羰基-L-亮氨酸N-羥基丁二酰亞胺酯(0.76g；2.05mmol)的二氯甲烷(30ml)溶液中加入4-(二甲氨基)吡啶(0.29g；2.37mmol)，然后于室溫繼續(xù)攪拌1天。該溶液用二氯甲烷(40mnl)稀釋，依次用5％氫氧化鈉溶液(4×25ml)、10％鹽酸(2×30ml)、5％碳酸氫鈉溶液(50ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥并減壓濃縮，得到粘稠黃色油狀粗產(chǎn)物(0.85g)。薄層層析顯示為復(fù)雜的混合物，其中通過相應(yīng)的rF值可以鑒別出酯13和21以及芐氧羰基-L-亮氨酸僅為次要產(chǎn)物。該粗產(chǎn)物經(jīng)閃式硅膠柱層析，己烷-乙醚梯度洗脫。在以7∶3(v/v)己烷-乙醚洗脫時，最初的組分得到二(芐氧羰基-L-亮氨酸)酯24(進(jìn)行層析產(chǎn)物的6％)，隨后的兩個組分得到單(芐氧羰基-L-亮氨酸)酯23(粗產(chǎn)物的54％，分離得到的純23；相對于2的產(chǎn)率為57.6％)。這兩個化合物的純度經(jīng)分析tlc和NMR檢驗(yàn)。另一個異構(gòu)體，單(芐氧羰基-L-亮氨酸)酯21僅占粗產(chǎn)物的約5％，后者經(jīng)制備薄層層析分離僅得到3∶1的23/21混合物。

單L-亮氨酸酯(25) 按照化合物12的描述進(jìn)行23氫解為酯25的反應(yīng)，只是以35p.s.i.反應(yīng)過夜。后處理并用五氧化二磷真空干燥，定量得到25，白色固體，m.p.153-155℃。
曲前列環(huán)素3′-L-丙氨酸酯30的合成
N-芐氧羰基-L-丙氨酸對硝基苯基酯(27) 向攪拌下的含N-芐氧羰基-L-丙氨酸(1g；4.48mmol)和對硝基苯酚(1g；7.19mmol)的無水四氫呋喃(7ml)溶液中用30分鐘加入1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(1.11g；5.38mmol)的四氫呋喃(5ml)懸浮液。于室溫繼續(xù)攪拌18小時，加入冰醋酸(0.3ml)，濾去1，3-二環(huán)己基脲并于40℃真空除去溶劑，得到粘稠黃紅色油狀物(2.5g)。1H-NMR光譜顯示為N-芐氧羰基-L-丙氨酸對硝基苯基酯(27)、未反應(yīng)的對硝基苯酚和少量DCU的混合物，該混合物不經(jīng)處理直接用于下步反應(yīng)。

芐酯單(芐氧羰基-L-丙氨酸)酯(29) 將4-(二甲氨基)吡啶(0.30g；2.49mmol)的二氯甲烷(3ml)溶液迅速滴加(在5分鐘內(nèi))到磁力攪拌下的酯16(0.37g；0.62mmol)和粗N-芐氧羰基-L-丙氨酸對硝基苯基酯(0.98g)的二氯甲烷(12ml)溶液中。該混合物于室溫?cái)嚢柽^夜，然后用二氯甲烷(50ml)稀釋，并用5％氫氧化鈉溶液(7×35ml)、10％鹽酸(3×35ml)、5％碳酸氫鈉溶液(50ml)徹底洗滌，無水硫酸鈉干燥并減壓濃縮，得到粗酯28(1.1g)。將后者溶于乙醇(30ml)，加入5％鹽酸(8ml)和氯仿(5ml)并攪拌該溶液過夜。真空除去溶劑，殘留物溶于二氯甲烷，用5％碳酸氫鈉溶液洗至pH 7，無水硫酸鈉干燥并蒸發(fā)溶劑，得到粗29(1.04g)。硅膠柱層析純化，己烷-乙醚梯度洗脫，分離得到純29組分(己烷∶乙醚＝1∶1 v/v)，無色非常粘稠油狀物(0.11g；基于16的總產(chǎn)率為25.8％)。
單L-丙氨酸酯(30) 按照12的描述進(jìn)行催化氫化反應(yīng)，除去29的芐基和N-芐氧羰基。得到淺黃色、部分結(jié)晶的油狀酯30(產(chǎn)率97.2％)。
曲前列環(huán)素芐酯的3′-L-纈氨酸酯33的合成
曲前列環(huán)素芐酯13的合成 芐酯11采用J.C.Lee等在Organic Prep.and Proc.Intl.，1996，28(4)，480-483中描述的方法合成。向1(620mg，1.6mmol)和碳酸銫(782.4mg，2.4mmol)的乙腈(30ml)溶液中加入芐溴(0.48ml，4mmol)，該混合物回流攪拌1小時。室溫冷卻后，濾去沉淀并真空濃縮濾液。將殘留物溶于氯仿(150ml)，用2％ NaHCO3水溶液(3×30ml)洗滌。有機(jī)層用鹽水洗滌，Na2SO4干燥，過濾并真空除去溶劑，得到750mg黃色粘稠油狀粗芐酯13(產(chǎn)率98％)。粗芐酯13可經(jīng)柱層析純化(100-0％二氯甲烷(甲醇)，也可在隨后的反應(yīng)中使用粗產(chǎn)物。
TBDMS保護(hù)的曲前列環(huán)素芐酯16的合成 采用Organic Synth.，1998，75，139-145中的方法合成TBDMS保護(hù)的芐酯。將芐酯13(679mg，1.4mmol)溶于無水二氯甲烷(20ml)，并將該溶液在冰浴中冷卻至0℃。加入咪唑(192mg，2.8mmol)和氯化叔丁基-二甲基硅烷(TBDMSCl)(420mg，2.8mmol)，該混合物維持在冰浴中再攪拌半小時，然后使其室溫過夜。向反應(yīng)混合物中加入40ml水并分離有機(jī)層。水層用3×50ml二氯甲烷萃取。合并的有機(jī)層用Na2SO4干燥，過濾并真空除去溶劑。得到795mg產(chǎn)物，證實(shí)為所需單TBDMS保護(hù)的5芐酯及雙-TBDMS保護(hù)芐酯的混合物。硅膠柱層析得到純16(249mg)(洗脫劑35％乙酸乙酯/己烷)。
TBDMS保護(hù)的曲前列環(huán)素芐酯的N-芐氧羰基-L-纈氨酸酯31的合成 采用Tetrahedron Lett.，1978，46，4475-4478中的方法。于室溫?cái)嚢鐽-芐氧羰基-L-纈氨酸(127mg，0.5mmol)、N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(111mg，0.5mmol)、化合物16(249mg，04mmol)和4-(二甲氨基)吡啶(DMAP)(6mg，0.05mmol)的無水二氯甲烷(15ml)溶液，直到完全酯化。過濾該溶液，濾去所形成的N，N-二環(huán)己基脲。濾液用二氯甲烷(80ml)稀釋并用水(3×30ml)、5％乙酸水溶液(2×30ml)洗滌，然后再用水(3×30ml)洗滌。有機(jī)層用Na2SO4干燥并真空蒸發(fā)溶劑，得到369mg粗31。層析(硅膠，35％乙酸乙酯/己烷)得到純31。
曲前列環(huán)素芐酯的3′-N-芐氧羰基-L-纈氨酸酯32的合成 采用Org.Letters，2000，2(26)，4177-4180中描述的方法進(jìn)行化合物31的TBDMS基團(tuán)的裂解。將TBDMS保護(hù)的芐酯的N-芐氧羰基-L-纈氨酸酯31(33mg，0.04mmol)溶于甲醇(5ml)，加入四丁基三溴化銨(TBATB)(2mg，0.004mmol)。于室溫?cái)嚢柙摲磻?yīng)混合物24小時，直到TBDMS完全脫保護(hù)。蒸發(fā)甲醇并將殘留物溶于二氯甲烷。該二氯甲烷溶液用鹽水洗滌，然后用Na2SO4干燥。濾去干燥劑后，將溶劑蒸發(fā)至干，得到30.2mg粗化合物32。
曲前列環(huán)素的3′-L-纈氨酸酯33的合成 芐基和芐基羧基通過在大氣壓下、在10％ wt鈀碳的存在下催化氫化除去。將芐酯的3′-N-芐氧羰基-L-纈氨酸酯32(30.2mg，0.04mmol)溶于甲醇(10ml)并加入催化量的Pd/C。在磁力攪拌下除去燒瓶中的空氣，然后通入氫氣。該反應(yīng)混合物維持在氫氣下并室溫?cái)嚢?4小時，然后真空除去氫氣。將反應(yīng)混合物通過硅藻土層過濾并真空除去溶劑，得到純的曲前列環(huán)素的3′-L-纈氨酸酯33(15mg，0.03mmol)。
曲前列環(huán)素的2-L-纈氨酸酯36/曲前列環(huán)素的二-L-纈氨酸酯37的合成 曲前列環(huán)素的2-L-丙氨酸酯36′/曲前列環(huán)素的二-L-丙氨酸酯37′的合成
曲前列環(huán)素芐酯的2-N-芐氧巔基-L-纈氨酸酯34和曲前列環(huán)素芐酯的二-N-芐氧羰基-L-纈氨酸酯35的合成 采用Tetrahedron Lett.，1978，46，4475-4478中的方法。于室溫?cái)嚢鐽-芐氧羰基-L-纈氨酸(186mg，0.7mmol)、N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(167mg，0.8mmol)、化合物13(367mg，0.8mmol)和4-(二甲氨基)吡啶(DMAP)(12mg，0.09mmol)的無水二氯甲烷(15ml)溶液，直到完全酯化。過濾該溶液，濾去所形成的N，N-二環(huán)己基脲。濾液用二氯甲烷(100ml)稀釋并用水(3×50ml)、5％乙酸水溶液(2×50ml)洗滌，然后再用水(3×50ml)洗滌。有機(jī)層用Na2SO4干燥并真空蒸發(fā)溶劑，得到556mg粗產(chǎn)物。層析(硅膠，35％乙酸乙酯/己烷)分離該產(chǎn)物，得到369.4mg 2-纈氨酸酯34和98mg二-纈氨酸酯35。
曲前列環(huán)素芐酯的2-N-芐氧巔基-L-丙氨酸酯34′和曲前列環(huán)素芐酯的二-N-芐氧羰基-L-丙氨酸酯35′的合成 采用Tetrahedron Lett.，1978，46，4475-4478中的方法。于室溫?cái)嚢鐽-芐氧羰基-L-丙氨酸(187mg，0.84mmol)、N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(175mg，0.85mmol)、化合物13(401mg，0.84mmol)和4-(二甲氨基)吡啶(UMAP)(11.8mg，0.1mmol)的無水二氯甲烷(15ml)溶液，直到完全酯化。過濾該溶液，濾去所形成的N，N-二環(huán)己基脲。濾液用二氯甲烷(100ml)稀釋并用水(3×50ml)、5％乙酸水溶液(2×50ml)洗滌，然后再用水(3×50ml)洗滌。有機(jī)層用Na2SO4干燥并真空蒸發(fā)溶劑，得到516mg粗產(chǎn)物。層析(硅膠，35％乙酸乙酯/己烷)分離該產(chǎn)物，得到93.4mg 2-丙氨酸酯34′和227mg二-丙氨酸酯35′。
曲前列環(huán)素的2-L-纈氨酸酯36/曲前列環(huán)素的二-L-纈氨酸酯37的合成 芐基和芐基羧基通過在大氣壓下、在10％ wt鈀碳的存在下催化氫化除去。將曲前列環(huán)素芐酯的2-N-芐氧羰基-L-纈氨酸酯34(58.2mg，0.08mmol)/曲前列環(huán)素芐酯的二-N-芐氧羰基-L-纈氨酸酯35(55.1mg，0.06mmol)溶于甲醇(10ml)，加入催化量的Pd/C。在磁力攪拌下除去燒瓶中的空氣，然后通入氫氣。該反應(yīng)混合物維持在氫氣下并室溫?cái)嚢?0小時，然后真空除去氫氣。將反應(yīng)混合物通過硅藻土層過濾并真空除去溶劑，得到純的曲前列環(huán)素的2-L-纈氨酸酯36(40mg，0.078mmol)/曲前列環(huán)素的二-L-纈氨酸酯37(23mg，0.04mmol)。
曲前列環(huán)素的2-L-丙氨酸酯36′/曲前列環(huán)素的二-L-丙氨酸酯37′的合成 芐基和芐基羧基通過在大氣壓下、在10％ wt鈀碳的存在下催化氫化除去。將曲前列環(huán)素芐酯的2-N-芐氧羰基-L-丙氨酸酯34′(87.4mg，0.13mmol)/曲前列環(huán)素芐酯的二-N-芐氧羰基-L-丙氨酸酯35′(135mg，0.15mmol)溶于甲醇(15ml)，加入催化量的Pd/C。在磁力攪拌下除去燒瓶中的空氣，然后通入氫氣。該反應(yīng)混合物維持在氫氣下并室溫?cái)嚢?0小時，然后真空除去氫氣。將反應(yīng)混合物通過硅藻土層過濾并真空除去溶劑，得到純的曲前列環(huán)素的2-L-丙氨酸酯36′(57mg，0.12mmol)/曲前列環(huán)素的二-L-丙氨酸酯37′(82mg，0.15mmol)。
曲前列環(huán)素芐酯38a-e的合成
a 4-NO2C6H4CH2；b 4-(CH3O)C6H4CH2；c 2-ClC6H4CH2；d2，4-(NO2)2C6H3CH2；e 4-FC6H4CH2 使用芐酯13的方法進(jìn)行曲前列環(huán)素芐酯38 a-e的合成。
這些化合物的對映異構(gòu)體，如下所示，可用上述試劑的對映體手性試劑和合成子合成。

(-)-曲前列環(huán)素可按如下方法合成
(a)(S)-2-甲基-CBS-氧雜氮雜硼烷(oxazaborolidine)，BH3·SMe2，THF，-30℃，85％。(b)TBDMSCl，咪唑，CH2Cl2，95％。(c)Co2(CO)8，CH2Cl2，2hr.r.t.，然后CH3CN，2hr.回流，98％。(d)K2CO3，Pd/C(10％)，EtOH，50 psi/24 hr.78％。(e)NaOH，EtOH，NaBH4，95％。(f)BnBr，NaH，THF，98％。(g)CH3OH，TsOH，96％。(h)i.對硝基苯甲酸，DEAD，TPP，苯。(i)CH3OH，KOH，94％。(j)Pd/C(10％)，EtOH，50 psi/2 hr，定量。(k)Ph2PLi，THF。(l)i.ClCH2CN，K2CO3，ii.KOH，CH3OH，回流，83％(2步)。
簡而言之，商品藥物(+)-曲前列環(huán)素的對映異構(gòu)體使用立體選擇性分子內(nèi)Pauson Khand反應(yīng)作為關(guān)鍵步驟及側(cè)鏈羥基的Mitsunobu轉(zhuǎn)化合成。(-)-曲前列環(huán)素的絕對構(gòu)型通過L-纈氨酸酰胺衍生物的X-射線結(jié)構(gòu)確定。
使用下列方法制備(-)-曲前列環(huán)素-甲基-L-纈氨酰胺在Ar下向攪拌下的(-)-曲前列環(huán)素(391mg，1mmol)和L-纈氨酸甲酯鹽酸鹽(184mg，1.1mmol)的DMF(10ml)溶液中依次加入pyBOP試劑(1.04g，2mmol)、二異丙基乙胺(0.52ml，3mmol)。反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢柽^夜(15小時)。真空除去溶劑并經(jīng)層析純化，得到白色固體12(481mg，86％)，重結(jié)晶(10％乙酸乙酯/己烷)得到合適的結(jié)晶用于X-射線分析。
這些能夠生成本文中所討論另外化合物的合成流程的各種修改，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。
在循環(huán)系統(tǒng)中釋放曲前列環(huán)素有兩個主要障礙。障礙之一是曲前列環(huán)素的首過效應(yīng)很大。在最初循環(huán)經(jīng)過肝臟時，血漿中約60％的曲前列環(huán)素被代謝，僅剩下所吸收劑量的約40％。其次，口服釋放曲前列環(huán)素的主要障礙是該化合物在胃腸道易于流失。曲前列環(huán)素的滲透性已通過Caco-2單層細(xì)胞測定。測定的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)運(yùn)率的峰值為1.39×106cm/sec，它表示化合物的滲透性強(qiáng)。然而，峰值轉(zhuǎn)運(yùn)率的基值為12.3×106cm/sec，提示曲前列環(huán)素能有效地從漿膜流到上皮細(xì)胞管腔側(cè)。這些數(shù)據(jù)提示曲前列環(huán)素對膜結(jié)合的多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白p-糖蛋白敏感。認(rèn)為p-糖蛋白流出泵能防止某些藥用化合物穿過小腸粘膜細(xì)胞，因此，能防止被吸收入全身循環(huán)。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供包含曲前列環(huán)素、結(jié)構(gòu)I化合物或結(jié)構(gòu)II化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽及其組合，與一種或多種p-糖蛋白抑制劑組合的藥用組合物。美國專利號6,451,815、6,469,022和6,171,786中公開了許多顯示抑制p-糖蛋白的、已知的非細(xì)胞毒藥物。
p-糖蛋白抑制劑包括水溶形式的維生素E、聚乙二醇、泊洛沙姆包括泊洛沙姆F-68、聚環(huán)氧乙烷、聚氧乙烯蓖麻油衍生物包括Cremophor EL和Cremophor RH 40、柯因、(+)-黃杉素、柚苷配基、香葉木苷、槲皮素、環(huán)孢菌素A(也稱為環(huán)孢菌素)、維拉帕米、他莫昔芬、奎尼丁、吩噻嗪及9，10-二氫-5-甲氧基-9-氧代-N-[4-[2-(1，2，3，4-四氫-6，7-二甲氧基-2-異喹啉基)乙基]苯基]-4-吖啶甲酰胺或其鹽。
聚乙二醇(PEGs)為通式H(OCH2CH2)nOH的液體和固體聚合物，其中n大于或等于4，平均分子量范圍在約200-約20,000。PEGs也稱為α-氫-ω-羥基聚-(氧基-1，2-乙二基)聚乙二醇。例如，PEG 200為其中n的平均值為4及平均分子量為約190-約210的聚乙二醇。PEG 400為其中n的平均值介于8.2和9.1之間及平均分子量為約380-約420的聚乙二醇。同樣地，PEG 600、PEG 1500和PEG 4000的n的平均值分別為12.5-13.9、29-36和68-84，平均分子量分別為570-630、1300-1600和3000-3700，PEG 1000、PEG 6000和PEG 8000的平均分子量分別為950-1050、5400-6600和7000-9000。平均分子量在200-20000之間變化的聚乙二醇在藥物科學(xué)領(lǐng)域中熟知并且易于得到。
優(yōu)選用于本發(fā)明的聚乙二醇為具有平均分子量為約200-約20,000的聚乙二醇。更優(yōu)選的聚乙二醇具有平均分子量為約200-約8000。更具體地說，用于本發(fā)明的更優(yōu)選的聚乙二醇為PEG 200、PEG400、PEG 600、PEG 1000、PEG 1450、PEG 1500、PEG 4000、PEG 4600和PEG 8000。用于本發(fā)明的最優(yōu)選的聚乙二醇為PEG 400、PEG 1000、PEG 1450、PEG 4600和PEG 8000。
聚山梨酯80為山梨醇及其酸酐與約20摩爾環(huán)氧乙烷/摩爾山梨醇和山梨醇酸酐共聚的油酸酯。聚山梨酯80由脫水山梨醇單-9-十八烷酸酯聚(氧基-1，2-乙二基)衍生物組成。聚山梨酯80，也稱為吐溫80，在藥學(xué)領(lǐng)域中熟知并且易于得到。
水溶性維生素E，也稱為d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯[TPGS]，為天然來源維生素E的水溶性衍生物。TPGS可通過結(jié)晶的d-α-生育酚酸琥珀酸酯的酸基與聚乙二醇1000酯化制備。該產(chǎn)品在藥學(xué)領(lǐng)域中熟知并且易于得到。例如，水溶性維生素E產(chǎn)品由EastmanCorporation以維生素E TPGS銷售。
柚苷配基為生物黃酮類化合物2，3-二氫-5，7-二羥基-2-(4-羥基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮，也稱為4′，5，7-三羥基黃烷酮。柚苷配基是柚苷(naringen)的苷元，它是在葡萄柚的果實(shí)和殼中發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物。公眾易于從商業(yè)渠道獲得柚苷配基。
槲皮素為生物黃酮類化合物2-(3，4-二羥基苯基)-3，5，7-三羥基-4H-1-苯并吡喃-4-酮，也稱為3，3′，4′，5，7-五羥基黃酮。槲皮素是槲皮甙、蘆丁和其他糖苷的苷元。公眾易于從商業(yè)渠道獲得槲皮素。
香葉木苷是天然存在的黃酮糖苷化合物7-[[6-O-6-脫氧-α-L-吡喃甘露糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基]-5-羥基-2-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮。香葉木苷可從各種植物資源包括柑橘果實(shí)中分離。公眾易于從商業(yè)渠道獲得香葉木苷。
柯因是天然存在的化合物5，7-二羥基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮，可從各種植物資源中分離。公眾易于從商業(yè)渠道獲得柯因。
泊洛沙姆為α-氫-ω-羥基聚(氧乙烯)聚(氧丙烯)聚(氧乙烯)嵌段共聚物。泊洛沙姆是通式為HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH的、環(huán)氧乙烷與環(huán)氧丙烷的系列緊密相關(guān)的嵌段共聚物。例如，泊洛沙姆124是″a″為12、″b″為20、平均分子量為約2090-約2360的液體；泊洛沙姆188是″a″為80、″b″為27、平均分子量為約7680-約9510的固體；泊洛沙姆237是″a″為64、″b″為37、平均分子量為約6840-約8830的固體；泊洛沙姆338是″a″為141、″b″為44、平均分子量為約12700-約17400的固體；泊洛沙姆407是″a″為101、″b″為56、平均分子量為約9840-約14600的固體。泊洛沙姆在藥學(xué)領(lǐng)域中熟知并且易于得到。例如，泊洛沙姆F-68是BASF公司銷售的泊洛沙姆。用于本發(fā)明的、優(yōu)選的泊洛沙姆為如泊洛沙姆188、泊洛沙姆F-68等。
聚氧乙烯蓖麻油衍生物是通過各種量的環(huán)氧乙烷與蓖麻油或氫化蓖麻油反應(yīng)而獲得的系列物質(zhì)。這些聚氧乙烯蓖麻油衍生物在藥學(xué)領(lǐng)域中熟知并且一些不同類型的物質(zhì)有市售，包括BASF公司的Cremophors。聚氧乙烯蓖麻油衍生物是各種疏水和親水組分的復(fù)雜混合物。例如，在聚氧乙烯35蓖麻油(也稱為Cremophor EL)中，疏水成分占總混合物的約83％，主要組分為聚乙二醇蓖麻油酸甘油酯。其他疏水成分包括聚乙二醇脂肪酸酯及某些未變化的蓖麻油。聚氧乙烯35蓖麻油的親水部分(17％)由聚乙二醇和甘油基乙氧基化物組成。
在聚氧乙烯40氫化蓖麻油(Cremophor RH 40)中，該混合物中約75％的組分為疏水性。這些組分主要包括甘油聚乙二醇的脂肪酸酯和聚乙二醇的脂肪酸酯。親水部分由聚乙二醇和甘油乙氧基化物組成。優(yōu)選的、用于本發(fā)明的聚氧乙烯蓖麻油衍生物為聚氧乙烯35蓖麻油，例如Cremophor EL，及聚氧乙烯40氫化蓖麻油，例如Cremophor RH40。Cremophor EL和Cremophor RH 40為BASF公司產(chǎn)品。
聚環(huán)氧乙烷是通式為(OCH2CH2)n的環(huán)氧乙烷非離子均聚物，其中n代表氧基亞乙基的平均數(shù)目?？傻玫皆谒帉W(xué)領(lǐng)域中熟知的各種級別的聚環(huán)氧乙烷和買到一些不同類型的物質(zhì)。聚環(huán)氧乙烷的優(yōu)選級別為市售的NF等。
(+)-黃杉素為(2R-反式)-2-(3，4-二羥基苯基)-2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。(+)-黃杉素的其他常用名有(+)-二氫槲皮素；3，3′，4′，5，7-五羥基-黃烷酮；diquertin；花旗松素(taxifoliol)；和distylin。(+)-黃杉素在藥學(xué)領(lǐng)域中熟知并且易于從商業(yè)渠道獲得。
優(yōu)選的、用于本發(fā)明的p-糖蛋白抑制劑有水溶性維生素E，例如維生素E TPGS，及聚乙二醇。在聚乙二醇中，最優(yōu)選的p-糖蛋白抑制劑有PEG 400、PEG 1000、PEG 1450、PEG 4600和PEG 8000。
p-糖蛋白抑制劑可通過p-糖蛋白抑制劑為生物可利用的任何途徑以有效量給藥，包括口服和腸胃外途徑。雖然口服給藥為優(yōu)選，p-糖蛋白抑制劑也可靜脈內(nèi)、局部、皮下、鼻內(nèi)、直腸、肌內(nèi)或通過其他腸胃外途徑給藥?？诜o藥時，p-糖蛋白抑制劑可以任何方便的劑型給藥，包括例如膠囊劑、片劑、液體制劑、混懸劑等。
通常，p-糖蛋白抑制劑的有效p-糖蛋白抑制量為有效地提供存在于腸的p-糖蛋白介導(dǎo)活性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的活性抑制的量。有效p-糖蛋白抑制量可在日劑量為約5mg-約1000mg p-糖蛋白抑制劑之間變化，取決于所選的特定p-糖蛋白抑制劑、被治療的患者種類、劑量方案及其他因素，這些因素全部在醫(yī)療領(lǐng)域普通技術(shù)人員的評價和估計(jì)能力范圍內(nèi)。然而典型的優(yōu)選量將為約50mg-約500mg，典型的更優(yōu)選量為約100mg-約500mg。p-糖蛋白抑制劑的上述量可每天給予一次至多次。對典型的口服給藥而言，劑量將以每天需要一個劑量、兩個劑量或三個劑量的方案給予。
當(dāng)水溶性維生素E或聚乙二醇被選為p-糖蛋白抑制劑時，典型的優(yōu)選量將為約5mg-約1000mg，典型的更優(yōu)選量為約50mg-約500mg，典型的還更優(yōu)選量將為約100mg-約500mg。水溶性維生素E或聚乙二醇最優(yōu)選量為約200mg-約500mg。水溶性維生素E或聚乙二醇的上述量可每天給予一次至多次。典型地，劑量將以每天需要一個劑量、兩個劑量或三個劑量的方案給予，優(yōu)選一個劑量和兩個劑量。
如本文中所使用的，術(shù)語“聯(lián)合給藥”指給予患者具有血管舒張和/或抑制血小板聚集性質(zhì)的兩種化合物，包括美國專利號4,306,075和5,153,222中描述的化合物，它們包括曲前列環(huán)素和本文中描述的結(jié)構(gòu)I和II化合物及p-糖蛋白抑制劑，以使p-糖蛋白抑制劑抑制腸中p-糖蛋白介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)的藥理作用，在化合物被腸吸收的時候顯現(xiàn)。當(dāng)然，化合物和p-糖蛋白抑制劑可在不同的時間或同時給予。例如，p-糖蛋白抑制劑可在給予治療化合物之前給予患者，以使在準(zhǔn)備給予血管舒張化合物時預(yù)先治療患者。此外，預(yù)先用p-糖蛋白抑制劑治療對患者而言可能更方便，使得在給予第一劑量治療化合物之前p-糖蛋白抑制劑達(dá)到穩(wěn)態(tài)水平。也可預(yù)期血管舒張和/或抑制血小板聚集化合物及p-糖蛋白抑制劑基本上可以同時以單獨(dú)劑型或以同一口服劑型給予。
本發(fā)明還提供血管舒張和/或抑制血小板聚集化合物及p-糖蛋白抑制劑可以單獨(dú)劑型或以同一聯(lián)合口服劑型給予?；衔锖蚿-糖蛋白抑制劑的聯(lián)合給藥可以方便地通過經(jīng)口給予含該化合物和p-糖蛋白抑制劑的聯(lián)合劑型實(shí)現(xiàn)。
因此，本發(fā)明另外的實(shí)施方案為口服給藥的聯(lián)合藥物組合物，該組合物包括有效量的本文中描述的血管舒張和/或抑制血小板聚集化合物及有效量的抑制p-糖蛋白的p-糖蛋白抑制劑。該聯(lián)合口服劑型可提供速釋的血管舒張和/或抑制血小板聚集化合物及p-糖蛋白抑制劑，或可提供緩釋的血管舒張和/或抑制血小板聚集化合物及p-糖蛋白抑制劑之一或兩者。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地決定該聯(lián)合劑型的適當(dāng)性質(zhì)，以使血管舒張和/或抑制血小板聚集化合物及p-糖蛋白抑制劑的聯(lián)合給藥獲得理想的效果。
因此，本發(fā)明提供通過p-糖蛋白抑制劑的聯(lián)合給藥提高曲前列環(huán)素、結(jié)構(gòu)I或II藥物及其藥學(xué)上可接受的鹽的生物利用度。通過這些化合物與p-糖蛋白抑制劑的聯(lián)合給藥，相對于在無p-糖蛋白抑制劑情況下在血液循環(huán)中的量，可增加化合物的總量。因此，本發(fā)明的聯(lián)合給藥可導(dǎo)致與化合物單獨(dú)給藥相比的本發(fā)明化合物AUC的增加。
典型地，通過測量給藥后各時間點(diǎn)的該藥血藥濃度評定生物利用度，然后對相對于時間所獲得的值積分，得出藥物在血中循環(huán)的總量。該測量稱為曲線下面積(AUC)，是藥物生物利用度的直接測量。
在不限制本發(fā)明范圍的情況下，相信在某些實(shí)施方案中，在曲前列環(huán)素的R2和R3羥基上衍生化，可通過封閉這些位置幫助克服曲前列環(huán)素經(jīng)口釋放的障礙，因此可減慢代謝速度使化合物避免某些首過效應(yīng)。并且，由于具有暴露的氨基酸，前藥可主動地被存在于胃腸道的二肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)吸收。因此，本發(fā)明提供如那些在結(jié)構(gòu)I和II中發(fā)現(xiàn)的化合物，這些化合物可降低曲前列環(huán)素的首過效應(yīng)和/或降低胃腸道的流出機(jī)制。
在某些治療患者高血壓方法的實(shí)施方案中，患者為哺乳動物，在某些實(shí)施方案中為人。
藥物制劑可包括任何上述實(shí)施方案中單獨(dú)或聯(lián)合的任何化合物，與如本文中所描述的那些藥學(xué)上可接受的載體的組合。
本發(fā)明也提供組合物，該組合物可通過一種或多種本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽與藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、粘合劑、稀釋劑等混合制備，用于治療或改善各種與血管收縮和/或血小板聚集相關(guān)的疾病。治療有效劑量還指能導(dǎo)致改善疾病癥狀的一種或多種本發(fā)明化合物的量。本發(fā)明藥用組合物可通過本領(lǐng)域眾所周知的方法制備，例如其中有常規(guī)制粒、混合、溶解、填充膠囊、冷凍干燥、乳化或研磨工序。組合物可為例如顆粒劑、散劑、片劑、膠囊劑、糖漿劑、栓劑、注射劑、乳劑、酏劑、混懸劑或溶液劑。本發(fā)明組合物可配制成用于各種給藥途徑，例如經(jīng)口給藥、經(jīng)粘膜給藥、直腸給藥、經(jīng)皮或皮下給藥以及鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)或心室內(nèi)注射。本發(fā)明化合物也可通過上述任何途徑給藥，例如以局部形式而不是以如緩釋注射劑的全身形式給藥。下列劑型以實(shí)例的方式給出而不應(yīng)視為對本發(fā)明的限制。
對經(jīng)口、口頰和舌下給藥而言，散劑、混懸劑、顆粒劑、片劑、丸劑、膠囊劑、軟膠囊劑和膠囊形片劑為可接受的固體劑型。這些劑型可通過例如將一種或多種本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽與至少一種添加劑或賦形劑例如淀粉或其他添加劑混合制備。合適的添加劑或賦形劑有蔗糖、乳糖、纖維素糖、甘露醇、氫化麥芽糖(maltitol)、葡聚糖、山梨醇、淀粉、瓊脂、藻酸鹽、殼多糖、殼聚糖、果膠、黃芪膠、阿拉伯膠、明膠、膠原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物或甘油酯、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素和/或聚乙烯吡咯烷酮。口服劑型可任選含其他有助于給藥的成分，例如非活性的稀釋劑，或潤滑劑例如硬脂酸鎂，或防腐劑例如尼泊金酯或山梨酸，或抗氧化劑例如抗壞血酸、生育酚或半胱氨酸，崩解劑、粘合劑、增稠劑、緩沖劑、甜味劑、調(diào)味劑或香味劑。另外，為了便于識別可加入染料或顏料。片劑可進(jìn)一步用合適的、本領(lǐng)域已知的包衣材料處理。
另外，試驗(yàn)表明本發(fā)明化合物，包括曲前列環(huán)素、特別是結(jié)構(gòu)I和II的化合物釋放至十二指腸時提高了生物利用度。因此，本發(fā)明的一個實(shí)施方案涉及優(yōu)先釋放所需化合物至十二指腸，以及能夠?qū)崿F(xiàn)十二指腸釋放的藥物制劑。十二指腸給藥可通過任何本領(lǐng)域已知的方法實(shí)現(xiàn)。在這些實(shí)施方案之一中，本發(fā)明化合物可配制成腸溶劑型。一般而言，腸溶劑型通常用聚合物包衣，該聚合物在低pH下不溶，但當(dāng)暴露于pH 3或以上時能迅速溶解。該釋放形式利用了胃和十二指腸pH的差別，胃中的pH約為1-2，而十二指腸中的pH傾向于大于4。
口服給藥的液體劑型可為藥學(xué)上可接受的乳劑、糖漿劑、酏劑、混懸劑、膏劑和溶液劑，這些劑型可含非活性稀釋劑，例如水。藥物制劑可如液體混懸劑或溶液劑那樣，使用無菌液體例如但不限于油、水、醇及其組合制備?？杉尤胨帉W(xué)上合適的表面活性劑、懸浮劑、乳化劑以用于經(jīng)口或腸胃外給藥。
如上所述，混懸劑可包括油。該油包括但不限于花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油和橄欖油?；鞈覄┮部珊舅狨ダ缬退嵋阴ァ⒍罐⑺岙惐?、脂肪酸甘油酯和乙?；舅岣视王??；鞈覄┛砂?，例如但不限于乙醇、異丙醇、十六烷醇、甘油和丙二醇。醚，例如但不限于聚(乙二醇)、石油碳?xì)浠衔锢绲V物油和凡士林；和水也可用于混懸劑制劑。
注射劑型通常包括水性混懸劑或油性混懸劑，這些劑型可使用合適的分散劑或濕潤劑和懸浮劑制備。注射形式可為溶液相或?yàn)榛鞈覄┬问?，可用溶劑或稀釋劑制備?？山邮艿娜軇┗蛉苊桨o菌水、林格氏液或等滲鹽水溶液。或者，無菌油可用作溶劑或懸浮劑。優(yōu)選油或脂肪酸是非揮發(fā)性的，包括天然或合成油、脂肪酸、甘油單-、二-或三-酯。
對注射劑而言，藥物制劑可為適用于與如上所述的合適溶液再組成的粉末。這些粉末的實(shí)例包括但不限于凍干、旋轉(zhuǎn)干燥或噴霧干燥粉末，無定形粉末、顆粒、沉淀物或微粒。對注射劑而言，制劑可任選含穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、生物利用度調(diào)節(jié)劑及其組合?；衔锟膳渲瞥赡c胃外給藥注射劑，例如一次性大劑量濃注(bolus)或連續(xù)輸注。注射劑的單位劑型可為安瓿或?yàn)槎鄤┝咳萜鳌?br> 除了上述有代表性的那些劑型外，藥學(xué)上可接受的賦形劑和載體通常對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的，因此包括在本發(fā)明內(nèi)。例如在″Remingtons Pharmaceutical Sciences″Mack Pub.Co.，New Jersey(1991)中描述了這些賦形劑和載體，它通過引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明的制劑可設(shè)計(jì)成如下所述的短效、速釋、長效和緩釋制劑。因此，藥物制劑也可配制成控釋或緩釋制劑。
本發(fā)明組合物也包含例如微團(tuán)(micelles)或脂質(zhì)體，或某些其他膠囊化形式，或可以延續(xù)釋放形式給藥以提供長時間儲存和/或釋放效果。因此，藥物制劑可壓制成微型藥片或圓柱形，可在肌肉內(nèi)植入或作為貯庫注射劑皮下植入，或可做成如斯滕特氏印模(stents)植入片。此類植入片可采用已知的惰性材料例如硅氧烷和可生物降解的聚合物。
具體的劑量可根據(jù)疾病的情況、年齡、體重、一般健康情況、性別和患者的飲食、給藥間隔、給藥途徑、排泄速度和聯(lián)合用藥調(diào)節(jié)。任何上述含有效量的劑型均在常規(guī)試驗(yàn)的范圍內(nèi)，因此也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
治療有效劑量可隨給藥途徑和劑型而變化。優(yōu)選的本發(fā)明化合物為顯示高治療指數(shù)的制劑。治療指數(shù)是毒性作用和治療作用之間的劑量比率，它可用LD50和ED50之間的比率表示。LD50是總體50％的致死劑量，而ED50是總體50％的治療有效劑量。LD50和ED50可通過動物細(xì)胞培養(yǎng)或試驗(yàn)動物的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法確定。
制備藥物制劑的方法包括將任何上述化合物與藥學(xué)上可接受的載體和水或水溶液混合。
本發(fā)明的藥物制劑和藥物包括上述結(jié)構(gòu)I、II化合物或其藥學(xué)上可接受鹽的任何實(shí)施方案中的任何化合物與藥學(xué)上可接受的載體的組合。因此，本發(fā)明化合物可用于制備藥物和藥物制劑。在某些此類實(shí)施方案中，藥物和藥物制劑包含結(jié)構(gòu)I化合物或其藥學(xué)上可接受鹽的任何實(shí)施方案中的任何化合物。本發(fā)明也提供結(jié)構(gòu)I、II化合物或其藥學(xué)上可接受鹽的任何實(shí)施方案中的任何化合物用于前列環(huán)素樣作用的用途。本發(fā)明也提供結(jié)構(gòu)I、II化合物或其藥學(xué)上可接受鹽的任何實(shí)施方案中的任何化合物在治療肺動脈高血壓中的用途。
本發(fā)明也涉及包含一種或多種結(jié)構(gòu)I或II化合物的藥劑盒以及使用這些化合物的說明。在另一個實(shí)施方案中，提供了含本文中描述的具有前列環(huán)素樣作用的化合物與一種或多種p-糖蛋白抑制劑組合的藥劑盒，以及使用該藥劑盒的說明。
作為例證，本發(fā)明藥劑盒可包括一種或多種含本發(fā)明生物增強(qiáng)劑的片劑、膠囊劑、膠囊形片劑、軟膠囊或液體制劑，及一種或多種含本文中所描述的前列環(huán)素樣作用化合物的片劑、膠囊劑、膠囊形片劑、軟膠囊或液體制劑，劑量在上述范圍內(nèi)。此類藥劑盒可在醫(yī)院、診所、醫(yī)生辦公室或患者家中使用，以便于增強(qiáng)劑和目標(biāo)藥物的聯(lián)合給藥。藥劑盒也應(yīng)包括增強(qiáng)劑和目標(biāo)藥物聯(lián)合給藥的插入印刷給藥信息。
在本申請中使用下列縮寫和定義 通常，涉及某些元素例如氫或H是指包括所有該元素的同位素。例如，如果R基團(tuán)定義為包括氫或H，它也包括氘和氚。
本文中所使用的術(shù)語“p-糖蛋白抑制劑”指抑制存在于腸中的、p-糖蛋白介導(dǎo)的活性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)活性的有機(jī)化合物。該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將從腸腔吸收的藥物主動轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腸上皮，并回收進(jìn)入腸腔的藥物。該p-糖蛋白介導(dǎo)的活性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)抑制將導(dǎo)致更少的藥物被轉(zhuǎn)運(yùn)回腸腔，因此將增加通過腸上皮的凈藥物轉(zhuǎn)運(yùn)，并將增加藥物最終在血中的量。
本文中所用的短語“口服生物利用度”和“經(jīng)口給藥生物利用度”指經(jīng)口給予患者給定量藥物的全身利用度(即血/血漿水平)。
短語“未取代烷基”指不含雜原子的烷基。因此該短語包括直鏈烷基例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。該短語也包括直鏈烷基的支鏈異構(gòu)體，包括但不限于下列作為實(shí)例提供的基團(tuán)-CH(CH3)2、-CH(CH3)(CH2CH3)、-CH(CH2CH3)2、-C(CH3)3、-C(CH2CH3)3、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH(CH2CH3)2、-CH2C(CH3)3、-CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2CH2CH(CH2CH3)2、-CH2CH2C(CH3)3、-CH2CH2C(CH2CH3)3、-CH(CH3)CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)2、-CH(CH2CH3)CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3)及其他。該短語也包括環(huán)狀烷基例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基和環(huán)辛基及由如上所定義的直鏈和支鏈烷基取代的此類環(huán)。該短語也包括多環(huán)烷基，例如但不限于金剛烷基(adamantyl)降冰片基、雙環(huán)[2.2.2]辛基和由如上所定義的直鏈和支鏈烷基取代的此類環(huán)。因此，短語未取代烷基包括伯烷基、仲烷基和叔烷基。未取代烷基可與母體化合物中的一個或多個碳原子、氧原子、氮原子和/或硫原子連接。優(yōu)選的未取代烷基包括直鏈和支鏈烷基和具有1-20個碳原子的環(huán)狀烷基。更優(yōu)選的此類未取代烷基具有1-10個碳原子，還更優(yōu)選的此類基團(tuán)具有1-5個碳原子。最優(yōu)選的未取代烷基包括具有1-3個碳原子的直鏈和支鏈烷基并包括甲基、乙基、丙基和-CH(CH3)2。
短語“取代烷基”指如上所定義的未取代烷基，其中一個或多個與碳或氫相連的鍵被與非氫和非碳原子相連的鍵置換，這些原子包括例如但不限于鹵化物中的鹵原子例如F、Cl、Br和I；基團(tuán)例如羥基、烷氧基、芳氧基和酯基中的氧原子；基團(tuán)例如巰基、烷基和芳基硫化物基團(tuán)、砜基、磺酰基和亞砜基中的硫原子；基團(tuán)例如胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳胺、烷基芳胺、二芳胺、N-氧化物、酰亞胺和烯胺中的氮原子；基團(tuán)例如三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基中的硅原子；及各種其他基團(tuán)中的其他雜原子。取代烷基也包括其中一個或多個與碳或氫原子相連的鍵被與雜原子相連的鍵置換的基團(tuán)，這些雜原子如羰基、羧基和酯基中的氧原子；基團(tuán)例如亞胺、肟、腙和腈中的氮原子。其中優(yōu)選的取代烷基包括其中一個或多個與碳或氫原子相連的鍵被一個或多個與氟原子相連的鍵置換的烷基。取代烷基的一個實(shí)例為三氟甲基和含三氟甲基的其他烷基。其他烷基包括其中一個或多個與碳或氫原子相連的鍵被與氧原子相連的鍵置換的那些基團(tuán)，因而取代烷基含羥基、烷氧基、芳氧基或雜環(huán)基氧基。其他烷基還包括具有胺、烷基胺、二烷基胺、芳胺、(烷基)(芳基)胺、二芳胺、雜環(huán)胺、(烷基)(雜環(huán)基)胺、(芳基)(雜環(huán)基)胺或二雜環(huán)基胺基團(tuán)的烷基。
短語“未取代芳基烷基”指如上所定義的未取代烷基，其中未取代烷基的氫或碳鍵被與如上所定義的芳基相連的鍵置換。例如，甲基(-CH3)是未取代烷基。如果甲基的氫原子被與苯基相連的鍵置換，例如如果甲基的碳原子與苯的碳原子相連，那么該化合物為未取代芳基烷基(即芐基)。因此該短語包括但不限于例如芐基、二苯基甲基和1-苯基乙基(-CH(C6H5)(CH3))的基團(tuán)。
短語“取代芳基烷基”具有關(guān)于未取代芳基烷基相同的含義，取代的芳基具有關(guān)于未取代芳基。然而，取代芳基烷基也包括其中該基團(tuán)烷基部分的碳或氫鍵被與非碳或非氫原子相連的鍵置換的基團(tuán)。取代芳基烷基的實(shí)例包括但不限于-CH2C(＝O)(C6H5)和-CH2(2-甲基苯基)。
“藥學(xué)上可接受的鹽”包括與無機(jī)堿、有機(jī)堿、無機(jī)酸、有機(jī)酸或堿性或酸性氨基酸成的鹽。作為無機(jī)堿鹽，本發(fā)明包括例如堿金屬例如鈉或鉀的鹽；堿土金屬例如鈣和鎂或鋁的鹽；及氨鹽。作為有機(jī)堿鹽，本發(fā)明包括例如三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺的鹽。作為無機(jī)酸鹽，本發(fā)明包括例如鹽酸、氫硼酸(hydroboric acid)、硝酸、硫酸和磷酸的鹽。作為有機(jī)酸鹽，本發(fā)明包括例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、富馬酸、草酸、乳酸、酒石酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、甲磺酸、苯磺酸和對甲苯磺酸的鹽。作為堿性氨基酸鹽，本發(fā)明包括例如精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸的鹽。酸性氨基酸包括例如天冬氨酸和谷氨酸。
本發(fā)明上下文中的“治療”指減輕與生物學(xué)病癥、障礙或疾病相關(guān)的癥狀，或阻止那些癥狀的進(jìn)一步發(fā)展或惡化，或防止或預(yù)防疾病或障礙。例如，在治療患肺動脈高血壓患者的有關(guān)內(nèi)容中，成功的治療可包括減少肺和/或全身動脈血管床的直接血管舒張及抑制血小板聚集。該血管舒張的結(jié)果通常將減少右和左心室的后負(fù)荷并增加心臟輸出和心搏排血量。也可產(chǎn)生劑量相關(guān)的負(fù)性肌肉收縮和松弛作用。這些身體作用的外在表現(xiàn)可包括減少高血壓癥狀，例如呼吸急促，和增加運(yùn)動能力。
如此一般描述的本發(fā)明，通過參考下列實(shí)施例將更易于理解，這些實(shí)施例為例證目的提供，無意限定本發(fā)明。
實(shí)施例 實(shí)施例1 在該實(shí)施例中，比較了大鼠經(jīng)口、十二指腸內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)及通過門靜脈內(nèi)給藥后曲前列環(huán)素的生物利用度，以確定對生物利用度可能存在的障礙。除生物利用度外，還測定了許多藥代動力學(xué)參數(shù)。
動物給藥 曲前列環(huán)素的生物利用度用Sprague-Dawley雄性大鼠評價。十五只手術(shù)改變大鼠購自Hilltop Lab Animals(Scottdale，PA)。動物從Hilltop運(yùn)送至吸收系統(tǒng)的West Chester University設(shè)施(West Chester，PA)，它們在用于該研究之前至少在其中飼養(yǎng)二十四小時。給藥前動物禁食約16小時。將十五只用于該研究的大鼠分成五組(I、II、III、IV和V)。
動物的重量和給藥方案列于表1。
表1 在下列時間點(diǎn)取樣。
IV和IPV0(給藥前)2、5、15、30、60、120、240、360、480分鐘 ID、IC和口服0(給藥前)、5、15、30、60、120、240、360、480分鐘 從插套管大鼠的頸靜脈中收集約0.50-0.75mL全血。將血轉(zhuǎn)移至肝素化試管中，置于冰上直到離心。離心后，將血漿置于冰上直至于-70℃冷凍，然后運(yùn)送至吸收系統(tǒng)。
血漿樣品分析 樣品用下列方法進(jìn)行分析 給藥溶液的制備 給藥溶液通過將15.2mg曲前列環(huán)素二乙醇胺(12.0mg游離酸形式)與24mL 5％葡萄糖混合制備。然后超聲該溶液直到溶解，最終濃度為0.5mg/mL。給藥溶液的最終pH為4.6。給藥時，該給藥溶液為澄清和均勻。
標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的制備 為了測定大鼠血漿樣品中曲前列環(huán)素的濃度，用收集在肝素中的大鼠血漿制備標(biāo)準(zhǔn)品，使分別含1000、300、100、30、10、3、1和0.3ng/mL曲前列環(huán)素，所用肝素從Lampire生物實(shí)驗(yàn)室(Lot#021335263)獲得。血漿標(biāo)準(zhǔn)品與血漿樣品同樣方法處理。
血漿樣品經(jīng)固相萃取制備。萃取板平衡后，將150μL血漿樣品置于孔中并抽真空。然后萃取床用600μL乙腈∶去離子水(25∶75)(含0.2％甲酸)洗滌?；衔镉?00μL 90％乙腈和10％乙酸銨洗脫。收集洗脫液并蒸發(fā)至干。殘?jiān)儆?50μL乙腈∶去離子水(50∶50)(含0.5μg/ml1-丁基-3-對甲苯磺?；?用作內(nèi)標(biāo)))重新組成。
HPLC條件 色譜柱Keystone Hypersil BDS C18 30×2mm i.d.，3μm。
流動相緩沖液25mM NH4OH至pH 3.5 w/85％甲酸。
儲器A10％緩沖液和90％水。
儲器B10％緩沖液和90％乙腈。
流動相組成 梯度程序 流速300μL/min 進(jìn)樣量10μL 運(yùn)行時間6.0min. 保留時間2.6min. 質(zhì)譜 儀器PE SCIEX API 2000 接口電噴霧(″Turbo離子噴霧″) 方式多反應(yīng)監(jiān)控(MRM) 噴霧氣體25 干燥氣體60，350℃ 屏障氣體25 離子噴霧-5000V 孔-80V 環(huán)-350VQ010V IQ111V ST15V R0111V IQ235V R0240V IQ355V R0345V CAD氣體4 方法驗(yàn)證 表2列出了大鼠血漿曲前列環(huán)素峰值平均回收率(n＝6)和變異系數(shù)(c.v.)。所有樣品均與用50∶50 dH2O∶乙腈(含0.5μg/mL 1-丁基-3-對甲苯磺?；?制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，以確定曲前列環(huán)素從血漿中回收的百分率。
表2方法的準(zhǔn)確度和精密度 藥代動力學(xué)分析 對各時間點(diǎn)的平均血漿濃度進(jìn)行了藥代動力學(xué)分析。
數(shù)據(jù)用藥代動力學(xué)程序WinNonlin v.3.1(2)進(jìn)行非房室分析。
結(jié)果 臨床觀察 在開始試驗(yàn)前，應(yīng)注意曲前列環(huán)素的上限-藥理劑量必須達(dá)到能以適當(dāng)靈敏度分析的血漿濃度。用1mg/kg的劑量，在靜脈內(nèi)和門靜脈內(nèi)給藥的動物中觀察到某些副作用。
給藥五分鐘后，所有靜脈內(nèi)給藥的大鼠均顯示出極度嗜眠的跡象，但是給藥后三十分鐘完全恢復(fù)正常活動。另外，給藥后十五分鐘，所有三只門靜脈內(nèi)給藥的動物顯示出嗜眠的跡象。在取三十分鐘樣品前，有一只大鼠(#123)死亡。其他大鼠完全恢復(fù)。其余動物在給予化合物后未顯示出任何副反應(yīng)。
樣品分析 各給藥途徑的平均血漿濃度列于表3。
表3 平均(n＝3)血漿濃度(ng/mL) *n＝2， λ濃度在定量分析方法的限度之下(LOQ) 靜脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)、十二指腸內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)和口服給藥的血漿濃度對時間曲線如圖1和2所示。圖3顯示所有五種給藥途徑的平均血漿濃度對時間曲線。在這些圖所顯示的試驗(yàn)中，使用二乙醇胺鹽。表4顯示所測定的曲前列環(huán)素的藥代動力學(xué)參數(shù)。各大鼠個體的生物利用度列于表5。
表4 大鼠中曲前列環(huán)素平均生物利用度和藥代動力學(xué)參數(shù) *歸一化至大鼠的平均重量 ND未測定 ψ推斷值 表5 大鼠個體的曲前列環(huán)素生物利用度
NA不適用 ND未測定 結(jié)論 曲前列環(huán)素的末旗血漿半衰期為94分鐘。曲前列環(huán)素的分布相具有10.3分鐘的半衰期，并且該化合物超過90％的分布和消除出現(xiàn)在給藥后60分鐘。分布體積(Vd＝1.98L/kg)大于大鼠體內(nèi)總水量(0.67L/kg)，提示其在組織內(nèi)更廣泛的分配。曲前列環(huán)素的全身清除率(88.54mL/min/kg)大于肝血流量，表明該化合物的消除涉及肝外清除機(jī)制。
曲前列環(huán)素的首過肝消除致使平均門靜脈內(nèi)生物利用度為40.3％。十二指腸內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)和口服給藥后觀察到迅速但不完全的吸收(Tmax≤5min)。通過將門靜脈內(nèi)生物利用度(40.3％)和十二指腸內(nèi)的生物利用度(24.1％)相比，發(fā)現(xiàn)似乎約60％的化合物在腸內(nèi)被吸收。平均十二指腸內(nèi)生物利用度幾乎比口服生物利用度大三倍，提示曲前列環(huán)素在胃中的降解或胃排空可能影響其全身吸收的程度。
實(shí)施例2 在該實(shí)施例中，在經(jīng)口給予雄性Sprague-Dawley大鼠單劑量的下列化合物后，測定曲前列環(huán)素濃度
曲前列環(huán)素芐酯
曲前列環(huán)素二甘氨酸酯
曲前列環(huán)素甲酯 實(shí)驗(yàn) 給藥溶液的制備 所有給藥溶媒均在給藥前少于2小時制備。
1.曲前列環(huán)素甲酯 曲前列環(huán)素甲酯溶液通過將2.21mg曲前列環(huán)素甲酯溶解于0.85mL二甲基乙酰胺(DMA)制備。然后用7.65mL PEG 400∶聚山梨酯80∶水(40∶1∶49)稀釋該溶液。給藥溶媒的最終濃度為0.26mg/mL曲前列環(huán)素甲酯，相當(dāng)于0.25mg/mL曲前列環(huán)素。給藥溶媒在給藥時為澄清溶液。
2.曲前列環(huán)素芐酯 曲前列環(huán)素芐酯溶液通過將2.58mg曲前列環(huán)素芐酯溶解于0.84mL二甲基乙酰胺(DMA)制備。然后用7.54mL PEG 400∶聚山梨酯80∶水(40∶1∶49)稀釋該溶液。給藥溶媒的最終濃度為0.268mg/mL曲前列環(huán)素芐酯，相當(dāng)于0.25mg/mL曲前列環(huán)素。給藥溶媒在給藥時為澄清溶液。
3.曲前列環(huán)素二甘氨酸酯 曲前列環(huán)素二甘氨酸酯溶液通過將1.86mg化合物溶解于0.58mL二甲基乙酰胺(DMA)制備。然后用5.18mL PEG 400∶聚山梨酯80∶水(40∶1∶49)稀釋該溶液。給藥溶媒的最終濃度為0.323mg/mL曲前列環(huán)素二甘氨酸酯，相當(dāng)于0.25mg/mL曲前列環(huán)素。給藥溶媒在給藥時為澄清溶液。
動物給藥 給予各前藥后曲前列環(huán)素的血漿濃度用Sprague-Dawley雄性大鼠評價。大鼠購自Hilltop Lab Animals(Scottdale，PA)。動物從Hilltop運(yùn)送至吸收系統(tǒng)的West Chester大學(xué)設(shè)施(West Chester，PA)。在用于該研究之前至少在其中飼養(yǎng)二十四小時。給藥前動物禁食約16小時。將用于該研究的大鼠分成三組(I、II和III)。組I-III在同一天給藥。
動物的重量和給藥方案列于表6。
表6-研究設(shè)計(jì) *該前藥劑量＝0.500mg/kg活性曲前列環(huán)素 動物通過經(jīng)口管飼給藥。血樣在下列時間點(diǎn)從頸靜脈插管內(nèi)取樣 0(給藥前)、5、15、30、60、120、240、360和480分鐘 取血樣并置于含30μL 500單位/mL肝素鹽水溶液的試管中，以13,000rpm離心10分鐘。然后移取約200μL血漿并分散在含4μL乙酸的合適標(biāo)記的聚丙烯試管中，以穩(wěn)定樣品中剩余的任何前藥。于-20℃冷凍血漿樣品并連冰一起轉(zhuǎn)移至吸收系統(tǒng)Exton設(shè)施。將它們儲存于-80℃冰箱待分析取用。
血漿樣品分析 血漿樣品按實(shí)施例1所描述方法分析。簡而言之，通過液-液萃取法從血漿中萃取曲前列環(huán)素，然后進(jìn)行LC/MS/MS分析。分析驗(yàn)證結(jié)果在實(shí)施例1中已報(bào)道。分析方法的定量下限(LLOQ)為0.01ng/mL。不測定樣品中的未變化前藥。
分析運(yùn)行的接受標(biāo)準(zhǔn) 每次分析時采用每條曲線最少五個點(diǎn)的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線和最少兩個質(zhì)量控制樣品(QCs)。將各給藥途徑通過用于后-計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)曲線括入括弧。為了使運(yùn)行被接受，標(biāo)準(zhǔn)品和QCs必須在±15％(20％，LLOQ)準(zhǔn)確度和精密度內(nèi)。至少75％的所有標(biāo)準(zhǔn)品和QCs必須通過接受標(biāo)準(zhǔn)。
藥代動力學(xué)分析 在各時間點(diǎn)，對每只大鼠的曲前列環(huán)素血漿濃度進(jìn)行了藥代動力學(xué)分析，并對各時間點(diǎn)上各組中所有三只大鼠的平均血漿濃度進(jìn)行了藥代動力學(xué)分析。數(shù)據(jù)用藥代動力學(xué)程序WinNonlin v.3.1(2)進(jìn)行非房室分析。
結(jié)果 研究觀察 經(jīng)口給予曲前列環(huán)素甲酯、曲前列環(huán)素芐酯或曲前列環(huán)素二甘氨酸酯后，未觀察到副反應(yīng)。
酸化大鼠血漿中前藥的血漿穩(wěn)定性 為了終止前藥向活性物質(zhì)的任何轉(zhuǎn)化，取樣后將血漿酸化。在離心除去紅細(xì)胞之后，向各血漿樣品中立即加入乙酸(v/v)至濃度為2％。在體外進(jìn)行了各前藥血漿穩(wěn)定性的測試，以確?；衔镌谒峄獫{中穩(wěn)定。進(jìn)行該測試時，向從Lampire Biological獲得的空白大鼠血漿中加入2％乙酸。加入前藥前，于37℃平衡該酸化大鼠血漿三分鐘。各前藥最初的濃度為1000ng/mL。于0、60和120分鐘取100μL等分血漿(n＝3，每時間點(diǎn))。將各等分試樣與20μL HCl合并并旋轉(zhuǎn)。然后進(jìn)行液-液萃取并測定各樣品中的曲前列環(huán)素濃度。酸化大鼠血漿中各時間點(diǎn)的曲前列環(huán)素濃度列于表7。少量的曲前列環(huán)素似乎存在于純曲前列環(huán)素甲酯和曲前列環(huán)素二甘氨酸酯化合物樣品中。在整個試驗(yàn)過程中曲前列環(huán)素的濃度保持不變，表示在酸化血漿中未發(fā)生前藥向活性化合物的轉(zhuǎn)化。
表7-酸化大鼠(dog)血漿中前藥的血漿穩(wěn)定性
給予曲前列環(huán)素甲酯、曲前列環(huán)素芐酯或曲前列環(huán)素二甘氨酸酯后的平均曲前列環(huán)素血漿濃度如表8所示。
表8-曲前列環(huán)素濃度(平均值±SD(n＝3)血漿濃度(ng/mL) *由于所收集的樣品量不足，該時間點(diǎn)為n＝2大鼠的平均值 圖4-7包含給予各前藥后大鼠中曲前列環(huán)素血漿濃度對時間曲線。表9列出了各圖和所顯示的信息。
表9-附圖目錄 藥代動力學(xué)分析 測定了前藥相對于基于實(shí)施例1的活性化合物的生物利用度，實(shí)施例1中給予大鼠曲前列環(huán)素。使用下列公式確定相對生物利用度(F) 相對F＝(AUC(前藥劑量)/劑量)/(AUC(曲前列環(huán)素劑量)/劑量)*100 也測定了相對于實(shí)施例1中確定的大鼠曲前列環(huán)素靜脈內(nèi)劑量的生物利用度。結(jié)果列于表10。
表10-大鼠中曲前列環(huán)素的平均相對生物利用度和藥代動力學(xué)參數(shù) 結(jié)論 在該研究中，用大鼠測定了曲前列環(huán)素前藥的相對口服生物利用度。曲前列環(huán)素甲酯致使曲前列環(huán)素的血漿濃度對時間曲線下面積(AUCs)小于給予活性化合物后的AUCs。前藥曲前列環(huán)素芐酯和曲前列環(huán)素二甘氨酸酯的曲前列環(huán)素平均AUCs均大于給予活性化合物后的AUCs。曲前列環(huán)素二甘氨酸酯具有433％的最高相對生物利用度，超過4倍多的曲前列環(huán)素進(jìn)入全身循環(huán)。給予曲前列環(huán)素二甘氨酸酯后曲前列環(huán)素的Cmax 9ng/mL出現(xiàn)在給藥后240分鐘。給予曲前列環(huán)素后的Cmax為5ng/mL并且僅出現(xiàn)在給藥后5分鐘。曲前列環(huán)素芐酯的相對生物利用度為226±155％，Cmax 7.2ng/mL出現(xiàn)在給藥后120分鐘。應(yīng)注意AUCs不應(yīng)被外推至無限大。
參考文獻(xiàn) 1.WinNonlin User′s Guide，3.1版，1998-1999，Pharsight Co.，Mountain View，CA 94040。
實(shí)施例3 該實(shí)施例舉例說明了經(jīng)十二指腸單劑量給予曲前列環(huán)素及各種本發(fā)明前藥后的曲前列環(huán)素藥代動力學(xué)研究。
在該研究中，比較了經(jīng)十二指腸內(nèi)單劑量給予曲前列環(huán)素單磷酸酯(環(huán)狀)、曲前列環(huán)素單纈氨酸酯(環(huán)狀)、曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(環(huán)狀)或曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(鏈狀)、曲前列環(huán)素前藥后，雄性Sprague-Dawley大鼠中曲前列環(huán)素的曲線下面積。這些化合物如下所示
具有下列取代基 實(shí)驗(yàn)部分 給藥溶液的制備 在給藥前少于2小時制備所有給藥溶媒。
1.曲前列環(huán)素單磷酸酯(環(huán)狀) 曲前列環(huán)素單磷酸酯(環(huán)狀)的給藥溶液通過將1.01mg曲前列環(huán)素單磷酸酯(環(huán)狀)溶解于0.167mL二甲基乙酰胺(DMA)制備。該溶液進(jìn)一步用1.50mL PEG 400∶聚山梨酯80∶水(40∶1∶49)稀釋。給藥溶媒的最終濃度為0.603mg/mL前藥，相當(dāng)于0.5mg/mL曲前列環(huán)素。給藥溶媒在給藥時為澄清溶液。
2.曲前列環(huán)素單纈氨酸酯(環(huán)狀) 曲前列環(huán)素單纈氨酸酯(環(huán)狀)的50mg/mL溶液用二甲基乙酰胺(DMA)制備。然后用175μL DMA和1.8mL PEG 400∶聚山梨酯80∶水(40∶1∶49)稀釋25μL等分試樣的50mg/mL儲液。給藥溶媒的最終濃度為0.625mg/mL前藥，相當(dāng)于0.5mg/mL曲前列環(huán)素。給藥溶媒在給藥時為澄清溶液。
3.曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(環(huán)狀) 曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(環(huán)狀)溶液通過將1.05mg曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(環(huán)狀)溶解于0.178mL二甲基乙酰胺(DMA)制備。該溶液進(jìn)一步用1.60mL PEG 400∶聚山梨酯80∶水(40∶1∶49)稀釋。給藥溶媒的最終濃度為0.590mg/mL曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(環(huán)狀)，相當(dāng)于0.5mg/mL曲前列環(huán)素。給藥溶媒在給藥時為澄清溶液。
4.曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(鏈狀) 曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(鏈狀)溶液通過將0.83mg曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(鏈狀)溶解于0.14mL二甲基乙酰胺(DMA)制備。該溶液進(jìn)一步用1.26mL PEG 400∶聚山梨酯80∶水(40∶1∶49)稀釋。給藥溶媒的最終濃度為0.591mg/mL曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(鏈狀)，相當(dāng)于0.5mg/mL曲前列環(huán)素。給藥溶媒在給藥時為澄清溶液。
動物給藥 經(jīng)口給予各前藥后曲前列環(huán)素的血漿濃度用Sprague-Dawley雄性大鼠評價。十二只大鼠購自Hilltop Lab Animals(Scottdale，PA)。動物從Hilltop運(yùn)送至吸收系統(tǒng)West Chester大學(xué)設(shè)施(West Chester，PA)。在用于該研究之前至少在其中飼養(yǎng)二十四小時。給藥前動物禁食約16小時。將12只用于該研究的大鼠分成四組。所有組在該研究的第1天給藥。動物的重量和給藥方案列于表11。
表11 *該前藥劑量＝0.500mg/kg曲前列環(huán)素 動物通過十二指腸內(nèi)留置插管給藥。血樣在下列時間點(diǎn)從頸靜脈插管中取樣0(給藥前)、5、15、30、60、120、240、360和480分鐘。
取血樣并置于含30μL 500單位/mL肝素鹽水溶液的試管中，以13,000rpm離心10分鐘。然后移取約200μL血漿并分散在含4μL乙酸的合適標(biāo)記的聚丙烯試管中，以穩(wěn)定樣品中剩余的任何前藥。于-20℃冷凍血漿樣品并連冰一起轉(zhuǎn)移至吸收系統(tǒng)Exton設(shè)施。將它們儲存于-80℃冰箱待分析取用。
血漿樣品分析 血漿樣品用上述方法分析。簡而言之，通過固相萃取法從血漿中萃取曲前列環(huán)素，然后進(jìn)行LC/MS/MS分析。分析方法的定量下限(LLOQ)為0.03ng/mL。
分析運(yùn)行的接受標(biāo)準(zhǔn) 每次分析時采用每條曲線最少五個點(diǎn)的四條標(biāo)準(zhǔn)曲線和最少3個濃度的兩個質(zhì)量控制樣品(QCs)。將各前藥組通過用于后-計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)曲線括入括弧。為了使運(yùn)行被接受，標(biāo)準(zhǔn)品和QCs必須在±15％(20％，LLOQ)準(zhǔn)確度和精密度內(nèi)。至少75％的所有標(biāo)準(zhǔn)品和QCs必須通過接受標(biāo)準(zhǔn)。
藥代動力學(xué)分析 在各時間點(diǎn)，對每只大鼠的曲前列環(huán)素血漿濃度進(jìn)行了藥代動力學(xué)分析，并對各時間點(diǎn)上各組中的所有三只大鼠的平均血漿濃度進(jìn)行了藥代動力學(xué)分析。
數(shù)據(jù)用藥代動力學(xué)程序WinNonlin v.3.1(2)進(jìn)行非房室分析。
結(jié)果 研究觀察 經(jīng)十二指腸內(nèi)給予曲前列環(huán)素單磷酸酯(環(huán)狀)、曲前列環(huán)素單纈氨酸酯(環(huán)狀)、曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(環(huán)狀)或曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(鏈狀)后，未觀察到副反應(yīng)。
酸化大鼠血漿中前藥的離體血漿穩(wěn)定性 為了終止前藥向活性物質(zhì)的任何轉(zhuǎn)化，取樣后將血漿酸化。在分離紅細(xì)胞之后，向各血漿樣品中立即加入乙酸(v/v)至濃度為2％。在體外進(jìn)行了各前藥血漿穩(wěn)定性的測試，以確?；衔镌谒峄獫{中穩(wěn)定。進(jìn)行該測試時，向從Lampire Biological獲得的空白大鼠血漿中加入2％乙酸。加入前藥前，將該酸化大鼠血漿于室溫放置三分鐘。各前藥最初的濃度為1000ng/mL。于0、60和120分鐘取100μL血漿等分試樣(n＝3，每時間點(diǎn))。如上所描述進(jìn)行各血漿樣品的樣品制備并監(jiān)控曲前列環(huán)素的濃度。
在該試驗(yàn)的兩小時內(nèi)，在任何含前藥的酸化血漿樣品中曲前列環(huán)素濃度未增加。
樣品分析 給予曲前列環(huán)素單磷酸酯(環(huán)狀)、曲前列環(huán)素單纈氨酸酯(環(huán)狀)、曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(環(huán)狀)或曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(鏈狀)后的平均曲前列環(huán)素血漿濃度如表12所示。
表12平均值±SD(N＝3) 血漿曲前列環(huán)素濃度(NG/ML) 圖8-12包含給予各前藥后大鼠中曲前列環(huán)素血漿濃度對時間的曲線。表13列出了各圖和所顯示的信息。
表13 藥代動力學(xué)分析 測定了前藥相對于基于前述研究的活性化合物的生物利用度，前述研究中給予大鼠曲前列環(huán)素。使用下列公式確定相對生物利用度(F) 相對F＝(AUC(前藥劑量)/劑量)/(AUC(曲前列環(huán)素劑量)/劑量)*100 用實(shí)施例1中測定的大鼠曲前列環(huán)素靜脈內(nèi)給藥數(shù)據(jù)，也估算了絕對生物利用度。結(jié)果列于表14。
表14 附圖目錄 結(jié)論 用大鼠測定了曲前列環(huán)素四個前藥的相對十二指腸內(nèi)生物利用度。所有化合物的相對十二指腸內(nèi)生物利用度均小于活性化合物的。曲前列環(huán)素單磷酸酯(環(huán)狀)和曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(環(huán)狀)分別具有最高相對十二指腸內(nèi)生物利用度56％和38％。曲前列環(huán)素單磷酸酯(環(huán)狀)和曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(鏈狀)的Tmax出現(xiàn)在給藥后5分鐘。曲前列環(huán)素單纈氨酸酯(環(huán)狀)、曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(環(huán)狀)具有更長的吸收時間，其Tmax值分別為120和60分鐘。曲前列環(huán)素單磷酸酯(環(huán)狀)和曲前列環(huán)素單丙氨酸酯(鏈狀)給藥后的最大曲前列環(huán)素濃度最高。它們給藥后5分鐘達(dá)到約9ng/mL。當(dāng)測定曲前列環(huán)素血漿水平時，十二指腸內(nèi)給藥的生物利用度比口服給藥的大得多。
參考文獻(xiàn) 1.WinNonlin User′s Guide，3.1版，1998-1999，Pharsight Co.，Mountain View，CA 94040。
實(shí)施例4 在該實(shí)施例中，經(jīng)口或十二指腸內(nèi)單劑量給予雄性Sprague-Dawley大鼠下列結(jié)構(gòu)II化合物后，測定曲前列環(huán)素濃度
結(jié)構(gòu)II化合物具有下列取代基 *-o表示鄰位取代，m表示間位取代，p表示對位取代。
這些化合物的實(shí)例包括

前藥的制備和分析將按上述實(shí)施例1和2所述方法進(jìn)行。另外，曲前列環(huán)素、曲前列環(huán)素鈉及實(shí)施例2和該實(shí)施例所示化合物將與各種不同p-糖蛋白抑制化合物以不同濃度、以極接近或同時給予并測試口服生物利用度，以確定p-糖蛋白抑制劑對這些化合物的口服生物利用度的影響。p-糖蛋白抑制劑將靜脈內(nèi)和口服給藥。
實(shí)施例5 曲前列環(huán)素二乙醇胺的臨床研究 介紹 在用UT-15C(曲前列環(huán)素二乙醇胺)的緩釋(SR)固體劑型直接進(jìn)入臨床研究之前，進(jìn)行了口服“即時釋放”溶液的藥代動力學(xué)測定。第一項(xiàng)臨床研究(01-101)評估了劑量逐漸增高的UT-15C口服溶液達(dá)到血漿可檢測水平的能力、潛在的劑量-血漿濃度關(guān)系、生物利用度和UT-15C的總安全性。以模擬緩釋制劑釋放藥物的方式，用大約8小時給予志愿者該溶液。
第二項(xiàng)臨床研究(01-102)評價了兩種SR固體劑型原型(即1.微丸膠囊和2.片劑)達(dá)到血漿可檢測水平的能力和食物對這些血漿藥物濃度的潛在影響。SR原型設(shè)計(jì)成在大約8小時的時間內(nèi)釋放UT-15C。
兩項(xiàng)臨床研究的細(xì)節(jié)描述如下。
臨床研究01-101 多次逐漸增高劑量給予健康成人志愿者UT-15C(曲前列環(huán)素二乙醇胺)口服溶液的安全性、耐受性和藥代動力學(xué)研究(包括生物利用度的研究)。
給予24個健康志愿者UT-15C口服溶液，評價UT-15C的安全性和藥代動力學(xué)曲線以及其生物利用度。為了模擬SR釋放特征，每兩小時給予四個劑量0.05mg/劑量(總量＝0.2mg)、0.125mg/劑量(總量＝0.5mg)、0.25mg/劑量(總量＝1.0mg)或0.5mg/劑量(總量＝2.0mg)。研究終點(diǎn)包括標(biāo)準(zhǔn)安全性評價(不良事件、生活征、實(shí)驗(yàn)室參數(shù)、體格檢查及心電圖)以及藥代動力學(xué)參數(shù)。
所有患者接受所有四個預(yù)定劑量并完成全部研究。給予UT-15C口服溶液劑量后，可檢測到所有患者的曲前列環(huán)素血漿濃度。AUCinf和Cmax均以線性方式隨每四個劑量等分劑量增加。在2.0mg UT-15C總劑量的第三個0.25mg溶液等分劑量后，在該研究中觀察到的最高濃度為5.51ng/mL。基于曲前列環(huán)素鈉靜脈內(nèi)給藥歷史數(shù)據(jù)，UT-15C在0.2mg、0.5mg、1.0mg和2.0mg劑量的平均絕對生物利用度值分別估算為21％、23％、24％和25％。該研究結(jié)果分別如圖13A-13D所示。
在所有設(shè)定的劑量下，大多數(shù)患者對UT-15C都能很好地耐受。無血液學(xué)、臨床化學(xué)、尿分析、生活征、體格檢查和ECGs的臨床顯著、治療緊急變化。最常見的不良事件為面紅、頭痛和頭暈。UT-15C(曲前列環(huán)素二乙醇胺)的該安全性特征與報(bào)道的安全特性征、Remodulin (曲前列環(huán)素鈉)的產(chǎn)品標(biāo)簽及其他前列環(huán)素類似物一致。因此，按照特定的給藥方案(即一天總劑量分成每2小時給予的四個單劑量)，改變曲前列環(huán)素鹽的形式不引起任何意外的安全性問題。
臨床研究01-102 比較給予禁食和進(jìn)食狀態(tài)的健康成人志愿者單劑量UT-15C(曲前列環(huán)素二乙醇胺)緩釋膠囊和片劑的安全性、耐受性和藥代動力學(xué)研究。
01-102研究設(shè)計(jì)為評價和比較在禁食和進(jìn)食狀態(tài)下(1)UT-15CSR片劑原型和(2)UT-15C SR膠囊原型(微丸膠囊)的安全性和藥代動力學(xué)曲線。各SR劑型設(shè)計(jì)成在大約8小時內(nèi)釋放UT-15C(1mg)。分配十四位健康成人志愿者接受SR片劑，而分配另外十四位志愿者接受SR膠囊劑。在禁食和進(jìn)食狀態(tài)下患者隨機(jī)接受單劑量(1mg)他們所分配的SR原型。采用七天間歇期分隔進(jìn)食/禁食狀態(tài)的交叉設(shè)計(jì)。在該研究的進(jìn)食部分，患者接受高卡路里、高脂肪餐。研究終點(diǎn)包括標(biāo)準(zhǔn)安全性評價(不良事件、生活征、實(shí)驗(yàn)室參數(shù)、體格檢查及心電圖)以及藥代動力學(xué)參數(shù)。
所有服用UT-15C SR片劑和膠囊的患者均具有可檢測的曲前列環(huán)素血漿濃度。零至二十四小時曲線下面積(AUC0-24)的計(jì)算顯示總暴露于UT-15C SR以下列順序出現(xiàn)片劑進(jìn)食＞膠囊禁食＞片劑禁食＞膠囊進(jìn)食。圖14顯示在禁食和進(jìn)食狀態(tài)下兩制劑的藥代動力學(xué)曲線。
大多數(shù)患者對UT-15C SR片劑和膠囊都能耐受。所有不良事件的嚴(yán)重程度為輕至中等，并類似于研究01-101及Remodulin產(chǎn)品標(biāo)簽中所描述的。另外，在整個研究過程中無生活征、實(shí)驗(yàn)室參數(shù)、體格檢查或心電圖的治療緊急變化。
這些結(jié)果顯示可從UT-15C的固體劑型獲得可檢測和潛在治療藥物濃度，這些濃度可通過緩釋制劑技術(shù)在延長的時間內(nèi)維持。
曲前列環(huán)素二乙醇胺的多晶型物 鑒別出UT-15C的兩種晶型以及無定形形式。第一種為亞穩(wěn)態(tài)，稱為晶型A。第二種在熱力學(xué)上更穩(wěn)定，為晶型B。每種形式均描述了其特征，并進(jìn)行了互變研究以證明何種形式是熱力學(xué)穩(wěn)定的。根據(jù)表15中的方法制備了晶型A。晶型B以表16的方法、由晶型A制備。
表15
a.FE＝快速蒸發(fā)；SE＝緩慢蒸發(fā)；SC＝緩慢冷卻 b.IS＝不足的樣品；PO＝優(yōu)選取向；LC＝低結(jié)晶度；pk＝峰 c.XRPD＝X-射線粉末衍射 表16
a.加入樣品#1480-58-01(A+B)的晶種 b.樣品未分析 晶型的特征描述 晶型A 用X-射線粉末衍射(XRPD)、差式掃描量熱法(DSC)、熱重量分析法(TG)、熱態(tài)顯微鏡檢查、紅外(IR)和拉曼光譜以及水分吸收描述了合成的最初物質(zhì)(稱為晶型A)。晶型A的代表性XRPD如圖15所示。晶型A的IR和拉曼光譜分別如圖16和17所示。晶型A的熱數(shù)據(jù)如圖18所示。DSC熱分析圖顯示于103℃有熱吸收并且熔化(熱態(tài)顯微鏡檢查)。觀察到樣品從冷卻的熔化物中重新析出針狀結(jié)晶。TG數(shù)據(jù)顯示最高達(dá)100℃測量不到失重，提示該物質(zhì)不是溶劑化物。水分吸收數(shù)據(jù)如圖19所示。在試驗(yàn)過程中晶型A物質(zhì)顯示明顯的增重(＞33％)(開始在65-75％ RH之間)，提示該物質(zhì)易吸濕。另外，用大約52％ RH和68％ RH的濕度室評價了曲前列環(huán)素二乙醇胺的吸濕性。在～52％ RH和～68％ RH的濕度室中23天后，觀察到樣品分別增重4.9％和28％。
基于上述特征數(shù)據(jù)，晶型A為結(jié)晶態(tài)、無水物質(zhì)，它易吸濕并于103℃熔化。
晶型B 晶型B曲前列環(huán)素二乙醇胺由如表16所示的在1，4-二氧六環(huán)和甲苯中加熱晶型A的漿狀物(50℃)制備。從1，4-二氧六環(huán)中分離的物質(zhì)用于晶型B的全部特征描述。晶型B的代表性XRPD圖如圖20所示。晶型A和晶型B的XRPD圖類似，然而，在大約12-17°2θ(圖20)的范圍內(nèi)觀察到明顯的不同。
晶型B的熱數(shù)據(jù)如圖21所示。DSC熱分析圖(樣品ID 1557-17-01)顯示于107℃有單一吸熱線，與熔化情況一致(由熱態(tài)顯微鏡檢查測定)。TG顯示最高達(dá)100℃有最小失重。
晶型B的水分吸收/解吸數(shù)據(jù)如圖22所示。在5％ RH有最小失重并且于95％ RH物質(zhì)吸收大約49％水。在從95％降到5％ RH解吸時，樣品損失大約47％。
晶型A和晶型B很容易用DSC曲線檢測?；谏鲜鎏卣鲾?shù)據(jù)，晶型B顯然為在107℃熔化的結(jié)晶態(tài)物質(zhì)。
熱力學(xué)性質(zhì) 為了確定在不同溫度下熱力學(xué)上最穩(wěn)定的形式，進(jìn)行了互變試驗(yàn)。這些研究用晶型A和晶型B物質(zhì)在兩種不同的溶劑中進(jìn)行，數(shù)據(jù)歸納于表17。在異丙醇中的試驗(yàn)顯示于室溫、15℃和30℃，分別在7天、11天和1天后，完全轉(zhuǎn)化為晶型B。在四氫呋喃中的試驗(yàn)也顯示于室溫、15℃和30℃條件下，轉(zhuǎn)化為晶型B。于15℃ 11天后和于30℃ 1天后，獲得完全轉(zhuǎn)化。然而，在室溫條件下，根據(jù)獲得的XRPD數(shù)據(jù)，7天后仍有少量晶型A。延長打漿時間可能出現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化?；谶@些打漿互變試驗(yàn)，晶型B顯然是熱力學(xué)上最穩(wěn)定的形式。晶型A和晶型B似乎單向轉(zhuǎn)變性相關(guān)，且晶型B在熱力學(xué)上更穩(wěn)定。
表17 曲前列環(huán)素二乙醇胺的互變研究
a.樣品ID 1557-21-03飽和溶液 b.樣品ID 1519-96-03飽和溶液 c.樣品ID 1519-96-02飽和溶液 d.在加入固體之前制備的飽和溶液 e.曲前列環(huán)素二乙醇胺的未分析樣品的溶解度(于50℃)非常高并且溶液變色。
本文中公開的所有參考文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
雖然舉例說明并描述了優(yōu)選的實(shí)施方案，但應(yīng)理解可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)技能進(jìn)行修改和改變，而不背離本文中所定義的本發(fā)明廣義范圍。
權(quán)利要求
1.以下結(jié)構(gòu)的化合物在制備用于治療肺動脈高血壓的口服藥物中的應(yīng)用
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，所述化合物在約107℃熔化。
3.權(quán)利要求1的應(yīng)用，所述化合物的X-射線粉末衍射圖譜于約17.2°2θ具有圖譜峰。
4.式II所示結(jié)構(gòu)的化合物、其對映異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于治療外周血管疾病、促進(jìn)血管舒張、抑制血小板聚集和血栓形成、刺激血栓溶解、抑制細(xì)胞增殖、提供細(xì)胞保護(hù)作用、預(yù)防動脈粥樣硬化形成或誘導(dǎo)血管生成的口服藥物中的應(yīng)用
其中，
R1獨(dú)立選自H、取代和未取代烷基、芳烷基及其中OR1形成取代或未取代氨甲?；柞サ幕鶊F(tuán)；
R2和R3相同或不同，且獨(dú)立選自H、磷酸酯基以及其中OR2和OR3形成氨基酸酯或蛋白質(zhì)酯的基團(tuán)，條件是R1、R2和R3不全部為H。
5.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中OR1形成取代或未取代氨甲?；柞r，R1為-CH2CONR4R5，R4和R5相同或不同，且獨(dú)立選自H、OH、取代和未取代烷基、-(CH2)mCH3、-CH2OH及-CH2(CH2)nOH，條件是m為0、1、2、3或4，且n為0、1、2、3或4。
6.權(quán)利要求5的應(yīng)用，其中R1為C1-C4烷基。
7.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中R1選自甲基、乙基、丙基或丁基。
8.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中R1為取代或未取代芐基。
9.權(quán)利要求8的應(yīng)用，其中R1為-CH3或-CH2C6H5。
10.權(quán)利要求4的應(yīng)用，R4和R5相同或不同，且獨(dú)立選自H、OH、-CH3和-CH2CH2OH。
11.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中R2和R3之一或兩者為H。
12.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中R2和R3之一或兩者不為H，且R2和R3獨(dú)立選自磷酸酯基以及其中OR2和OR3為氨基酸酯、二肽酯、三肽酯和四肽酯的基團(tuán)。
13.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中R2或R3中只有一個為磷酸酯基。
14.權(quán)利要求13的應(yīng)用，其中R2和R3獨(dú)立選自其中OR2和OR3為氨基酸酯的基團(tuán)。
15.權(quán)利要求14的應(yīng)用，其中R2和R3之一或兩者為甘氨酸酯或丙氨酸酯。
16.權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中R1之一為H。
17.權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中R1和R2之一為H。
18.權(quán)利要求17的應(yīng)用，其中R2為H。
19.權(quán)利要求4的應(yīng)用，其中所述化合物的口服生物利用度大于曲前列環(huán)素的口服生物利用度。
20.權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中所述化合物的口服生物利用度至少比曲前列環(huán)素的口服生物利用度高50％。
21.權(quán)利要求20的應(yīng)用，其中所述化合物的口服生物利用度至少比曲前列環(huán)素的口服生物利用度高100％。
22.權(quán)利要求4的應(yīng)用，所述應(yīng)用還包括給予藥學(xué)有效量的p-糖蛋白抑制劑。
23.權(quán)利要求22的應(yīng)用，其中所述p-糖蛋白抑制劑與結(jié)構(gòu)II化合物同時給藥。
24.權(quán)利要求22的應(yīng)用，其中所述p-糖蛋白抑制劑在結(jié)構(gòu)II化合物給藥前給藥。
25.權(quán)利要求22的應(yīng)用，其中所述p-糖蛋白抑制劑經(jīng)口或靜脈內(nèi)給藥。
26.含有治療有效量的曲前列環(huán)素的組合物，所述組合物是脂質(zhì)體。
27.權(quán)利要求26的組合物，其中所述曲前列環(huán)素是曲前列環(huán)素的二乙醇胺鹽。
28.權(quán)利要求26的組合物在制備用于治療肺動脈高血壓的藥物中的應(yīng)用。
29.權(quán)利要求28的應(yīng)用，其中所述曲前列環(huán)素是曲前列環(huán)素的二乙醇胺鹽。
30.結(jié)構(gòu)II的化合物、其對映異構(gòu)體或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于治療硬皮病的口服藥物中的應(yīng)用
其中，
R1獨(dú)立選自H、取代和未取代烷基、芳烷基及其中OR1形成取代或未取代氨甲?；柞サ幕鶊F(tuán)；
R2和R3相同或不同，且獨(dú)立選自H、磷酸酯基以及其中OR2和OR3形成氨基酸酯或蛋白質(zhì)酯的基團(tuán)，條件是R1、R2和R3不全部為H。
31.權(quán)利要求30的應(yīng)用，其中OR1形成取代或未取代氨甲?；柞r，R1為-CH2CONR4R5，R4和R5相同或不同，且獨(dú)立選自H、OH、取代和未取代烷基、-(CH2)mCH3、-CH2OH及-CH2(CH2)nOH，條件是m為0、1、2、3或4，且n為0、1、2、3或4。
32.權(quán)利要求31的應(yīng)用，其中R1為C1-C4烷基。
33.權(quán)利要求32的應(yīng)用，其中R1選自甲基、乙基、丙基或丁基。
34.權(quán)利要求30的應(yīng)用，其中R1為取代或未取代芐基。
35.權(quán)利要求34的應(yīng)用，其中R1為-CH3或-CH2C6H5。
36.權(quán)利要求31的應(yīng)用，R4和R5相同或不同，且獨(dú)立選自H、OH、-CH3和-CH2CH2OH。
37.權(quán)利要求30的應(yīng)用，其中R2和R3之一或兩者為H。
38.權(quán)利要求30的應(yīng)用，其中R2和R3之一或兩者不為H，且R2和R3獨(dú)立選自磷酸酯基以及其中OR2和OR3為氨基酸酯、二肽酯、三肽酯和四肽酯的基團(tuán)。
39.權(quán)利要求30的應(yīng)用，其中R2或R3中只有一個為磷酸酯基。
40.權(quán)利要求38的應(yīng)用，其中R2和R3獨(dú)立選自其中OR2和OR3為氨基酸酯的基團(tuán)。
41.權(quán)利要求40的應(yīng)用，其中R2和R3之一或兩者為甘氨酸酯或丙氨酸酯。
42.權(quán)利要求38的應(yīng)用，其中R1之一為H。
43.權(quán)利要求38的應(yīng)用，其中R1和R2之一為H。
44.權(quán)利要求43的應(yīng)用，其中R2為H。
45.權(quán)利要求30的應(yīng)用，其中所述化合物的口服生物利用度大于曲前列環(huán)素的口服生物利用度。
46.權(quán)利要求45的應(yīng)用，其中所述化合物的口服生物利用度至少比曲前列環(huán)素的口服生物利用度高50％。
47.權(quán)利要求46的應(yīng)用，其中所述化合物的口服生物利用度至少比曲前列環(huán)素的口服生物利用度高100％。
48.權(quán)利要求30的應(yīng)用，所述應(yīng)用還包括給予藥學(xué)有效量的p-糖蛋白抑制劑。
49.權(quán)利要求48的應(yīng)用，其中所述p-糖蛋白抑制劑與結(jié)構(gòu)II化合物同時給藥。
50.權(quán)利要求48的應(yīng)用，其中所述p-糖蛋白抑制劑在結(jié)構(gòu)II化合物給藥前給藥。
51.權(quán)利要求48的應(yīng)用，其中所述p-糖蛋白抑制劑經(jīng)口或靜脈內(nèi)給藥。
52.以下結(jié)構(gòu)的化合物在制備用于治療硬皮病的口服藥物中的應(yīng)用
53.權(quán)利要求52的應(yīng)用，所述化合物在約107℃熔化。
54.權(quán)利要求53的應(yīng)用，所述化合物的X-射線粉末衍射圖譜于約17.2°2θ具有圖譜峰。
全文摘要
本發(fā)明廣泛涉及前列環(huán)素類似物及其用于促進(jìn)血管舒張、抑制血小板聚集和血栓形成、刺激血栓溶解、抑制細(xì)胞增殖(包括血管重建)、提供細(xì)胞保護(hù)作用、預(yù)防動脈粥樣硬化形成及誘導(dǎo)血管生成的方法。一般而言，經(jīng)口給藥時，本發(fā)明化合物和方法提高了曲前列環(huán)素(treprostinil)的口服生物利用度和循環(huán)濃度。本發(fā)明化合物具有式(I)。
文檔編號A61P35/00GK101780092SQ200910178738
公開日2010年7月21日 申請日期2004年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月22日
發(fā)明者K·法雷斯, D·莫托拉 申請人:聯(lián)合治療公司