專利名稱：：恩鐮孢菌素類化合物在制備抗耐藥結(jié)核菌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及結(jié)核菌的醫(yī)藥學(xué)研究，尤其涉及恩鐮孢菌素類化合物在制備抗耐藥結(jié)核菌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：海洋微生物由于其所處的特殊環(huán)境，發(fā)展出了各種獨(dú)特的代謝方式，這不僅確保其在極端環(huán)境中生存，也為人類提供了在陸地微生物中難以發(fā)現(xiàn)的大量新穎代謝產(chǎn)物，其中不少具有潛在的實(shí)際應(yīng)用價值，已被認(rèn)為是尋找藥理活性物質(zhì)的新源泉。此外，海洋微生物易于采集和培養(yǎng)，人工發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物比高等生物所含的物質(zhì)更易提純，成本更低，符合可持續(xù)發(fā)展的資源開發(fā)原則，所以從中篩選到的活性化合物更利于工業(yè)化生產(chǎn)。耐多藥結(jié)核菌是至少對兩種主要一線抗結(jié)核藥物-異煙肼和利福平具耐藥性的結(jié)核桿菌菌株。廣泛耐藥結(jié)核菌(也稱為極端耐藥結(jié)核菌)是對6類二線藥物中的至少3類以上具耐藥性的耐多藥結(jié)核菌。世界衛(wèi)生組織估計，目前全球約有17億結(jié)核病患者，每年約有600—800萬新病例，每年死于結(jié)核病的人多達(dá)300萬。對耐藥性肺結(jié)核的調(diào)査表明，在每年記錄的600—800萬新病例中，有10%的患者至少耐一種抗結(jié)核藥，有2%的患者耐兩種以上的抗結(jié)核藥。我國目前耐多藥性肺結(jié)核病形勢不容樂觀。第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告表明，在我國耐藥性肺結(jié)核病患者中有60%耐兩種以上抗結(jié)核藥物，10.2%耐4種以上抗結(jié)核藥物。每年約有42萬患者感染耐多藥性結(jié)核，其中有6.6萬患者因此而.死亡，而極端耐藥性結(jié)核患者數(shù)量約為2.7萬例，且因此而死亡的患者數(shù)已逾1.6萬例，甚至在某種程度上高過了艾滋病感染的致死率。耐藥結(jié)核既是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，又是沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，在治療花費(fèi)上，一般結(jié)核病人的治療費(fèi)用，每人僅需要150200元；而耐多藥結(jié)核病人的治療費(fèi)用，每人需要1.5萬元至兩萬元。結(jié)核病人因不能支付醫(yī)藥費(fèi)而中斷治療者，在臨床上并不少見。耐藥結(jié)核的不斷擴(kuò)散，有可能使耐藥結(jié)核升級為新的不治之癥。鳥-胞內(nèi)分枝桿菌屬于非結(jié)核分枝桿菌，危害程度屬第三類，危險程度為n級，可引起結(jié)核樣病變，多見于肺和腎。目前，免疫功能低下人群(包括艾滋病人)常發(fā)生非結(jié)核分枝桿菌(如鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合菌組)的條件感染，出現(xiàn)典型結(jié)核病相似的癥狀，是艾滋病患者主要死亡的原因之一；更為嚴(yán)重的是，這些非結(jié)核分枝桿菌對現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物常天然耐藥，表現(xiàn)為天然的多重耐藥性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一類來源于海洋紅樹林內(nèi)生真菌的，具有好的抗鳥-胞內(nèi)分枝桿菌活性、抗耐藥性結(jié)核菌活性的恩鐮孢菌素類化合物在制備抗耐藥結(jié)核菌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的恩鐮孢菌素類化合物是來源于海洋紅樹林內(nèi)生真菌的，具有式(I)所示通式的一類化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(1)當(dāng)R'=R2=<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>時，式(I)化合物為恩鐮孢菌素G(enniatinG)，其外觀為白色固體，理化性質(zhì)為m.p.l25127。C，[a]2D5-52.7°(c,0.29,CHCl3)，分子式為(335116^309分子質(zhì)量667，紅外光譜在2965，2930，2875，1752，1658，1470，1416，1373，1270，1191，1128，1015，861cm"有吸收，核磁共振氫譜化學(xué)位移為S5.23(dd，J4,10Hz),1.75(m),1.55(m),0.92(d,J6.5Hz),0.94(d,J6.5Hz)，5.00(d,J9Hz),2.25(m),1.00(d，J7Hz),0.92(d,J7Hz),4.70(dd,J5,10Hz),1.72(m)，1.46(m),0.92(d,J6.5Hz),0.92(d,J6.5Hz),4.99(d,J9Hz),2.26(m)，0.99(d,J7Hz),0.916(d,J7Hz),4.90(d,J10Hz),2.23,1.03(d,J6.5Hz),0.89(d,J6.5Hz),5.11(d,J9Hz),2.32(m),0.91(d,J7Hz)，1.00(d,J7.0Hz),3.134(s),3.13(s),3.12(s);(2)當(dāng)R尸R產(chǎn)Rf日寸，式(I)化合物為恩鐮孢菌素B(enniatinB)，其外觀為白色固體，理化性質(zhì)為m.p.150-153。C，[|2D5-103°(c,0.30,CHCl3)，分子式為C33Hs7N309分子質(zhì)量639，核磁共振氫譜化學(xué)位移為S1.06(d,J6.5Hz,9H),0.99(d,J6.5Hz,9H),0.96(d,J7Hz,9H),0.90(d，J7Hz,9H)，2.28(m，6H),3.13(s，9H),4.52(d,J8Hz,3H),5.14(d,J9.5Hz,3H);乂(3)當(dāng)R產(chǎn)，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>時，式(I)化合物為恩鐮孢菌素B4(enniatinB4)，其外觀為白色固體，理化性質(zhì)為m.p.140-143°C，[^5-88.9°(c,0.32,CHCl3)，分子式為C34H59N309分子質(zhì)量653，核磁共振氫譜化學(xué)位移為S0.88(d,J6.5Hz，3H),0.90(d,J6Hz,3H)，0.93(d,J6.5Hz,3H),0.94(d,J7Hz,12H),0.98(d,J6.5Hz,6H),1.0(d,J6.5Hz,3H),1.03(d,J7Hz,3H),1.04(d,J7Hz,3H)，1.53((m,lH)，1.75(ddd,J4，10，14Hz，1H),1.84(ddd,J4.5,9,14Hz,lH),2.20-2.35(m,5H),3.10(s,3H),3.14(s,3H),3.16(s,3H),4.46(d,J10Hz,lH),4.70(m,lH),4.94(d,J10Hz,lH),4.98(d,J9Hz,lH),5.08(d,J8.5Hz,lH),5.19(d,J8Hz，lH);(4)當(dāng)R產(chǎn)RfR3=v時，式(I)化合物為白僵菌素(Beauvericin)，其外觀為白色固體，理化性質(zhì)為mp.80°C;分子式為C45H57N309，分子質(zhì)量783.3;核磁共振氫譜化學(xué)位移為57.24(15H,br，Phe)，5.63(3H,浙J4.8，12.4Hz)，4.78(3H,d,Hz)，3.44(3H,浙J4.4,14.4Hz)，3.06(9H，&N-CH3)，2.93(3H,浙/12.4，14.4Hz)，1.卯(3H,m)，0.81(9H，d,J6.6Hz)，0.34(9H,d,/6.6Hz,)。發(fā)明人從紅樹林內(nèi)源真菌F^"Wwmsp.732弁培養(yǎng)液的乙酸乙酯萃取部位、菌體的甲醇提取液濃縮物中，經(jīng)硅膠柱層析，在乙酸乙酯/環(huán)己烷(體積比為l/1)的等度洗脫液中依次得到上述式(I)所示恩鐮孢菌素類化合物。林永成，王軍等在文獻(xiàn)YongChengLin,WangJun,etal,ANovelCompoundEnniatinGfromtheMangroveFungusHalosarpheiasp.(strain#723)fromtheSouthChinaSea.AustralianJournalofChemistry,2002,Vol.55,225.中對紅樹林內(nèi)源真菌Fw^n'wmsp.732弁的提取方法以及結(jié)構(gòu)分析，已經(jīng)有詳細(xì)報道。本發(fā)明人通過固體培養(yǎng)基稀釋法研究發(fā)現(xiàn)，上述四個恩鐮孢菌素類化合物具有很強(qiáng)的抗鳥-胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacteriumavium-intracelluare)活性，抗耐藥性結(jié)核菌臨床分離耐ISREMTB(耐異煙肼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇四種抗結(jié)核藥物)株活性，及抗耐藥性結(jié)核菌臨床分離耐ISEMTB(耐異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇三種抗結(jié)核藥物)株的活性，可作為治療耐藥性結(jié)核菌感染疾病的先導(dǎo)化合物，也可作為抗耐藥結(jié)核菌藥物，用于耐藥性結(jié)核病的治療，具有廣泛的應(yīng)用前景。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果針對當(dāng)前結(jié)核病發(fā)病率高、結(jié)核桿菌多重耐藥菌株及人體免疫缺陷病毒雙重感染的出現(xiàn)，使結(jié)核病發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢的現(xiàn)狀，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)恩鐮孢菌素類化合物具有很強(qiáng)的抗耐藥結(jié)核病菌活性，提供恩鐮孢菌素類化合物在抗耐藥結(jié)核病菌方面的新應(yīng)用，不但為耐藥結(jié)核病菌的治療提供了新的有利工具，而且擴(kuò)大了恩鐮孢菌素類化合物的應(yīng)用范圍；此外，本發(fā)明的恩鐮孢菌素類化合物來源于海洋紅樹林內(nèi)生真菌，原料充足，且原料采集和培養(yǎng)容易，易提純，成本低，繁殖周期短，利于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何限定。實(shí)施例1式(I)所示恩鐮孢菌素類化合物的制備本實(shí)施例采用GTY培養(yǎng)基(含有2.5質(zhì)量％葡萄糖、0.8質(zhì)量％蛋白胨，20質(zhì)量。/。人工海水起始值為pH6)對紅樹林內(nèi)源真菌Fwan^wsp.732#進(jìn)行懸浮態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，在25。C靜置培養(yǎng)15天，過濾，分離菌體和發(fā)酵液。將上述發(fā)酵液采用乙酸乙酯萃取，萃取物拌硅膠裝柱，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，從體積比為4:16:l的乙酸乙酯和石油醚的洗脫液中得到式(I)所示恩鐮孢菌素類化合物混合物粗品，在用乙酸乙酯/環(huán)己烷(體積比為1/1)混合溶劑等度洗脫，依次得到恩鐮孢菌素G、恩鐮孢菌素B和恩鐮孢菌素B4。將上述菌體用甲醇提取，萃取物拌硅膠裝柱,以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫,再經(jīng)石油醚-丙酮梯度洗脫，在石油醚-丙酮體積比為10:2極性段可得到白僵菌素。實(shí)施例2恩鐮孢菌素類化合物抗鳥-胞內(nèi)分枝桿菌活性試驗本實(shí)施例采用固體培養(yǎng)基稀釋法對恩鐮孢菌素G、恩鐮孢菌素B、恩鐮孢菌素B4和白僵菌素四種物質(zhì)的抗鳥-胞內(nèi)分枝桿菌活性進(jìn)行檢測。取斜面培養(yǎng)的鳥-胞內(nèi)分枝桿菌培養(yǎng)物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于渦旋振蕩器上劇烈振動研磨，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁?MacFarlandNo.l)比濁，即配成lmg/ml的鳥-胞內(nèi)分枝桿菌菌懸液。將恩鐮孢菌素G、恩鐮孢菌素B、恩鐮孢菌素B4和白僵菌素分別用DMSO(二甲基亞砜)配成高濃度的原液，用含5%的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至120iig/ml，將稀釋好的各恩鐮孢菌素類化合物按等比稀釋法加入到4mlMiddlebrook7H11瓊脂培養(yǎng)基中(該培養(yǎng)基已經(jīng)12rC高壓蒸氣滅菌15分鐘，并冷卻至5055。C)，混勻，分別制成濃度為60ug/ml、40ug/ml、30ug/ml、20ixg/ml、15ixg/ml和10ug/ml的含各恩鐮孢菌素類化合物的斜面培養(yǎng)基。將濃度為lmg/ml的鳥-胞內(nèi)分枝桿菌菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù)環(huán)，分別接種于含系列濃度的各恩鐮孢菌素類化合物的斜面培養(yǎng)基和空白對照培養(yǎng)基斜面上，置于37。C培養(yǎng)48周，觀察實(shí)驗結(jié)果，結(jié)果如表l所示。本實(shí)施例中所用Middlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基和Middlebrook7H11瓊脂培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行結(jié)核菌培養(yǎng)時的常用培養(yǎng)基，其配方采用常規(guī)配方即可。實(shí)施例3恩鐮孢菌素類化合物抗結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISREMTB株活性試驗本實(shí)施例采用固體培養(yǎng)基稀釋法對恩鐮孢菌素G、恩鐮孢菌素B、恩鐮孢菌素B4和白僵菌素四種物質(zhì)的抗結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISREMTB株(耐異煙肼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇結(jié)核桿菌臨床分離株)活性進(jìn)行檢測。從斜面上刮取結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISREMTB株培養(yǎng)物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于渦旋振蕩器上劇烈振動研磨，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁?MacFarlandNo.l)比濁，即配成lmg/ml的菌懸液。此操作在三級生物安全實(shí)驗室中進(jìn)行。將恩鐮孢菌素G、恩鐮孢菌素B、恩鐮孢菌素B4和白僵菌素分別用DMSO(二甲基亞砜)配成高濃度的原液，用含5%的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至120ug/ml，將稀釋好的四類恩鐮孢菌素類化合物按等比稀釋法分別加入到4mlMiddlebrook7H11瓊脂培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基已經(jīng)121。C高壓蒸氣滅菌15分鐘，并冷卻至5055°C)中，混勻，分別制成濃度為60ug/ml、40ug/ml、30ug/ml、20ug/ml、15ug/ml和10yg/ml的含各恩鐮孢菌素類化合物斜面培養(yǎng)基。將濃度為lmg/ml的結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISREMTB株菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù)環(huán)，分別接種于含系列濃度的各恩鐮孢菌素類化合物的斜面培養(yǎng)基和空白對照培養(yǎng)基的斜面上，置于37'C培養(yǎng)48周，觀察實(shí)驗結(jié)果，結(jié)果如表1所示。本實(shí)施例中所用Middlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基和Middlebrook7H11瓊脂培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行結(jié)核菌培養(yǎng)時的常用培養(yǎng)基，其配方采用常規(guī)配方即可。實(shí)施例4恩鐮孢菌素類化合物抗結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株活性試驗本實(shí)施例采用固體培養(yǎng)基稀釋法對恩鐮孢菌素G、恩鐮孢菌素B、恩鐮孢菌素B4和白僵菌素，這四種物質(zhì)的抗結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株(耐異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇結(jié)核桿菌臨床分離株)活性進(jìn)行檢測。從斜面上刮取結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株培養(yǎng)物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于渦旋振蕩器上劇烈振動研磨，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁?MacFarlandNo.l)比濁，即配成lmg/ml的結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株菌懸液。將恩鐮孢菌素G、恩鐮孢菌素B、恩鐮孢菌素B4和白僵菌素分別用DMSO配成高濃度的原液，用含5%的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至120ug/ml，將稀釋好四類恩鐮孢菌素類化合物分別加入到4mlMiddlebrook7H11瓊脂培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基已經(jīng)12rC高壓蒸氣滅菌15分鐘，并冷卻至5055。C)中，混勻，分別制成濃度為60iig/ml、40ug/ml、30ug/ml、20ug/ml、15yg/ml禾口10Ug/ml的含各恩鐮孢菌素類化合物斜面培養(yǎng)基。將濃度為lmg/ml的結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù)環(huán)，分別接種于含系列濃度的各恩鐮孢菌素類化合物的培養(yǎng)基和空白對照培養(yǎng)基的斜面上，置于37°C培養(yǎng)48周，觀察實(shí)驗結(jié)果，結(jié)果如表l所示。本實(shí)施例中所用Middlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基和Middlebrook7H11瓊脂培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行結(jié)核菌培養(yǎng)時的常用培養(yǎng)基，其配方采用常規(guī)配方即可。表l恩鐮孢菌素類化合物抗鳥-胞內(nèi)分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌臨床分離株耐ISREMTB株和臨床分離株耐ISEMTB株的MIC(Pg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求1、恩鐮孢菌素類化合物在制備抗耐藥結(jié)核菌藥物中的應(yīng)用。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述應(yīng)用，其特征在于所述恩鐮孢菌素類化合物具有式(I)所示通式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中(1)當(dāng)R產(chǎn)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>時，式(I)化合物為恩鐮孢菌素G;(2)當(dāng)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>時，式(I)化合物為恩鐮孢菌素B;(3)當(dāng)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>時，式(I)化合物為恩鐮孢菌素B4;(4)當(dāng)R產(chǎn)R^R產(chǎn)^^時，式(I)化合物為白僵菌素。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于所述權(quán)利要求1所述恩鐮孢菌素G對鳥-胞內(nèi)分枝桿菌的最小抑菌濃度為50yg/ml，所述恩鐮孢菌素B對鳥-胞內(nèi)分枝桿菌的最小抑菌濃度為60yg/ml，所述恩鐮孢菌素B4對鳥-胞內(nèi)分枝桿菌的最小抑菌濃度為60ug/ml，所述白僵菌素對鳥-胞內(nèi)分枝桿菌的的最小抑菌濃度為60lig/ml。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于所述權(quán)利要求1所述恩鐮孢菌素G對結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISREMTB株的最小抑菌濃度為15ug/ml，所述恩鐮孢菌素B對結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISREMTB株的最小抑菌濃度為15iig/ml，所述恩鐮孢菌素B4對結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISREMTB株的最小抑菌濃度為30ug/ml，所述白僵菌素對結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISREMTB株的最小抑菌濃度為20ixg/ml。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于所述權(quán)利要求1所述恩鐮孢菌素G對結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株的最小抑菌濃度為15ixg/ml，所述恩鐮孢菌素B對結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株的最小抑菌濃度為15"g/ml，所述恩鐮孢菌素B4對結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株的最小抑菌濃度為15yg/ml，所述白僵菌素對結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISEMTB株的最小抑菌濃度為20ug/ml。全文摘要本發(fā)明公開一種恩鐮孢菌素類化合物在制備抗耐藥結(jié)核菌藥物中的應(yīng)用，該恩鐮孢菌素類化合物具有式(I)所示通式。針對當(dāng)前結(jié)核病發(fā)病率高、結(jié)核桿菌多重耐藥菌株及人體免疫缺陷病毒雙重感染的出現(xiàn)，使結(jié)核病發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢的現(xiàn)狀，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)恩鐮孢菌素類化合物具有很強(qiáng)的抗耐藥結(jié)核病菌活性，提供恩鐮孢菌素類化合物在抗耐藥結(jié)核病菌方面的新應(yīng)用，不但為耐藥結(jié)核病菌的治療提供了新的有利工具，而且擴(kuò)大了恩鐮孢菌素類化合物的應(yīng)用范圍。此外，本發(fā)明的恩鐮孢菌素類化合物來源于海洋紅樹林內(nèi)生真菌，原料充足，且原料采集和培養(yǎng)容易，易提純，成本低，繁殖周期短，利于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號A61P31/00GK101669939SQ200910192548公開日2010年3月17日申請日期2009年9月22日優(yōu)先權(quán)日2009年9月22日發(fā)明者佘志剛,林永成,軍王,賴小敏,伊陳申請人:中山大學(xué)