專利名稱：：一種雞新城疫-傳染性法氏囊病濃縮凍干卵黃抗體復(fù)合制劑及其制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗體復(fù)合制劑，具體涉及一種雞新城疫-傳染性法氏囊病濃縮凍干卵黃抗體復(fù)合制劑，及其制備方法。
背景技術(shù)：
：雞新城疫-傳染性法氏囊病是養(yǎng)雞業(yè)的大敵。目前應(yīng)用于防治雞新城疫-傳染性法氏囊病的抗感染藥品有抗生素、化學(xué)合成藥品、中藥及其制劑、高免卵黃抗體和其他抗感染生物制劑。(—)抗生素這類抗感染藥物主要是由細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物所產(chǎn)生的代謝物，以及人工仿制合成或半合成的抗生物質(zhì)。它們對病原微生物的抑制或殺滅作用強(qiáng)，抗菌譜廣，療效好，主要是輔助治療雞新城疫-傳染性法氏囊病的細(xì)菌性繼發(fā)感染。但是，它們藥殘大，可以通過食源性污染，引起人類疾病。[OOOS](二)化學(xué)合成藥品這類抗感染藥物主要包括磺胺類、喹諾酮類、呋喃類等。它們抗菌譜廣，性質(zhì)穩(wěn)定，療效確切，使用簡便，也是用于輔助治療雞新城疫-傳染性法氏囊病的細(xì)菌性繼發(fā)感染，但是具有毒副作用大，易殘留于體內(nèi)，造成肝、腎等組織不可逆的損害(見中國藥典)；還有病毒靈、金剛烷胺等，雖然可以治療雞新城疫-傳染性法氏囊病，但是造成了食源性藥殘，影響了此類藥物在人醫(yī)中的應(yīng)用。以上兩類藥物除了上述缺點(diǎn)外，它們共同的弊端還有干擾機(jī)體正常菌群，破壞機(jī)體微生態(tài)平衡，導(dǎo)致微生物菌群失調(diào)移位，造成二重感染和其它病變；再者，大劑量反復(fù)使用都可以導(dǎo)致耐藥性，降低治療效果，使其抗感染的敏感率下降至10-15%，并誘生出高致病性菌株。(三)中藥及其制劑中藥屬天然藥物，具有無害優(yōu)勢的特點(diǎn)，扶正祛邪、整體調(diào)整和無耐藥性，是抗菌素和化學(xué)合成藥品無法比擬的，可以有效地治療雞新城疫-傳染性法氏囊病。但是，目前市場上有許多抗感染的中藥制劑如板蘭根沖劑、穿心蓮注射液等。雖然這些藥物抗菌譜廣，但存在藥效慢、作用弱、用量大、質(zhì)量難以穩(wěn)定以至使用不方便等因素。(四)疫苗預(yù)防雞新城疫、傳染性法氏囊病雖然可以進(jìn)行疫苗預(yù)防，但是在緊急感染的情況下疫苗就顯得無濟(jì)于事了。(五)高免卵黃抗體制劑這類抗感染藥物來自特制的雞卵黃抗體。它們作用速度快，療效準(zhǔn)確，特異性強(qiáng)，但由于只針對雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒，對混合感染和繼發(fā)感染無效，有時(shí)不得不用上述三類藥物輔助治療；其次，目前多數(shù)卵黃抗體是直接制品即原始高免卵黃制品也稱粗制卵黃抗體(比如養(yǎng)殖企業(yè)自己按姜艷芬，王亞萍，潘瑞等抗禽流感、新城疫、法氏囊三聯(lián)高免卵黃抗體的研制及應(yīng)用，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，39<1>，p57，方法制備)，內(nèi)含許多非藥物成分比如卵黃中的脂肪和微粒蛋白，它們影響卵黃抗體的吸收，有的還帶有別的疾病傳染源；再者，目前有個(gè)別卵黃抗體制劑即使采用了提取凍干工藝，精制成了卵黃抗體提取凍干制品(比如養(yǎng)殖企業(yè)自己按汪麗、周云錄、胡曉苗、周學(xué)利等傳染性法氏囊病，新城疫雙聯(lián)卵黃抗體凍干制劑的初步研制及應(yīng)用效果，安微農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，27<5>:p509，方法制備)，它們必須低溫保存，在貯運(yùn)和使用過程中很容易變性失活，失去醫(yī)療價(jià)值。因此，這些抗感染制劑在藥品市場上難以操作而失去了商品價(jià)值的意義。(六)其他抗感染的生物因子制劑比如干擾素、細(xì)胞因子等，由于價(jià)格昂貴，很難被臨床廣泛接受，至于在雞新城疫-傳染性法氏囊病中更難推行?；谏鲜黾夹g(shù)背景，本發(fā)明針對雞新城疫-傳染性法氏囊病提出一種卵黃抗體復(fù)合制劑，克服了現(xiàn)有技術(shù)中抗感染藥品存在的諸多缺陷。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提出一種雞新城疫-傳染性法氏囊病卵黃抗體復(fù)合制劑，克服已有技術(shù)中的缺點(diǎn)，在降低成本和耐藥性的前提下，有效提高了疫病的防治效果，而且不會對人產(chǎn)生食源性污染和藥物殘留。本發(fā)明的另一個(gè)目的還在于提供一種所述復(fù)合制劑的制備方法，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的提供一種雞新城疫-傳染性法氏囊病濃縮凍干卵黃抗體復(fù)合制劑，它含有以下重量份數(shù)的組分(1)抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體10.0-99.5;(2)中藥多糖0.5-20.0;所述的中藥多糖提取自下列重量份的中藥中的一種或兩種以上的組合物板藍(lán)根10-50、生地黃50-100、丹參50-80、甘草30-50。所述復(fù)合制劑還可以進(jìn)一步包含常規(guī)蛋白保護(hù)劑1.0-10.0重量份。所述的蛋白保護(hù)劑，按重量份計(jì)，優(yōu)選白蛋白1.0-6.0或蔗糖1.0-3.0中的一種或兩種的混合物。所述的抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體可以是現(xiàn)有技術(shù)中經(jīng)過雞新城疫-傳染性法氏囊病疫苗多次強(qiáng)化免疫的蛋雞生產(chǎn)的高免雞蛋中提純制備的現(xiàn)有產(chǎn)品，提純制備方法可以是現(xiàn)有技術(shù)中任何可實(shí)現(xiàn)提純目的的方法。為了進(jìn)一步提高卵黃抗體的收率、降低生產(chǎn)成本，本發(fā)明的抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體優(yōu)選按照以下方法制得(l)按照常規(guī)方法制取抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒高免雞蛋，可以包括以下步驟(l.l)無特定病原體蛋雞在潔凈養(yǎng)殖場隔離飼養(yǎng)；(1.2)對蛋雞進(jìn)行3次免疫，每次給每只雞注射雞新城疫-傳染性法氏囊病疫苗，注射量分別為0.5ml、1.5ml禾P2.0ml，每次間隔一周時(shí)間；(1.3)完成第3次免疫21天后，收集雞蛋，對卵黃中的卵黃抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測，雞新城疫的卵黃抗體血凝抑制效價(jià)達(dá)到1:512以上、同時(shí)傳染性法氏囊病病毒的卵黃抗體瓊脂擴(kuò)散效價(jià)達(dá)到1:32以上的雞蛋為雞新城疫、傳染性法氏囊病病毒高免雞蛋，收集貯存在16t:條件下備用；如果檢測上述指標(biāo)不達(dá)標(biāo)，可以重新進(jìn)行第3次免疫，直至檢測合格。(2)抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體的提純(2.1)將步驟(1)得到的抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒的高免雞蛋進(jìn)行消毒，打碎雞蛋并分離出卵黃；(2.2)在(2.1)步分離出的卵黃中加入卵黃重量11倍的無菌去離子水，并調(diào)整pH值至6.00，然后攪拌5分鐘，在4t:的條件下靜置48小時(shí)之后，通過虹吸抽取一次上清；后再將沉淀物用無菌去離子水稀釋8倍，并調(diào)整pH值至6.0，然后攪拌5分鐘，在fC的條件下靜置24小時(shí)之后，通過虹吸抽取二次上清；合并兩次上清，經(jīng)吸附過濾除去內(nèi)毒素，獲得除毒上清液備用；其中，所述pH值的調(diào)整可以使用0.1NHCl或0.1NNaOH完成；所述吸附過濾可以使用活性炭完成，也可以用已知的任何方法完成；(2.3)將(2.2)步得到的除毒上清液除去上清中的卵黃微粒等雜質(zhì)；再將濾過液除去低分子雜質(zhì)，并將截留物濃縮為稠液，即為抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體；其中，所述除去上清中的卵黃微粒等雜質(zhì)可以通過經(jīng)1000KD濾膜過濾或經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘完成；所述濾過液除去低分子雜質(zhì)可以通過經(jīng)30100KD濾膜過濾完成。所述的多糖的提取方法可以是任意現(xiàn)有方法，優(yōu)選按照以下方法提取得到a.將所述的中藥原料切碎、洗凈后，用冷水浸泡2小時(shí)至藥心充分浸透，再加入原料重量12倍的水，加熱至沸騰后在9(TC的情況下，通過熱回流濃縮工藝煎煮180分鐘同時(shí)濃縮得到濃縮藥液；b.將步驟a制備的濃縮藥液通過10000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，棄去沉淀物，獲得上清液并經(jīng)負(fù)壓濃縮，使其形成干物質(zhì)為25%的濃縮藥液；c.將步驟b得到的濃縮藥液加4-8倍體積量95X的乙醇，靜置過夜，棄去乙醇上清液，沉淀物除去乙醇，然后加水溶解并通過100KD濾膜過濾，除去雜蛋白、內(nèi)毒素等大分子雜質(zhì)，收集濾過液再通過1KD納濾膜過濾，除去有機(jī)小分子和無機(jī)分子及離子等雜質(zhì)，被截留的物質(zhì)稀釋后逆向水流透析24小時(shí)；取出濃縮液，加5倍體積量99%乙醇沉淀，攪拌，靜置過夜，3000-5000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；沉淀物除去乙醇并經(jīng)過噴霧干燥，即得到本發(fā)明所使用的中藥多糖。本發(fā)明還提供一種所述的復(fù)合制劑的制備方法，包括以下步驟1)按照常規(guī)方法制取抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒高免雞蛋；2)將步驟1)得到的抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒的高免雞蛋進(jìn)行消毒，打碎雞蛋并分離出卵黃，然后在其中加入卵黃重量ll倍的無菌去離子水，并調(diào)整pH值至6.00，然后攪拌5分鐘，在4t:的條件下靜置48小時(shí)之后，通過虹吸抽取一次上清；后再將沉淀物用無菌去離子水稀釋8倍，并調(diào)整pH值至6.0，然后攪拌5分鐘，在fC的條件下靜置24小時(shí)之后，通過虹吸抽取二次上清；合并兩次上清，經(jīng)吸附過濾除去內(nèi)毒素，獲得除毒上清液，過濾除去上清中的卵黃微粒等雜質(zhì)，再將濾過液除去低分子雜質(zhì)，并將截留物通過超濾濃縮為稠液，獲得抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體；3)將步驟2)得到的抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體、提取自所述中藥的中藥多糖按照所述的重量份比例混合溶于無菌去離子水中，使每毫升溶液中雞新城疫的卵黃抗體血凝抑制效價(jià)21:2048，傳染性法氏囊病病毒的卵黃抗體瓊脂擴(kuò)散效價(jià)21:512;4)將步驟3)得到的溶液分裝于西林瓶進(jìn)行常規(guī)冷凍干燥，并通過Co6°照射殺滅微生物，即得到本發(fā)明所述的雞新城疫-傳染性法氏囊病濃縮凍干卵黃抗體復(fù)合制劑。其中，步驟2)所述的pH值的調(diào)整優(yōu)選使用0.1NHC1或O.lNNaOH完成。步驟2)所述的吸附過濾優(yōu)選使用活性炭完成。步驟2)所述的除去上清中的卵黃微粒等雜質(zhì)優(yōu)選經(jīng)1000KD濾膜過濾或經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘完成；所述濾過液除去低分子雜質(zhì)優(yōu)選經(jīng)30100KD濾膜過濾完成。步驟4)所述的冷凍干燥優(yōu)選將溶液分裝于西林瓶后置于真空冷凍干燥機(jī)中，預(yù)冷至-4(TC，然后在-4(TC下冷凍干燥2-8小時(shí)，而后每小時(shí)升溫3t:左右，經(jīng)12-18小時(shí)的真空干燥升溫至25t:，然后加蓋、密封，在25t:環(huán)境中保持3-5小時(shí)。現(xiàn)有技術(shù)在卵黃抗體提純方面，分為卵黃抗體的分離純化、提取純化兩個(gè)步驟。第一步卵黃抗體分離純化上，有聚乙二醇(PEG)法、硫酸葡聚糖(DS)法、氯仿提法、天然膠如卡拉膠(CAR)和黃原膠(XAN)法、辛酸(CA)法、水稀釋(WD)法、超臨界氣體提取(SFE)法等；第二步卵黃抗體提取純化上，有超濾法、硫酸銨沉淀法、硫酸鈉沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、冷乙醇兩步沉淀法、聯(lián)合沉淀法等。綜合上述兩步作為生產(chǎn)綠色食品的藥品來看，水稀釋(WD)法聯(lián)合超濾法是最有價(jià)值卵黃抗體提純方法，因?yàn)樵撀?lián)合方法不存在任何外源污染。但是，由于在大批量生產(chǎn)中，需要靠重力自然沉淀卵黃微粒達(dá)到回收抗體上清目的，而現(xiàn)有技術(shù)的水稀釋(WD)法在短時(shí)間內(nèi)得不到足量的抗體上清液，因此影響了抗體的回收率。本發(fā)明從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，對現(xiàn)有的水稀釋(WD)法聯(lián)合超濾法的卵黃抗體提純技術(shù)做了進(jìn)一步改進(jìn)，提高了卵黃抗體回收率，進(jìn)而提出了上述復(fù)合制劑的制備方法，在保證藥品療效的基礎(chǔ)上達(dá)到了進(jìn)一步提高生產(chǎn)率、降低成本的目的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的復(fù)合制劑具有以下有益效果l)具有更為全面、有效的防治效果在中醫(yī)免疫工程學(xué)的指導(dǎo)下，本發(fā)明采用現(xiàn)代免疫工程技術(shù)和現(xiàn)代中藥制劑的頂尖理化工藝，將抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體的特異免疫性和多糖的非特異免疫性以及它們對機(jī)體自身抗病能力的調(diào)理作用相結(jié)合，復(fù)合制成凍干劑型。因此，本發(fā)明的復(fù)合制劑既可以抵抗原發(fā)病原——雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒感染，又可以激發(fā)自身免疫力和整體抗病的功能；既標(biāo)本兼治，又快速持久。因此本發(fā)明的復(fù)合制劑相對現(xiàn)有技術(shù)中的單純的抗體制劑和中藥制劑，具有更全面、更有效、更迅速的防治效果，具體的防治效果可參見以下臨床試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)1.本發(fā)明雞新城疫-傳染性法氏囊病濃縮凍干卵黃抗體復(fù)合制劑的臨床應(yīng)用效果實(shí)驗(yàn)[OO54]受試病雞情況受試病雞是確診患有新城疫-傳染性法氏囊病病毒感染的14-84日齡的雛雞和育成雞，沒有品種限制。疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)以病雞腺胃乳頭出血、肌胃角質(zhì)膜下出血、小腸有島嶼狀出血壞死及法氏囊腫大、出血為主要特征，兼下列任意兩項(xiàng)或多項(xiàng)癥狀1、病雞雞冠紫紅發(fā)黑，體溫升高，呼吸困難，甩頭流鼻涕，精神不振，厭食，震顫，脫水，高度虛脫；2、歪脖點(diǎn)頭，翅下垂腿麻痹，間歇性腹瀉拉水狀白色糞便或拉黃綠色稀便；3、全身漿膜出血，皮下及胸肌和腿肌出血，盲腸淋巴結(jié)出血，直腸出血，腎小管尿酸鹽沉積。實(shí)驗(yàn)觀察方法將11825只確診雞新城疫和雞傳染性法氏囊病混合感染的育雛雞分為四組A組——本發(fā)明復(fù)合制劑治療組，按本發(fā)明實(shí)施例1提供的方法制備抗體制劑；B組——卵黃抗體提取凍干制品治療組，抗體制劑制備方法參見"汪麗、周云錄、胡曉苗、周學(xué)利等傳染性法氏囊病，新城疫雙聯(lián)卵黃抗體凍干制劑的初步研制及應(yīng)用效果，安微農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，27<5>:p509";C組——粗制卵黃抗體治療組；抗體制劑制備方法參見"姜艷芬，王亞萍，潘瑞等抗禽流感、新城疫、法氏囊三聯(lián)高免卵黃抗體的研制及應(yīng)用，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，39<1>，p57";D組——未治療組，不做任何處理。然后，A-C組分別使用相應(yīng)制劑進(jìn)行治療，方法是每只病雞每日肌注l羽份，連續(xù)用藥3日。每羽份的雞新城疫(ND)的卵黃抗體血凝抑制(HI)效價(jià)1:512、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的卵黃抗體瓊脂擴(kuò)散(AGP)效價(jià)1:16。[OOSS]治愈評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1、發(fā)病雛雞的法氏囊腫大出血病變消失、呈粉白色；2、腺胃乳頭出血、肌胃角質(zhì)膜下出血、小腸有島嶼狀出血壞死、全身漿膜出血、盲腸淋巴結(jié)出血、直腸出血等出血病變消失；3、皮下及胸肌和腿肌出血，腎小管尿酸鹽沉積病變消失；4、雞冠光澤紅亮，沒有呼吸困難和甩頭流鼻涕等癥狀，歪脖點(diǎn)頭和翅下垂腿麻痹的神經(jīng)癥狀消失，精神不振、厭食、間歇性腹瀉、震顫、脫水癥狀消失。實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果治療結(jié)果顯示，使用本發(fā)明制劑后對病雞的治愈率為94.3%，而使用現(xiàn)有技術(shù)的卵黃抗體提取凍干制品對病雞的治愈率為86.6%，現(xiàn)有技術(shù)的粗制卵黃抗體對病雞的治愈率僅80.9%。通過應(yīng)用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分別對三個(gè)實(shí)驗(yàn)組治愈率進(jìn)行兩兩t檢驗(yàn)，充分表明它們相互之間都存在極顯著差異(u>2.58，p<0.01)，因此證明了本發(fā)明復(fù)合制劑的治療效果優(yōu)于現(xiàn)有的其它制劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表l。表1.本發(fā)明的復(fù)合制劑與現(xiàn)有技術(shù)相比的臨床應(yīng)用效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注表中"""均表示與同指標(biāo)的其他組數(shù)據(jù)比較具有高度顯著性差異。2)抗體得到有效保護(hù)，促進(jìn)藥效穩(wěn)定發(fā)揮在現(xiàn)代分子生物學(xué)、現(xiàn)代分子免疫學(xué)和中醫(yī)學(xué)相結(jié)合的基礎(chǔ)上，利用分子間氫鍵結(jié)構(gòu)理論，把抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體和多糖等成分混合后經(jīng)過真空冷凍干燥，使多糖等成分通過氫鍵在抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體外圍形成多維網(wǎng)絡(luò)空間氫鍵結(jié)構(gòu)假性水化膜，從而研制成了一種雞新城疫-傳染性法氏囊病濃縮凍干卵黃抗體復(fù)合制劑。多糖等成分是富含羥基的一類物質(zhì)，它們相互間可以構(gòu)建多維網(wǎng)絡(luò)空間氫鍵結(jié)構(gòu)，在抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體表面形成假性水化膜。它的存在提高了抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體抵抗高溫、紫外線等誘導(dǎo)變性，直接保護(hù)了抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體分子的外表結(jié)構(gòu)、構(gòu)象與功能，因此本發(fā)明的復(fù)合制劑中的卵黃抗體不易失活，能夠更加充分有效地發(fā)揮抗感染功效。具體效果參見以下實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)2.本發(fā)明雞新城疫-傳染性法氏囊病濃縮凍干卵黃抗體復(fù)合制劑的耐熱存儲效果實(shí)驗(yàn)為了鑒定本發(fā)明制劑的耐熱特性我們做了本實(shí)驗(yàn)。將本發(fā)明實(shí)施例1的制劑(A)和現(xiàn)有技術(shù)中的卵黃抗體提取凍干制品(B)、粗制卵黃抗體(C)，置于37t:環(huán)境中，分別保存1周、2周、3周、l月、12月、24月、36月、48月后，用ND-HI和IBDV-AGP測定法，分別測定雞新城疫(ND)的卵黃抗體血凝抑制(HI)效價(jià)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的卵黃抗體瓊脂擴(kuò)散(AGP)效價(jià)，結(jié)果見表2、3。表2.每羽份不同制劑的雞新城疫的卵黃抗體血凝抑制(HI)效價(jià)的變化<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3.每羽份不同制劑的傳染性法氏囊病病毒的卵黃抗體瓊脂擴(kuò)散(AGP)效價(jià)的變化<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由上兩表得知，本發(fā)明制劑有很強(qiáng)的抗熱性能，在37t:的環(huán)境中保存36個(gè)月時(shí)本類產(chǎn)品每羽份的雞新城疫(ND)的卵黃抗體血凝抑制(HI)效價(jià)仍為1:512、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的卵黃抗體瓊脂擴(kuò)散(AGP)效價(jià)仍為1:16，為合格產(chǎn)品，而實(shí)驗(yàn)中使用的現(xiàn)有技術(shù)中的卵黃抗體提取凍干制品在此環(huán)境中只能存儲12個(gè)月，粗制卵黃抗體也只能存儲3周。所以，本發(fā)明的制劑具有抗熱存儲、方便運(yùn)輸和使用的優(yōu)點(diǎn)，克服了目前別的同類產(chǎn)品在的存儲、運(yùn)輸和使用方面的不足。3)不產(chǎn)生耐藥、不會造成污染、使用成本低由于本發(fā)明的復(fù)合制劑中不含有抗生素或化學(xué)合成藥物，因此不會使雞產(chǎn)生耐藥性，也不會對人產(chǎn)生藥殘污染；而相對于細(xì)胞因子、干擾素等制劑，本發(fā)明的復(fù)合制劑具有成本低、使用方便等多種優(yōu)勢。4)本發(fā)明的制備方法在保證復(fù)合制劑的治療效果的前提下，能夠進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率。本發(fā)明的制備方法中，采用了新的卵黃抗體提純工藝，即改進(jìn)了現(xiàn)有技術(shù)中的水稀釋(WD)法聯(lián)合超濾法?，F(xiàn)有技術(shù)用無菌去離子水將高免卵黃液稀釋710倍，并用0.1NHCl或0.1NNaOH溶液調(diào)整pH值至5.2，在4°C的條件下靜置6小時(shí)；而本發(fā)明方法用無菌去離子水將高免卵黃液稀釋11倍，并用O.lNHCl或O.INNaOH溶液調(diào)整pH值至6.00，在4t:的條件下靜置48小時(shí)。實(shí)踐證明，在大批量生產(chǎn)中靠重力自然沉淀情況下，同一環(huán)境里前者抗體得率比后者少25-35%。因此，本發(fā)明的制備方法能夠在保證復(fù)合制劑的治療效果的前提下，能夠進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率。具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1.多味中藥多糖型雞新城疫-傳染性法氏囊病濃縮凍干卵黃抗體復(fù)合制劑1.成分抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體99.5公斤；中藥多糖0.5公斤；所述中藥多糖提取自以下重量份的中藥材組合物板藍(lán)根10、生地黃50、丹參50、甘草30。2.制備(1)、制備抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒的高免雞蛋。(l.l)無特定病原體蛋雞在潔凈養(yǎng)殖場隔離飼養(yǎng)；(1.2)對蛋雞進(jìn)行3次免疫，每次給每只雞注射雞新城疫-傳染性法氏囊病疫苗，注射量分別為0.5ml、1.5ml禾P2.0ml，每次間隔一周時(shí)間；(1.3)完成第3次免疫21天后，收集雞蛋，對卵黃中的卵黃抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測，雞新城疫的卵黃抗體血凝抑制效價(jià)達(dá)到1:512以上、同時(shí)傳染性法氏囊病病毒的卵黃抗體瓊脂擴(kuò)散效價(jià)達(dá)到1:32以上的雞蛋為雞新城疫、傳染性法氏囊病病毒高免雞蛋，收集貯存在16t:條件下備用；如果檢測上述指標(biāo)不達(dá)標(biāo)，可以重新進(jìn)行第3次免疫，直至檢測合格。(2)抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體的提純(2.1)將步驟(1)得到的抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒的高免雞蛋進(jìn)行消毒，打碎雞蛋并分離出卵黃；(2.2)在(2.1)步分離出的卵黃中加入卵黃重量11倍的無菌去離子水，并使用0.1NHCl或0.1NNaOH調(diào)整pH值至6.00，然后攪拌5分鐘，在4°C的條件下靜置48小時(shí)之后，通過虹吸抽取一次上清；后再將沉淀物用無菌去離子水稀釋8倍，并使用0.1NHC1或0.1NNaOH調(diào)整pH值至6.0，然后攪拌5分鐘，在4°C的條件下靜置24小時(shí)之后，通過虹吸抽取二次上清；合并兩次上清，經(jīng)活性炭吸附過濾除去內(nèi)毒素，獲得除毒上清液備用；(2.3)將(2.2)步得到的除毒上清液經(jīng)1000KD濾膜過濾或經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘除去上清中的卵黃微粒等雜質(zhì)；再將濾過液經(jīng)30100KD濾膜過濾除去低分子雜質(zhì)，并將截留物濃縮為稠液，即為抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體；(3)制備多糖(3.1)將板藍(lán)根、生地黃、丹參和甘草按照板藍(lán)根10份、生地黃50份、丹參50份、甘草30份的重量份取料、切碎、洗凈后混合，用冷水浸泡2小時(shí)至藥心充分浸透，再加入原料重量的12倍的水，加熱至沸騰后在9(TC的情況下，在熱回流濃縮工藝下煎煮180分鐘同時(shí)濃縮得到濃縮藥液。(3.2)將步驟(3.1)制備的濃縮藥液通過10000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，棄去沉淀物，獲得上清液并經(jīng)負(fù)壓濃縮，使其形成干物質(zhì)為25%的濃縮藥液；(3.3)將步驟(3.2)得到的濃縮藥液加4-8倍體積量95%的乙醇，靜置過夜，棄去乙醇上清液，沉淀物除去乙醇，然后加水溶解并通過100KD濾膜過濾，除去雜蛋白、內(nèi)毒素等大分子雜質(zhì)，收集濾過液再通過1KD納濾膜過濾，除去有機(jī)小分子和無機(jī)分子及離子等雜質(zhì)，被截留的物質(zhì)稀釋后逆向水流透析24小時(shí)；取出濃縮液，加5倍體積量99%乙醇沉淀，攪拌，靜置過夜，3000-5000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；沉淀物除去乙醇并經(jīng)過噴霧干燥，即得到本發(fā)明所使用的中藥多糖。(4)多味中藥多糖型雞新城疫-傳染性法氏囊病濃縮凍干卵黃抗體復(fù)合制劑的合成將99.5公斤步驟(2)制備的卵黃抗體和0.5公斤步驟(3)制備的多糖混合，溶于無菌去離子水中，使每毫升溶液中雞新城疫(ND)的卵黃抗體血凝抑制(HI)效價(jià)為21:2048，傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的卵黃抗體瓊脂擴(kuò)散(AGP)效價(jià)為21:512，然后分裝于西林瓶，置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥。真空冷凍條件1、預(yù)冷至-4(TC;2、在-40"下冷凍干燥2-8小時(shí)，而后每小時(shí)升溫3"左右，經(jīng)12-18小時(shí)的真空干燥至25°C;3、加蓋，密封，在25t:環(huán)境中保持3-5小時(shí)。最后經(jīng)Co6°照射殺滅微生物，即為成品。3.質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)性狀本品為淡黃色，呈較致密的團(tuán)塊。無菌檢驗(yàn)按《中國獸藥典》進(jìn)行，應(yīng)無菌生長。支原體檢驗(yàn)按《中國獸藥典》進(jìn)行，應(yīng)無支原體生長。外源病毒檢驗(yàn)按《中國獸藥典》進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。安全檢驗(yàn)用14日齡SPF雞5只，各肌肉注射10羽份，觀察14天，應(yīng)全部健活，注射部位沒有炎性反應(yīng)。效力檢驗(yàn)按下列方法行進(jìn)l.IBDV中和指數(shù)測定按瓶簽注明羽份，用生理鹽水稀釋至l羽份/ml，按《中國獸藥典》附注中和試驗(yàn)固定抗體稀釋病毒法測定抗體效價(jià)，中和指數(shù)應(yīng)為105.0。2.對雛雞保護(hù)力測定用21日齡SPF雛雞30只，其中10只，每只肌肉注射1羽份，另20只做對照，隔離飼養(yǎng)。24小時(shí)，取全部被動免疫雛雞連同對照雞10只，每只點(diǎn)眼接種IBD強(qiáng)毒TL株(稀釋30-60倍)，96小時(shí)記錄死亡結(jié)果，攻毒對照組雛雞死亡率應(yīng)在80%以上，被動免疫組雛雞保護(hù)率應(yīng)在90%以上，健康對照組10只法氏囊無任何變化。3.對感染雛雞治愈力測定用21日齡SPF雛雞90只，30只留作陰性對照，其余60只每只點(diǎn)眼接種IBD強(qiáng)毒TL株(稀釋30-60倍)，感染12小時(shí)后，其中30只，每只肌肉注射本品1羽份進(jìn)行被動免疫治療，每日1次，連續(xù)3日，另30只做為陽性對照，隔離飼養(yǎng)。治療后72小時(shí)，觀察并記錄各組死亡結(jié)果，攻毒陽性對照組死亡率應(yīng)在80%以上，被動免疫治療組治愈力應(yīng)在90%以上，健康陰性對照組30只法氏囊無任何變化。4.取3-6周齡的健康易感雞30只，隨機(jī)分成3組，每組10只。第1組為健康對照組，不注射任何藥物，單獨(dú)隔離飼養(yǎng)。第2、3組每只雞分別肌肉注射ND北京強(qiáng)毒株105ELD5。。24小時(shí)后，第2組每只肌肉注射本品1羽份進(jìn)行被動免疫治療；第3組注射生理鹽水。觀測每組發(fā)病、死亡情況至第14日。判定結(jié)果第l組試驗(yàn)期間雞應(yīng)全部健活。第3組為攻毒對照組，應(yīng)于攻毒后24-48小時(shí)發(fā)病，48小時(shí)后開始死亡，72小時(shí)全部發(fā)病，14日內(nèi)全部死亡。第2組為早期感染治療組，注射本制劑后24-48小時(shí)開始恢復(fù)正常，觀測結(jié)束至少存活9只，判為合格。5.ND-HI和IBDV-AGP測定雞新城疫(ND)的卵黃抗體血凝抑制(HI)效價(jià)應(yīng)為21:512，傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的卵黃抗體瓊脂擴(kuò)散(AGP)效價(jià)應(yīng)為21:16。作用和用途用于早期緊急預(yù)防和治療雞新城疫、傳染性法氏囊病。用法和用量1、預(yù)防用量25日齡以下的每只l羽份，25-35日齡1.5羽份，35-45日齡2羽份，45日齡以上2.5-4羽份。必要時(shí)可重復(fù)注射2-3次。2、治療劑量35日齡以下每只2.0羽份，35日齡以上每只2.5-3.0羽份；病情嚴(yán)重時(shí)，可加倍用量，也可1日1次，連用2-3日。注意事項(xiàng)1.用本品被動免疫后，5天內(nèi)不得進(jìn)行雞新城疫弱毒活疫苗和雞傳染性法氏囊病活疫苗的免疫。2.本品切勿高溫加熱使用，用生理鹽水稀釋后立即使用。3.本品口服無效。4.本品可與獸用抗生素混合注射。貯存與有效期2-『C或室溫保存；有效期36個(gè)月。實(shí)施例2.三味中藥多糖型雞新城疫-傳染性法氏囊病濃縮凍干卵黃抗體復(fù)合制劑l.成分抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體65公斤；中藥多糖6公斤；蔗糖10公斤；2.制備卵黃抗體和多糖的制備方法同實(shí)施例1，只是多糖的提取來源變?yōu)橐韵轮亓糠莸闹兴幵习逅{(lán)根10份、生地黃20份、甘草10份；復(fù)合制劑的合成過程和方法同實(shí)施例1，只是在合成原料變?yōu)榭闺u新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體65公斤、多糖6公斤和蔗糖10公斤。3.質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例l。實(shí)施例3.兩味中藥多糖型雞新城疫-傳染性法氏囊病濃縮凍干卵黃抗體復(fù)合制劑l.成分抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體40公斤；中藥多糖20公斤；白蛋白6公斤；2.制備卵黃抗體和多糖的制備方法同實(shí)施例1，只是多糖的提取來源變?yōu)橐韵轮亓糠莸闹兴幵细什?0份、丹參30份；復(fù)合制劑的合成過程和方法同實(shí)施例1，只是在合成原料變?yōu)榭闺u新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體40公斤、多糖20公斤和白蛋白6公斤。3.質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例l。實(shí)施例4.單味中藥多糖型雞新城疫-傳染性法氏囊病濃縮凍干卵黃抗體復(fù)合制劑l.成分抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體10公斤；中藥多糖5公斤；白蛋白l公斤；蔗糖l公斤；2.制備卵黃抗體和多糖的制備方法同實(shí)施例1，只是多糖的提取來源變?yōu)樯攸S；復(fù)合制劑的合成過程和方法同實(shí)施例1，只是在合成原料變?yōu)榭闺u新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體10公斤、多糖5公斤、白蛋白1公斤和蔗糖1公斤。3.質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例l。權(quán)利要求一種雞新城疫-傳染性法氏囊病濃縮凍干卵黃抗體復(fù)合制劑，其特征在于，它含有以下重量份數(shù)的組分(1)抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體10.0-99.5；(2)中藥多糖0.5-20.0；所述的中藥多糖提取自下列重量份的中藥中的一種或兩種以上的組合物板藍(lán)根10-50、生地黃50-100、丹參50-80、甘草30-50。2.權(quán)利要求1所述的復(fù)合制劑，其特征在于進(jìn)一步包含常規(guī)蛋白保護(hù)劑1.0-10.0重量份。3.權(quán)利要求2所述的復(fù)合制劑，其特征在于所述的蛋白保護(hù)劑，按重量份計(jì)，是白蛋白1.0-6.0或蔗糖1.0-3.0中的一種或兩種的混合物。4.權(quán)利要求1所述的復(fù)合制劑，其特征在于，所述的抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體是按照以下方法制得的(1)按照常規(guī)方法制取抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒高免雞蛋；(2)抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體的提純(2.1)將步驟(1)得到的抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒的高免雞蛋進(jìn)行消毒，打碎雞蛋并分離出卵黃；(2.2)在(2.1)步分離出的卵黃中加入卵黃重量11倍的無菌去離子水，并調(diào)整pH值至6.00，然后攪拌5分鐘，在4t:的條件下靜置48小時(shí)之后，通過虹吸抽取一次上清；后再將沉淀物用無菌去離子水稀釋8倍，并調(diào)整pH值至6.0，然后攪拌5分鐘，在fC的條件下靜置24小時(shí)之后，通過虹吸抽取二次上清；合并兩次上清，經(jīng)吸附過濾除去內(nèi)毒素，獲得除毒上清液備用；(2.3)將(2.2)步得到的除毒上清液除去上清中的卵黃微粒等雜質(zhì)；再將濾過液除去低分子雜質(zhì)，并將截留物通過超濾濃縮為稠液，即為抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體。5.權(quán)利要求1所述的復(fù)合制劑，其特征在于，所述的多糖是按照以下方法提取得到的a.將所述的中藥原料切碎、洗凈后，用冷水浸泡2小時(shí)至藥心充分浸透，再加入原料重量12倍的水，加熱至沸騰后在9(TC的情況下，通過熱回流濃縮工藝煎煮180分鐘同時(shí)濃縮得到濃縮藥液；b.將步驟a制備的濃縮藥液通過10000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，棄去沉淀物，獲得上清液并經(jīng)負(fù)壓濃縮，使其形成干物質(zhì)為25%的濃縮藥液；c.將步驟b得到的濃縮藥液加4-8倍體積量的95X的乙醇，靜置過夜，棄去乙醇上清液，沉淀物除去乙醇，然后加水溶解并通過100KD濾膜過濾，除去雜蛋白、內(nèi)毒素等大分子雜質(zhì)，收集濾過液再通過1KD納濾膜過濾，除去有機(jī)小分子和無機(jī)分子及離子等雜質(zhì)，被截留的物質(zhì)稀釋后逆向水流透析24小時(shí)；取出濃縮液，加5倍體積的量99%乙醇沉淀，攪拌，靜置過夜，3000-5000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；沉淀物除去乙醇并經(jīng)過噴霧干燥，即得到本發(fā)明所使用的中藥多糖。6.權(quán)利要求1所述的復(fù)合制劑的制備方法，包括以下步驟1)按照常規(guī)方法制取抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒高免雞蛋；2)將步驟1)得到的抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒的高免雞蛋進(jìn)行消毒，打碎雞蛋并分離出卵黃，然后在其中加入卵黃重量ll倍的無菌去離子水，并調(diào)整pH值至6.00，然后攪拌5分鐘，在4t:的條件下靜置48小時(shí)之后，通過虹吸抽取一次上清；后再將沉淀物用無菌去離子水稀釋8倍，并調(diào)整pH值至6.0，然后攪拌5分鐘，在fC的條件下靜置24小時(shí)之后，通過虹吸抽取二次上清；合并兩次上清，經(jīng)吸附過濾除去內(nèi)毒素，獲得除毒上清液，過濾除去上清中的卵黃微粒等雜質(zhì)，再將濾過液除去低分子雜質(zhì)，并將截留物通過超濾濃縮為稠液，獲得抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體；3)將步驟2)得到的抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體、提取自所述中藥的中藥多糖按照所述的重量份比例混合溶于無菌去離子水中，使每毫升溶液中雞新城疫的卵黃抗體血凝抑制效價(jià)21:2048，傳染性法氏囊病病毒的卵黃抗體瓊脂擴(kuò)散效價(jià)4)將步驟3)得到的溶液分裝于西林瓶進(jìn)行常規(guī)冷凍干燥，并通過Co6°照射殺滅微生物，即得到本發(fā)明所述的雞新城疫-傳染性法氏囊病濃縮凍干卵黃抗體復(fù)合制劑。7.權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于步驟2)所述的pH值的調(diào)整使用0.1NHCl或0.1NNaOH完成。8.權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于步驟2)所述的吸附過濾使用活性炭完成。9.權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于步驟2)所述的除去上清中的卵黃微粒等雜質(zhì)是經(jīng)1000KD濾膜過濾或經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘完成；所述濾過液除去低分子雜質(zhì)是經(jīng)30100KD濾膜過濾完成。10.權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于步驟4)所述的冷凍干燥是將溶液分裝于西林瓶后置于真空冷凍干燥機(jī)中，預(yù)冷至-4(TC，然后在-4(TC下冷凍干燥2-8小時(shí)，而后每小時(shí)升溫3t:左右，經(jīng)12-18小時(shí)的真空干燥升溫至25t:，然后加蓋、密封，在25t:環(huán)境中保持3-5小時(shí)。全文摘要本發(fā)明提供一種雞新城疫-傳染性法氏囊病濃縮凍干卵黃抗體復(fù)合制劑，它含有以下重量份數(shù)的組分抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體10.0-99.5、中藥多糖0.5-20.0，所述的中藥多糖提取自下列重量份的中藥中的一種或兩種以上的組合物板藍(lán)根10-50、生地黃50-100、丹參50-80、甘草30-50。本發(fā)明所述制劑在中醫(yī)免疫工程學(xué)的指導(dǎo)下，將抗雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒卵黃抗體和多糖等成分相結(jié)合制成的凍干制劑，供雞新城疫-傳染性法氏囊病的臨床使用，它既針對雞新城疫-傳染性法氏囊病病毒感染起到治療作用，又激發(fā)了機(jī)體免疫力及抗病功能，同時(shí)本制劑中的多糖組分對卵黃抗體起到強(qiáng)有力的保護(hù)作用。文檔編號A61P37/04GK101690812SQ20091018091公開日2010年4月7日申請日期2009年10月21日優(yōu)先權(quán)日2009年10月21日發(fā)明者張勇飛,李尚波,武潔梅,胥桂華,苗玉和,趙冰申請人:遼寧益康生物制品有限公司;張勇飛