專利名稱：：抑制BCL11B表達和腫瘤性T細胞增殖的siRNA-434及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種siRNA，特別涉及一種抑制BCL11B表達和腫瘤性T細胞增殖的siRNA-434及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：血液腫瘤是發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，每年全國約有IO萬初發(fā)病人，嚴(yán)重危害人們、尤其是青少年的健康，T細胞腫瘤是血液腫瘤的一種主要類型，主要由于T細胞惡性克隆增殖而形成，包括多種類型的T細胞白血病和淋巴瘤，多數(shù)惡性程度高，治療效果差，預(yù)后不良。臨床治療上一直存在難治療、耐藥和易復(fù)發(fā)等難題，因此尋找更有效和特異的治療方案一直是研究者的一個重要目標(biāo)。隨著對腫瘤細胞的分子特點的逐漸明確，不斷發(fā)現(xiàn)腫瘤T細胞特異的分子，設(shè)計和研制有效的靶向治療藥物，成為提高T細胞腫瘤治療效果的一個重要手段。BCL11B(B細胞淋巴瘤/白血病11B)基因是近期發(fā)現(xiàn)的一個BCL家族的新成員，在T細胞發(fā)育、分化和增殖中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。BCL11B表達異常、基因突變及基因斷裂和重排與T細胞腫瘤發(fā)生有一定關(guān)系，在T細胞——急性淋巴細胞白血病(T-ALL)中，多見涉及BCL11B基因位點的一些染色體異位，引起了其表達水平在白血病T細胞中明顯升高。近年來，利用RNA干擾技術(shù)，將化學(xué)合成的小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)轉(zhuǎn)導(dǎo)至特定的細胞，沉默相關(guān)基因的表達，是研究基因功能最有效的手段之一，也是靶向基因治療最有吸引力的方法之一。選擇特異性的靶基因合成有效的siRNA，并且選擇合適轉(zhuǎn)染方式，使其在宿主細胞中高效作用，是實施這一靶向治療措施的重點。有效的靶向治療是目前國內(nèi)外不斷在尋找的輔助治療方法，靶向針對BCL11B基因的siRNA序列對于開發(fā)新的抗T細胞腫瘤基因藥物和提高T細胞腫瘤的治療效果有重要的意義，具有很大的應(yīng)用前景和經(jīng)濟價值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的首要目的在于提供一種能高效地抑制BCL11B表達和腫瘤性T細胞增殖的siRNA-434。本發(fā)明的另一目的在于提供上述siRNA-434的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種抑制BCL1IB表達和腫瘤性T細胞增殖的siRNA-434，序列如下所示正義鏈5，-UCACCUGUGGCCAGUGUCAAAUGAA-3'反義鏈5，-UUCAUUUGACACUGGCCACAGGUGA-3，。所述抑制BCL11B表達和腫瘤性T細胞增殖的siRNA-434應(yīng)用于抑制BCL11B基因的表達。所述抑制BCL11B表達和腫瘤性T細胞增殖的siRNA-434應(yīng)用于制備治療T細胞腫瘤的藥物。所述T細胞腫瘤為T細胞白血病。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果1、本發(fā)明的抑制BCL1IB表達和腫瘤性T細胞增殖的siRNA-434能高效抑制BCLllB基因的表達，mRNA的下調(diào)程度達到26倍，蛋白表達的抑制率達到41.73%，如圖4和圖5所示。2、本發(fā)明的抑制BCLllB表達和腫瘤性T細胞增殖的siRNA-434能有效抑制腫瘤性T細胞的增殖，如圖6所示。3、本發(fā)明的siRNA-434序列對于開發(fā)新的抗T細胞腫瘤基因藥物和提高T細胞腫瘤的治療效果有重要的意義，其具有很大的應(yīng)用前景和經(jīng)濟價值。圖1是實施例1中通過熒光顯微鏡光觀察Molt-4細胞轉(zhuǎn)染效率圖，其中A為轉(zhuǎn)染AlexaRedOligo白光圖(200X);B為轉(zhuǎn)染AlexaRedOligo熒光圖(200X);C為對照組白光圖(200X);D為對照組熒光圖(200X)。圖2是實施例1中通過流式細胞儀檢測Molt-4細胞轉(zhuǎn)染效率圖，其中A為轉(zhuǎn)染AlexaRedOligo的散點圖；B為轉(zhuǎn)染AlexaRedOligo的柱形圖；C為對照組的散點圖；D為對照組的柱形圖。圖3是實施例2確定實時定量PCR條件的效果圖，其中A是內(nèi)參基因|32m標(biāo)準(zhǔn)品擴增圖；B是目的基因BCL1IB標(biāo)準(zhǔn)品擴增圖。圖4是實施例2的實驗組和對照組的實時定量PCR結(jié)果圖。圖5是實施例2的實驗組和對照組的WesternBlot圖，其中A為48h后BCLllB蛋白水平變化圖；B為72h后BCLllB蛋白水平變化圖。圖6是通過A皿exinV/PI雙染流式細胞圖儀得到的實驗組和對照組的凋亡圖。具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1siRNA的合成和轉(zhuǎn)染T淋巴細胞白血病細胞株(Molt-4)(購自中科院上海細胞所)細胞條件的穩(wěn)定，具體步驟如下(1)設(shè)計和得到siRNA在GenBank(http:〃blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)里查找B(X11B基因序歹lj(ACCESSIONNM_138576)，然后根據(jù)Invitrogen公司(www.invitrogen.com)4提供的StealthTMRNAi設(shè)計法則，在線設(shè)計針對BCL11B的siRNA。本發(fā)明所涉及的抑制BCLlIB表達和腫瘤性T細胞增殖的siRNA-434是從BCLlIB基因序列434bp開始的25ntsiRNA，其正義鏈序列為5，-UCACCUGUGGCCAGUGUCAAAUGAA-3，；反義鏈序列為5'-UUCAUUUGACACUGGCCACAGGUGA-3'。同時設(shè)計與目的基因序列無同源性的non-silencingscrambledcontrol(SC)對照25ntsiRNA，其正義鏈序列為5，-CCAAAGGACGAGAGCAGGUUCAUAA-3，；反義鏈序列為5，-UUAUGAACCUGCUCUCGUCCUUUGG-3，。上述siRNA均由美國Invitrogen公司化學(xué)合成。(2)準(zhǔn)備處于對數(shù)生長期的Molt-4細胞將Molt-4細胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%新生牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在含體積百分?jǐn)?shù)5%C02的培養(yǎng)箱37t:連續(xù)培養(yǎng)，23天傳代一次，得到處于對數(shù)生長期的Molt-4細胞。(3)測試Molt-4細胞的轉(zhuǎn)染效率A、收集2.5X1()6個步驟(2)制備的處于對數(shù)生長期的Molt_4細胞，200g離心10min，完全去除上清；B、用100ii1預(yù)熱至室溫的NucleofectorSolution和Supplement混合液(Amaxa，德國)懸浮細胞；C、加入lOOnMAlexaRedOligo(Invitrogen,美國)，混勻后加入核轉(zhuǎn)杯(Amaxa，德國)，啟動Molt-4特異性程序C-005，同時設(shè)置對照組，為與轉(zhuǎn)染AlexaRedOligo的步驟相同，但是沒有加入AlexaRedOligo;D、程序完成后立刻用核轉(zhuǎn)染試劑盒(Amaxa，德國)里配套的移液器將轉(zhuǎn)染后的細胞液接種于培養(yǎng)瓶中，終體積為5ml;E、放入培養(yǎng)箱10小時后利用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測熒光值，分析轉(zhuǎn)染效率。通過熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測的結(jié)果分別如圖1和圖2(其中圖2的A和B圖中P3和P2分別是散點圖和柱形圖的陽性細胞，而C和D圖是細胞對照的本底。)所示，可見通過上述轉(zhuǎn)染方法的轉(zhuǎn)染效率穩(wěn)定在39.98±5.47%。實施例2將siRNA-434轉(zhuǎn)染Molt-4細胞后，檢測BCL11B基因在mRNA和蛋白水平的表達，明確其干擾效應(yīng)。(1)實驗分組實驗組為轉(zhuǎn)染siRNA-434，對照組分別為無關(guān)序列對照組(SC)、轉(zhuǎn)染條件對照組(MOCK)和空白對照組(NC)，實驗方法同實施例1步驟(2)，各組的siRNA量均為3i!g。轉(zhuǎn)染條件對照組是除了不加siRNA，其余處理條件同實驗組，空白對照組是沒有任何處理的細胞。(2)熒光實時定量PCR檢測分別收集各組轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h的細胞，按常規(guī)方法提取RNA合成cDNA。熒光實時定量PCR總反應(yīng)體積為25y1，包括dATP、dCTP和dGTP各O.lmmol/L，dUTP0.2mmol/L，0.75UAmpliTaqGold聚合酶，O.25U尿嘧啶糖基酶(UNG)，1XPCR緩沖液，4.5,l/LMgCl2，以及O.5iimol/L上、下游引物，0.1iimol/L的6FAM-TAMRA探針和2iUcDNA或標(biāo)準(zhǔn)品。應(yīng)用于熒光實時定量PCR的引物和探針具體序列見表1。在50°C、2min，95°C、5min變性后，共進行45循環(huán)擴增，每一循環(huán)包括95°C、15s和64°C、lmin。根據(jù)樣本中的！^m拷貝數(shù)，計算100000個！^m拷貝中所含BCLllB拷貝數(shù)。計算公式為n=100000XBCL1IB/P2m。P2m和BCLllB標(biāo)準(zhǔn)品擴增曲線圖見圖3，兩條曲線均擬合良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.999。繼續(xù)分析各實驗組BCLllB拷貝數(shù)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h，與各對照組相比，siRNA-434組BCLllB的mRNA表達水平均明顯下調(diào)，下調(diào)倍數(shù)約為26倍不等(表2，圖4)。表1應(yīng)用于實時定量PCR的引物和探針序列引物和探針序列功能5'-CACCCCCGACGAAGATGACCAC-3'上游引物5'-CGGCCCGGGCTCCAGGTAGATG-3'下游引物5'-6FAM-TCACCCACGAAAGGCATCTGTCCCAAGCA-TAMRA-3'探針5'-CTCGCGCTACTCTCTCTTTCT-3'上游引物5'-TACATGTCTCGATCCCACTTAACTAT-3'下游引物5'-6FAM-CTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCA—TAMRA-3'探針表2:實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后BCL11B基因mRNA水平變化(BCL11Bcipies/105P2mcopies)組^\24h48h72hsiRNA-434313.77±91.9278.62±19.2388.73±40.42SC18.08±59.75144.48±28.81221.90±31.88MOCK358.50±3楊129.03±19.23411.24±338.48NC508.63±123.55508.63±123.55508.63±123.55(3)蛋白水平檢測分別收集轉(zhuǎn)染后48h和72h的細胞，應(yīng)用蛋白裂解液試劑盒，提取總蛋白，WesternblotECL發(fā)光法及Imagequantition灰度分析軟件檢測、分析轉(zhuǎn)染后各組BCLllB蛋白水平的表達情況。具體方法如下A、收集各組不同時間段的細胞，數(shù)目為1Xl(f個，用RIPA蛋白提取試劑盒(申能博彩，上海)提取總蛋白；B、SDS-PAGE電泳將各組樣品按常規(guī)方法定量并變性后加樣于10%的SDS-PAGE膠中(每孔加樣量約為30iig)，恒壓60V30min后改為80V45min;C、轉(zhuǎn)膜將切好的NC膜(Invitrogen，美國)和脫脂棉預(yù)先泡在轉(zhuǎn)膜液中1530min，用半干轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad，美國)按照安全蓋+電轉(zhuǎn)蓋+脫脂棉+SDS-PAGE膠+NC膜+脫脂棉+電機板的順序從上向下排列，恒壓15V15min;D、封膜用3X的BlockingReagent(封閉試劑)封膜lh后用WashingBuffer(洗滌緩沖液)洗滌2次，每次5min;E、一抗、二抗的孵育將NC膜按所需要的蛋白分子量大小(!3-actin為42kD，BCLlIB蛋白為96kD)和預(yù)染Marker的位置剪成兩條，分別放入1:500的小鼠抗人|3-actin—抗(武漢博士德公司)和1:5000的兔抗人BCLlIB—抗(Bethyl，美國)4°C過夜，或37°Clh后用WashingBuffer洗滌3次，每次5min。再分別放入1:500的羊抗小鼠和羊抗兔二抗(eBioscience，美國)37t:孵育lh，用WashingBuffer洗滌3次，每次5min;F、ECL顯色通過ECL顯色試劑盒(碧云天，上海)顯色，經(jīng)顯影、定影后觀察內(nèi)參P-actin和目的蛋白BCL11B的表達量，根據(jù)實驗結(jié)果調(diào)整曝光時間。最后通過Imagequantition灰度分析軟件檢測、分析轉(zhuǎn)染后各組BCL11B蛋白水平的表達情況。Westernblot結(jié)果(見圖5)顯示，與各對照組相比，轉(zhuǎn)染后48h、72h，siRNA-434組BCL11B蛋白水平表達均明顯下調(diào)，其中以72h作用較好，與SC組相比，抑制率達到了41.73%即本發(fā)明提供的抑制BCL11B表達和腫瘤性T細胞增殖的siRNA_434能有效下調(diào)Molt-4細胞中BCL11B基因的表達。實施例3此實施例表明了siRNA-434下調(diào)Molt-4細胞BCLllB表達后所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。包括形態(tài)學(xué)變化、細胞增殖和凋亡和周期的變化等。(1)形態(tài)學(xué)變化各組取約1X104細胞，按常規(guī)方法進行Hoechst33258(碧云天，上海)，核染色，染色后用熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)。結(jié)果顯示siRNA-434組細胞呈明顯的凋亡細胞狀態(tài)，細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色有些發(fā)白，而其余各對照組細胞核呈正常的藍色。(2)CCK-8法檢測細胞增殖情況轉(zhuǎn)染結(jié)束立即取各組細胞約1X104個，每組平行取3孔，放入培養(yǎng)箱中72h后加入10iU的CCK-8溶液(同仁化學(xué)研究所，日本)，再37°C孵育lh，于450nm處檢測各組0D值，計算抑制率。結(jié)果顯示，與各對照組相比，siRNA-434組可以明顯抑制細胞的增殖(表3)。表3:CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染72h后對Molt_4細胞增殖的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*:P<0.05siRNA-434VS其余各組(3)流式細胞儀檢測細胞凋亡情況轉(zhuǎn)染72h后取各組細胞約lX10s個，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，1ml結(jié)合緩沖液洗細胞2次，離心去上清，加入200y1結(jié)合緩沖液，重懸細胞后，分別加入10ylA皿exinV和5PI溶液，輕輕混勻，避光反應(yīng)30min，立即上機檢測，Winmdi軟件分析結(jié)果。結(jié)果顯示，與各對照組相比，siRNA-434組細胞早期和中晚期凋亡均有增加(圖6)。(4)流式細胞儀檢測細胞周期變化情況轉(zhuǎn)染72h后取各組細胞約1X105個，用4t:預(yù)冷的70%乙醇固定24h，隨后用PBS洗滌細胞，去除固定液，加lg/L的RNaseA200y1，100mg/L的碘化丙錠800ill，置4t:冰箱內(nèi)，30min后在流式細胞儀測定DNA含量的變化。結(jié)果顯示，與各對照組相比，siRNA-434組細胞未見明顯細胞周期變化(表4)。此結(jié)果說明了抑制BCLllB基因的表達對Molt-4細胞周期沒有影響，提示本發(fā)明的siRNA-434主要是通過促進細胞凋亡，而非調(diào)節(jié)腫瘤細胞的周期，將其生長增殖阻滯在某一階段，從而發(fā)揮抗白血病細胞的生物學(xué)效應(yīng)。表4:流式細胞儀檢測各組細胞周期情況組別^^^、G1/G0%_(G2+M)%_S%~~siRNA-43456.45±16.901.40±0.4242.15±17,32SC48.75±5.160.80±1.1350.45±6.29MOCK50.45±8.133.60±4.5345.90±12.73NC47息3.393.60±1.8448.85±1.63上述實驗結(jié)果說明了本發(fā)明提供的抑制BCLllB表達和腫瘤性T細胞增殖的siRNA-434具有明顯的抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡的功能。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING〈110〉暨南大學(xué)〈120〉抑制BCLllB表達和腫瘤性T細胞增殖的siRNA-434及應(yīng)用〈130>1〈160>4〈170>PatentInversion3.2〈210>1〈211>25〈212>RNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223>siRNA-434的正義鏈〈400>1ucaccuguggccaguguc朋aug朋25〈210>2〈211>25〈212>RNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223>siRNA-434的反義鏈〈400>2皿c3皿ugac3cuggccac3gguga25〈210>38〈211>25〈212>RNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223>SC組的siRNA的正義鏈〈400>3cca朋gg3Cgagagc3gguucfiima〈210>4〈211>25〈212>RNA〈213>artificialsequence〈220〉〈223>SC組的siRNA的反義鏈〈400>4uimugaaccugcucucguccuuugg權(quán)利要求一種抑制BCL11B表達和腫瘤性T細胞增殖的siRNA-434，其特征在于所述siRNA-434序列如下正義鏈5’-UCACCUGUGGCCAGUGUCAAAUGAA-3’反義鏈5’-UUCAUUUGACACUGGCCACAGGUGA-3’。2.權(quán)利要求1所述抑制BCLlIB表達和腫瘤性T細胞增殖的siRNA-434的應(yīng)用，其特征在于所述siRNA-434用于抑制BCLllB基因的表達或用于制備治療T細胞腫瘤的藥物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述T細胞腫瘤為T細胞白血病。全文摘要本發(fā)明公開了一種能高效地抑制BCL11B表達和腫瘤性T細胞增殖的siRNA-434及應(yīng)用。所述的siRNA-434序列為正義鏈5’-UCACCUGUGGCCAGUGUCAAAUGAA-3’；反義鏈5’-UUCAUUUGACACUGGCCACAGGUGA-3’。所述的siRNA-434能高效抑制BCL11B基因的表達，mRNA的下調(diào)程度達到2～6倍，蛋白表達的抑制率達到41.73％，同時所述的siRNA-434能有效抑制腫瘤性T細胞的增殖。本發(fā)明所述的siRNA-434對于開發(fā)新的抗T細胞腫瘤基因藥物和提高T細胞腫瘤的治療效果有重要的意義，具有很大的應(yīng)用前景和經(jīng)濟價值。文檔編號A61K48/00GK101696412SQ200910193249公開日2010年4月21日申請日期2009年10月23日優(yōu)先權(quán)日2009年10月23日發(fā)明者李揚秋,楊力建,陳少華,陳思,黃欣申請人:暨南大學(xué);