專利名稱：：副溶血弧菌外膜蛋白vp2850的制備及其免疫保護(hù)功能的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的制備方法及其免疫保護(hù)功能的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是海水中常見的弧菌之一，是近年來引發(fā)微生物性食物中毒居首位的病原菌，也是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的一種重要致病菌。對(duì)這類致病菌的防治主要包括藥物即抗生素防治以及免疫防治?？股仉m然在最初的使用中取得了巨大的進(jìn)展，然而隨著抗生素的廣泛使用，也出現(xiàn)了一系列的相關(guān)問題，一方面抗生素的不合理使用，增加抗生素耐藥菌的產(chǎn)生，細(xì)菌感染增多；另一方面，因抗生素的耐藥性而人為地加大劑量，加劇耐藥性的產(chǎn)生。因此，研制以具有免疫保護(hù)作用的高效中和抗原為成分的疫苗具有廣闊的應(yīng)用前景。在各種動(dòng)物疾病的防治中，疫苗的使用是一個(gè)低成本、高效的方法，并且已經(jīng)有部分疫苗得到大規(guī)模使用并取得了不錯(cuò)的防治效果。疫苗種類很多，以細(xì)菌為例，包括全菌疫苗、亞單位疫苗以及DNA疫菌等。從實(shí)際應(yīng)用的情況來看，全菌疫苗雖然具有制作相對(duì)簡(jiǎn)單而且成本也較低的優(yōu)點(diǎn)，但也存在不少由于使用全菌體而固有的一些缺點(diǎn)，如減毒全菌疫苗可能出現(xiàn)菌株突變而導(dǎo)致毒性恢復(fù)等不良后果；滅活全菌疫苗則往往由于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行滅活而導(dǎo)致一些免疫保護(hù)基團(tuán)活性改變，影響免疫保護(hù)的效果。而且對(duì)全菌疫苗來說，由于細(xì)菌成分的復(fù)雜性，其中往往存在一些毒性成分(如LPS等)，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生不良反應(yīng)。常規(guī)制得的全菌疫苗免疫保護(hù)效果并不理想，然而，全菌疫苗仍然是目前最為主要的疫苗種類，其原因可能與高效中和抗原的發(fā)現(xiàn)和鑒定困難有關(guān)?；蚪M學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄分布圖技術(shù)的發(fā)展，為細(xì)菌疫苗提供了新的契機(jī)。基因工程疫苗由于其高效而且擺脫了傳統(tǒng)疫苗的種種缺點(diǎn)，成為疫苗研究的重點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用與開發(fā)前景。外膜蛋白(outermembraneprotein,0Mprotein)是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分之一，由于外膜蛋白直接面對(duì)宿主的體液及組織，細(xì)菌利用外膜蛋白進(jìn)行黏附、侵入和炎癥等生理活動(dòng)，更容易被宿主識(shí)別作為攻擊目標(biāo)，使得革蘭氏陰性菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，不僅可以剌激體液免疫，而且對(duì)細(xì)胞免疫亦有剌激作用。近年來，細(xì)菌的一些外膜蛋白已經(jīng)被證實(shí)具有良好的免疫原性，對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫均有剌激作用，用其制備基因工程疫苗具有良好的前景，例如在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)外膜蛋白0mpX的免疫保護(hù)功能。然而，副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的免疫保護(hù)功能及其應(yīng)用尚未被報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的制備方法，包括以下步驟1)副溶血弧菌外膜蛋白VP2850基因的擴(kuò)增；2)副溶血弧菌外膜蛋白VP2850基因的克隆、篩選；3)副溶血弧菌外膜蛋白VP2850基因的表達(dá)；2/11頁4)副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的純化。本發(fā)明還提供了副溶血弧菌外膜蛋白VP2850作為疫苗組分的應(yīng)用。其中，所述的疫苗用于抵抗細(xì)菌感染，包括抵抗副溶血弧菌、溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌以及嗜水氣單胞菌的感染。本發(fā)明還提供了副溶血弧菌外膜蛋白VP2850在制備抗細(xì)菌感染制劑中的應(yīng)用。其中，所述的細(xì)菌包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌。副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的被動(dòng)免疫保護(hù)試驗(yàn)、主動(dòng)免疫保護(hù)試驗(yàn)及主動(dòng)交叉免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明副溶血弧菌外膜蛋白VP2850免疫鯽魚后可顯著提高鯽魚對(duì)致病性副溶血弧菌的抵制力；免疫鯽魚和小鼠后還可以提高鯽魚和小鼠對(duì)溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌的抵抗力。由此可見，副溶血弧菌外膜蛋白VP2850具有明顯的免疫保護(hù)作用，可用作疫苗組分或者抗細(xì)菌感染制劑，用于防治副溶血弧菌、溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌感染所導(dǎo)致的疾病。圖1為VP2850基因PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖2為VP1192基因PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖3為重組PV2850基因雙酶切鑒定圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖4為重組PV1192基因雙酶切鑒定圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖5為VP2850基因表達(dá)與純化產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)圖，其中a為基因表達(dá)產(chǎn)物，b為純化產(chǎn)物；圖6為VP1192基因表達(dá)與純化產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)圖，其中a為基因表達(dá)產(chǎn)物，b為純化產(chǎn)物；圖7為副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的MALDI-TOF/MS肽指紋圖譜。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(2001byColdSpringHarborLaboratoryPress)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例一副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的制備和純化將全長(zhǎng)的副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的基因編碼序列或片段構(gòu)建入大腸桿菌蛋白質(zhì)原核表達(dá)載體中，以表達(dá)和提純目的蛋白。副溶血弧菌外膜蛋白VP2850基因編碼序列如下ttatttagcgaagttgatgatagggaaacatttgaagaagccgttatccg50cacagttcaacagaccaatttgcacgccatcgatttggtcagtcatgttg100aagaagccaagttggaagttagactttttagaaatactcgccagaccaac150atctgccatggtgtaaccttctgagtagttcaccgcactccagtttaggc2004ctttcacgttgttcgtgatgtttaccgcaccaaagttcacaccagttgtt250tggccttggttccagttaaccaaaccaagtgacgcacctttcatctcttg300gtttactttcgctgccccaaagaacagaccgaagttcacacccgtagtac350ggtcagtttc3g3catecct3g朋ctgag3agtcgacgccttttacttcg400tttacttggccatgcagtaccgccaaacgaacaccaccaaC3gC3g3gtt450tgatggagcgttegtetggtcgatcgttga朋3C3tc3C3ggggtgctgt500tcgcaagagcaacaggtgatgcgatagtggctgcaacagccaatgacgtc550ataagctttttcatttttatctccat576副溶血弧菌外膜蛋白VP2850氨基酸序列如下MEIKMKKLMTSLAVAATIASPVALANSTPVMFSTIDHTNAPSNSAVGGVR50LAVLHGQVNEVKGVDFSVLGMSETDRTTGVNFGLFFGAAKVNQEMKGASL100GLV麗NQGQTTGVNFGAVNITNNVKGL麗SAVNYSEGYTMADVGLASISK150KSNFQLGFFNMTDQIDGVQIGLLNCADNGFFKCFPIINFAK1911、副溶血弧菌外膜蛋白VP2850基因的擴(kuò)增根據(jù)NCBI公布的副溶血弧菌的全基因組序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物序列如下正向引物(Senseprimer):5，-GCGGAATTCTTACTGCTTACCATCAT-3，；反向引物(Anti-sensePrimer):5'-TGTCTCGAGTTTGGTATCTGGCTTT-3'。為便于克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建，在引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)EcoRI和XhoI。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以熱變性法獲得的副溶血弧菌的全基因組為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系如下PCR反應(yīng)緩沖液2.5iil，10mmol/LdNTP共1yl，10ymol/L正向引物和反向引物各lyl，模板DNA12iU，用超純水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至25iU。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)如下第一步94°C2min;第二步94。C變性60s，52。C退火60s，72。C延伸60s，30個(gè)循環(huán)。隨后繼續(xù)在72°C延伸10min，并在4t:下保存。用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定DNA片段的長(zhǎng)度(見圖1)并回收DNA片段。2、副溶血弧菌外膜蛋白VP2850基因的克隆、篩選和鑒定用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI分別酶切DNA片段和pET-32a(Novagen)表達(dá)載體，參照Takara公司的DNA連接試劑盒使用說明書進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系如下酶溶液5ii1，經(jīng)酶切的PCR反應(yīng)產(chǎn)物1y1，經(jīng)酶切的pET-32a表達(dá)載體0.5y1，用超純水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至10iU，于16t:左右保溫1416小時(shí)。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，轉(zhuǎn)化后將菌體涂于含氨芐青霉素(50iig/mL)的LB固體平板上，于37。C培養(yǎng)1216小時(shí)。隨機(jī)挑取含氨芐青霉素的LB平板上的重組子，接種于含氨芐青霉素(50iig/mL)的LB液體培養(yǎng)基上，同時(shí)接種含有空pET-32a質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a，于37。C培養(yǎng)1216小時(shí)后，用堿裂解法分別提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定(見圖3)。將有插入的重組子送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明與NCBI中報(bào)道的副溶血弧菌外膜蛋白VP2850有98%的同源性，說明得到了正確的重組PV2850基因。3、副溶血弧菌外膜蛋白VP2850基因的表達(dá)將正確的重組PV2850基因以熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表達(dá)菌，于37。C培養(yǎng)1216小時(shí)。將單菌落接種于含氨芐青霉素(50i!g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，同時(shí)接種含有空pET-32a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21作為對(duì)照，于37。C培養(yǎng)至0D值為0.6，加入0.5mmol/LIPTG，于35tH秀導(dǎo)3小時(shí)，離心收集菌體。通過SDS-PAGE檢測(cè)重組PV2850基因是否表達(dá)蛋白以及表達(dá)蛋白的分子量大小，結(jié)果如圖5所示。4、副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的純化大量培育轉(zhuǎn)化菌體，離心后進(jìn)行超聲處理，離心收集上清液用Ni-NTAHisBind親和柱進(jìn)行純化。第一步，用沖洗緩沖液BufferE(8M尿素、0.1MNaH2P04、10mmTris-HCl，用HCl調(diào)節(jié)pH值至6.3)洗滌5次，每次用量為lml;第二步，用洗脫緩沖液BufferF(8M尿素、0.1MNaH2P04、10mmTris-HCl，用HC1調(diào)節(jié)pH值至5.9)洗脫目的蛋白4次，每次用量為lml，收集洗脫液A;第三步，用洗脫緩沖液BufferG(8M尿素、0.1MNaH2P04、10mmTris-HCl，用HCl調(diào)節(jié)pH值至4.5)洗脫未結(jié)合Ni-NTAHisBind親和柱的蛋白4次，每次用量為lml，收集洗脫液B。取收集的洗脫液A和洗脫液B進(jìn)行SDS-PAGE分析，純化結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，重組PV2850基因表達(dá)蛋白的分子量均相當(dāng)于野生型VP2850基因表達(dá)蛋白的分子量，即比實(shí)際小20kD，提示其不含融合蛋白分子量。為證明該推論，通過質(zhì)譜對(duì)重組菌株高表達(dá)的純化蛋白進(jìn)行分析，質(zhì)譜結(jié)果(如圖7所示)表明，該蛋白為副溶血弧菌外膜蛋白VP2850(見表1)。將純化好的副溶血弧菌外膜蛋白VP2850分裝，冷凍干燥成粉末后，凍存于-8(TC冰箱中。表1副溶血弧菌外膜蛋白VP2850肽質(zhì)量指紋圖譜的MatrixMowse檢索結(jié)果蛋白登錄號(hào)描述物種分子量(kDa)等電點(diǎn)質(zhì)譜匹配(%)Mowse得分VP2850GI|28899624|假想蛋白副溶血性弧菌202147.7734%98實(shí)施例二副溶血弧菌外膜蛋白VP1192的制備和純化將全長(zhǎng)的副溶血弧菌外膜蛋白VP1192的基因編碼序列或片段構(gòu)建入大腸桿菌蛋白質(zhì)原核表達(dá)載體中，以表達(dá)和提純目的蛋白。副溶血弧菌外膜蛋白VP1192基因編碼序列如下ttagcgaggtacaacccttgcgtcattacc50cttggcctggctgg^^tcatgtttgggtttgcttcttg100atgatctttccatcctctaagcg^tegtgaggttcacaccatttctttt150cgcggttgcttcggcggctttactacctgcatagccacct200caccaatggctgcgatatccgagccag^ccgcccccaattttcgaaccc250朋朋tgCC3Cccacggcagcccctgctattgteccgatggcgttggattg300ggt卿ggC3tcaatggttacgggttctactttttctatcgtgccgtegt350aaacctgctgaactttgcgagtgtcggacgagccgtatgcatctccgtac400gggtteggtgagctacagccgCC33gC3Cgatcgcac^g450caacatgcctaacttgatgtgttttttcat■副溶血弧菌外膜蛋白VP1192氨基酸序列如下MKKHIKLGMLLTITCAIVLGGCSSPNPYGDAYGSSDTRKVQQVYYGTIEK50VEPVTIDASTQSNAIGTIAGAAVGGILGSKIGGGSGSDIAAIGGGLLGGY1006AGSKAAEATAKRNGVNLTIRLEDGKIISVVQEANPNMIFQPGQAVQINMS150GNDARVVPR1591、副溶血弧菌外膜蛋白VP1192基因的擴(kuò)增根據(jù)NCBI公布的副溶血弧菌的全基因組序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物序列如下正向引物(Senseprimer):5，-CGCGGATCCATGAAAAAACACATCAAGT_3，;反向引物(Anti-sensePrimer):5，-AGCAAGCTTTTAGCGAGGTACAACCC-3，。為便于克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建，在引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)BamHI和HindIII。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以熱變性法獲得的副溶血弧菌的全基因組為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系如下PCR反應(yīng)緩沖液2.5iil，10mmol/LdNTP共1yl，10ymol/L正向引物和反向引物各lyl，模板DNA12iU，用超純水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至25iU。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)如下第一步94。C2min;第二步94。C變性60s，6(TC退火60s，72。C延伸60s，30個(gè)循環(huán)。隨后繼續(xù)在72°C延伸10min，并在4t:下保存。用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定DNA片段的長(zhǎng)度(見圖2)并回收DNA片段。2、副溶血弧菌外膜蛋白VP1192基因的克隆、篩選和鑒定用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII分別酶切DNA片段和pET-32a(Novagen)表達(dá)載體，參照Takara公司的DNA連接試劑盒使用說明書進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系如下酶溶液5iil，經(jīng)酶切的PCR反應(yīng)產(chǎn)物1iil，經(jīng)酶切的pET-32a表達(dá)載體0.5iil，用超純水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至10iU，于16t:左右保溫1416小時(shí)。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，轉(zhuǎn)化后將菌體涂于含氨芐青霉素(50i!g/mL)的LB固體平板上，于37。C培養(yǎng)1216小時(shí)。隨機(jī)挑取含氨芐青霉素的LB平板上的重組子，接種于含氨芐青霉素(50i!g/mL)的LB液體培養(yǎng)基上，同時(shí)接種含有空pET-32a質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a，于37。C培養(yǎng)1216小時(shí)后，用堿裂解法分別提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定(見圖4)。將有插入的重組子送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明與NCBI中報(bào)道的副溶血弧菌外膜蛋白1192有97.5%的同源性，說明得到了正確的重組PV1192基因。3、副溶血弧菌外膜蛋白VP1192基因的表達(dá)將正確的重組PV1192基因以熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表達(dá)菌，于37。C培養(yǎng)1216小時(shí)。將單菌落接種于含氨芐青霉素(50i!g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，同時(shí)接種含有空pET-32a質(zhì)粒的大腸桿菌BL21作為對(duì)照，于37。C培養(yǎng)至0D值為0.6，加入0.5mmol/LIPTG，于35tH秀導(dǎo)3小時(shí)，離心收集菌體。通過SDS-PAGE檢測(cè)重組PV1192基因是否表達(dá)蛋白以及表達(dá)蛋白的分子量大小，結(jié)果如圖6所示。4、副溶血弧菌外膜蛋白VP1192的純化大量培育轉(zhuǎn)化菌體，離心后進(jìn)行超聲處理，離心收集上清液用Ni-NTAHisBind親和柱進(jìn)行純化。第一步，用沖洗緩沖液BufferE(8M尿素、0.1MNaH2P04、10mmTris-HCl，用HCl調(diào)節(jié)pH值至6.3)洗滌5次，每次用量為lml;第二步，用洗脫緩沖液BufferF(8M尿素、0.1MNaH2P04、10mmTris-HCl，用HC1調(diào)節(jié)pH值至5.9)洗脫目的蛋白4次，每次用量為lml，收集洗脫液A;第三步，用洗脫緩沖液BufferG(8M尿素、0.1MNaH2P04、10mmTris-HCl，用HCl調(diào)節(jié)pH值至4.5)洗脫未結(jié)合Ni-NTAHisBind親和柱的蛋白4次，每次用量為lml，收集洗脫液B。取收集的洗脫液A和洗脫液B進(jìn)行SDS-PAGE分析，純化結(jié)果如圖6所示。7將純化好的副溶血弧菌外膜蛋白VP1192分裝，冷凍干燥成粉末后，凍存于-S(TC冰箱中。實(shí)施例三副溶血弧菌外膜蛋白VP2850抗血清的被動(dòng)免疫保護(hù)作用將實(shí)施例一所制得的純化的副溶血弧菌外膜蛋白VP2850免疫家兔，獲取VP2850抗血清。具體步驟如下將副溶血弧菌外膜蛋白VP2850凍干粉溶于適量的超純水中，然后與等體積的弗氏完全佐劑(羊毛脂石蠟油=1:4v/v，卡介苗為30mg/ml)混合均勻，其中蛋白含量約為500iig，然后超聲處理2min，即制得VP2850抗原，采用皮下多點(diǎn)注射；20天后，將副溶血弧菌外膜蛋白VP2850與等體積的弗氏不完全佐劑(羊毛脂石蠟油=1:4v/v)混合，給家兔進(jìn)行注射，其中蛋白含量約為500iig;20天后再注射一次，7天后頸動(dòng)脈取血，4t:過夜后使血清自然析出；4°C3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，取上清液即得VP2850抗血清。按照相同方法，將實(shí)施例二所制得的純化的副溶血弧菌外膜蛋白VP1192免疫家兔，獲取VP1192抗血清，作為對(duì)照試驗(yàn)用抗血清。采用Dot-ELISA技術(shù)，分別測(cè)定VP2850抗血清和VP1192抗血清的效價(jià)。測(cè)得VP2850抗血清的效價(jià)為2.5萬，VP1192抗血清的效價(jià)為5萬。將購買的鯽魚(約為20g/尾)飼養(yǎng)1周，水溫控制在25士2t:，每天早晚兩次投喂人工配合飼料，馴養(yǎng)1周后無異常的隨機(jī)分組進(jìn)行免疫注射。根據(jù)上述Dot-ELISA的結(jié)果，取相等效價(jià)的VP2850抗血清和VP1192抗血清分別對(duì)鯽魚(約20克/條)進(jìn)行被動(dòng)免疫。實(shí)驗(yàn)組中，給鯽魚腹腔注射100ii1抗血清，2.5小時(shí)后用5倍半數(shù)致死劑量的副溶血弧菌(5X108cfu/ml)進(jìn)行感染?？瞻讓?duì)照組中，給鯽魚腹腔注射100iU生理鹽水后，用等量的副溶血弧菌進(jìn)行感染。觀察72小時(shí)后各組鯽魚的生存情況，計(jì)算各組鯽魚的相對(duì)免疫保護(hù)率。結(jié)果顯示，VP2850抗血清的相對(duì)免疫保護(hù)率為75.0%，VP1192抗血清的相對(duì)免疫保護(hù)率僅為15.0%，空白對(duì)照組的鯽魚均死亡(見表2)。三組數(shù)據(jù)相互間具有非常顯著的差異，表明副溶血弧菌外膜蛋白VP2850具有明顯的被動(dòng)免疫保護(hù)作用。[oogo]相對(duì)免疫保護(hù)率(％)=(1-試驗(yàn)組死亡率/對(duì)照組死亡率)X100%表2副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的被動(dòng)免疫保護(hù)作用<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*P<0.05實(shí)施例四副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的主動(dòng)免疫保護(hù)作用按照實(shí)施例三所述的條件飼養(yǎng)鯽魚，馴養(yǎng)1周后無異常的隨機(jī)分組進(jìn)行免疫注射。將實(shí)施例一所制得的純化的副溶血弧菌外膜蛋白VP2850凍干粉溶于適量的超純水中，然后與等體積的弗氏完全佐劑(羊毛脂石蠟油=1:4v/v，卡介苗為30mg/ml)混合均勻，其中蛋白含量約為25iig，然后超聲處理2min，即制得VP2850抗原。實(shí)驗(yàn)組中，給鯽魚腹腔注射VP2850抗原，25iig/尾魚；10天后，將副溶血弧菌外膜蛋白VP2850與等體積的弗氏不完全佐劑(羊毛脂石蠟油=1:4v/v)混合，給鯽魚進(jìn)行腹腔注射，12.5iig/尾魚。空白對(duì)照組中，給鯽魚腹腔注射生理鹽水100iU，每隔10天注射1次，共注射2次。第2次免疫注射7天后，對(duì)各組鯽魚用5倍半數(shù)致死劑量的副溶血弧菌(5X108cfu/mL)進(jìn)行攻毒保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。觀察72小時(shí)后各組鯽魚的生存情況，計(jì)算各組鯽魚的相對(duì)免疫保護(hù)率并據(jù)此比較分析免疫原性蛋白質(zhì)的保護(hù)效果。結(jié)果顯示，副溶血弧菌外膜蛋白VP2850免疫鯽魚對(duì)抗副溶血弧菌攻毒的相對(duì)免疫保護(hù)率為83.3X(見表3)。結(jié)果表明，副溶血弧菌外膜蛋白VP2850具有明顯的主動(dòng)免疫保護(hù)作用。表3副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的主動(dòng)免疫保護(hù)作用分組尾數(shù)存活數(shù)死亡率相對(duì)免疫保護(hù)率VP2850免疫組201715%83.3%*空白對(duì)照組20290%*P<0.01實(shí)施例五副溶血弧菌外膜蛋白VP2850抗血清的主動(dòng)交叉免疫保護(hù)作用1、對(duì)鯽魚的主動(dòng)交叉免疫保護(hù)作用參照實(shí)施例四所述的方法進(jìn)行試驗(yàn)，其中進(jìn)行攻毒保護(hù)性實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)菌為溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌及嗜水氣單胞菌。攻毒劑量定為溶藻弧菌5X108cfu/ml，熒光假單胞桿菌5X108cfu/ml，嗜水氣單胞菌4X108cfu/ml。觀察120小時(shí)后各組鯽魚的生存情況，計(jì)算各組鯽魚的相對(duì)免疫保護(hù)率。結(jié)果顯示，副溶血弧菌外膜蛋白VP2850對(duì)抗溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌攻毒的相對(duì)免疫保護(hù)率依次為83.3%、92.9%和66.7%(見表4)。表4副溶血弧菌外膜蛋白VP2850對(duì)鯽魚的主動(dòng)交叉免疫保護(hù)作用分組尾數(shù)存活數(shù)死亡率相對(duì)免疫保護(hù)率溶藻弧菌攻毒VP2850免疫組151313.3%83.3%*空白對(duì)照組20480.0%熒光假單胞菌VP2850免疫組15146.7%92.9%'攻毒空白對(duì)照組20195.0%嗜水氣單胞菌VP2850免疫組151033.3%66.7%*攻毒空白對(duì)照組200100%*P<0.052、對(duì)小鼠的主動(dòng)交叉免疫保護(hù)作用采用約3周左右的昆明鼠作為試驗(yàn)小鼠，分別用溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌及嗜水氣單胞菌進(jìn)行攻毒保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。首先對(duì)小鼠進(jìn)行副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的免疫。免疫過程如下將實(shí)施例一所制得的純化的副溶血弧菌外膜蛋白VP2850凍干粉溶于適量的超純水中，然后與等體積9的弗氏完全佐劑(羊毛脂石蠟油=1:4v/v，卡介苗為30mg/ml)混合均勻，其中蛋白含量約為lOOiig，然后超聲處理2min，即制得VP2850抗原。實(shí)驗(yàn)組中，給昆明鼠腹腔注射VP2850抗原；10天后，將副溶血弧菌外膜蛋白VP2850與等體積的弗氏不完全佐劑(羊毛脂石蠟油=1:4v/v)混合，其中蛋白含量約為100i!g，給昆明鼠進(jìn)行腹腔注射?？瞻讓?duì)照組中，給昆明鼠腹腔注射生理鹽水100iU，10天后再注射1次。第2次免疫注射約7天后，對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。攻毒劑量定為溶藻弧菌5X109cfu/ml，熒光假單胞桿菌5X109cfu/ml，嗜水氣單胞菌4Xl()9cfu/ml。觀察72小時(shí)后各組小鼠的生存情況，計(jì)算各組小鼠的相對(duì)免疫保護(hù)率。結(jié)果顯示，副溶血弧菌外膜蛋白VP2850對(duì)抗溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌攻毒的相對(duì)免疫保護(hù)率依次為80.0%、68.4%和73.3%(見表5)。表5副溶血弧菌外膜蛋白VP2850對(duì)小鼠的主動(dòng)交叉免疫保護(hù)作用__只數(shù)存活數(shù)死亡率相對(duì)免疫保護(hù)率溶藻酸弧菌201715%80.0%*;^纟;熒光假單胞桿菌201430%68.4%**嗜水氣單胞菌201620%73.3%**溶藻酸弧菌20575%-—…^^^"熒光假單胞桿菌20195%—---嗜水氣單胞菌20575%------*P<0.05;**P<0.01結(jié)果表明，副溶血弧菌外膜蛋白VP2850具有明顯的主動(dòng)交叉免疫保護(hù)作用。綜上所述，副溶血弧菌外膜蛋白VP2850具有明顯的免疫保護(hù)作用，可用作疫苗組分或者抗細(xì)菌感染制劑，用于防治副溶血弧菌、溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌感染所導(dǎo)致的疾病。序列表〈110>中山大學(xué)〈120〉副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的制備及其免疫保護(hù)功能的應(yīng)用〈160>4〈210>1〈211>576〈212>DNA〈213〉副溶血弧菌外膜蛋白VP2850編碼基因〈400〉1ttatttagcgaagttgatgatagggaaacatttgaagaagccgttatccg50cacagttcaacagaccaatttgcacgccatcgatttggtcagtcatgttg100aagaagccaagttggaagttagactttttagaaatactcgccagaccaac150atctgccatggtgtaaccttctgagtagttcaccgcactccagtttaggc200ctttcacgttgttcgtgatgtttaccgcaccaaagttcacaccagttgtt250tggccttggttccagttaaccaaaccaagtgacgcacctttcatctcttg300gtttactttcgctgccccaaagaacagaccg朋gttC3C3cccgtagtac350ggtcagtttcagacatecct3g朋ctg3galagtcgacgccttttacttcg400tttacttggccatgcagtaccgccaaacgaC3gC3g3gtt450tgatggagcgttagtatggtcgatcgttgaggggtgctgt500tcgc朋gagcaacaggtgatgcgatagtgg-ctgcaacagccaatgacgtc550ataagctttttcatttttatctccat576〈210>2〈211>191〈212>PRT〈213〉副溶血弧菌外膜蛋白VP2850〈400>2MetGlulieLysMetLysLysLeuMetThrSerLeuAlaValAla51015AlaThrlieAlaSerProValAlaLeuAlaAsnSerThrProVal202530MetPheSerThrlieAspHisThrAsnAlaProSerAsnSerAla354045ValGlyGlyValArgLeuAlaValLeuHisGlyGinValAsnGlu505560ValLysGlyValAspPheSerValLeuGlyMetSerGluThrAsp657075ArgThrThrGlyValAsnPheGlyLeuPhePheGlyAlaAlaLys808590ValAsnGinGluMetLysGlyAlaSerLeuGlyLeuValAsnTrp95100105AsnGinGlyGinThrThrGlyValAsnPheGlyAlaValAsnlie110115120ThrAsnAsnValLysGlyLeuAsnTrpSerAlaValAsnTyrSer125130135GluGlyTyrThrMetAlaAspValGlyLeuAlaSerlieSerLys140145150LysSerAsnPheGinLeuGlyPhePheAsnMetThrAspGinlie155160165AspGlyValGinlieGlyLeuLeuAsnCysAlaAspAsnGlyPhe170175180PheLysCysPheProlielieAsnPheAlaLys185190ttagcgaggtacaacccttgcgtcattacc3g3C3tgttgatttg朋cgg50cttggcctggctgg朋朋tcatgtttgggtttgcttcttg朋Cg3C3g3t100atgatctttccatcctctaagcg朋tegtgaggttcacaccatttctttt150cgcggttgcttcggcggctttactacctgcatagccacctaataaaccac200caccaatggctgcgatatccg3gCC3g朋Ccgcccccaattttcgaaccc250朋朋tgCC3Cccacggcagcccctgctattgtaccgatggcgttggattg300ggt卿ggC3tcaatggttacgggttctactttttctatcgtgccgtagt350aaacctgctgaactttgcgagtgtcggacgagccgtatgcatctccgtac400gggtteggtgagctacagccgcc朋gcacg3tCgC3C33gt￡l￡ltggtg￡lg450caacatgcctaacttgatgtgttttttcat■〈210>4〈211>159〈212>PRT0167]〈210>30168]〈211>4800169]〈212>DNA0170]〈213〉副溶血弧菌外膜蛋白VP1192編碼基因0171]〈400>30185]0186]0187]0188]0189]0190]0191]0192]0193]0194]0195]0196]0197]0198]0199]0200]0201]0202]0203]0204]0205]〈213〉副溶血弧菌外膜蛋白VP1192〈400>4MetLysLysHislieLysLeuGlyMetAlalieValLeuAlaTyrGlySerGlyThrlieGluGinSerAsnAlalieLeuGlyAlalieGlySerGlyAlaGluAlaThrLeuGluAspGlyAsnMetliePhe5Gly20Ser35Lys50lie65Lys80Gly95Ala110Lys125GinGlyCysSerSerAspThrArgLysValGluProValGlyThrlieAlalieGlyGlyLeuLeuGlyGlyGlyLysArgAsnGlylielieSerValProGlyGinAlaLeu10Pro25Val40Thr55Gly70Ser85Tyr100Val115Val130ValLeuAsnGinlieAlaGlyAlaAsnGinGinThrlieProTyrGinValAspAlaAlaValSerAspGlySerLeuThrGluAlalieAsnThrGlyTyrSerGlylieLyslieAsnMetCys15Asp30Tyr45Thr60Gly75Ala90Ala105Arg120Pro135Ser12140145150GlyAsnAspAlaArgValValProArg15權(quán)利要求副溶血弧菌外膜蛋白VP2850作為疫苗組分的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的疫苗用于抵抗細(xì)菌感染。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的細(xì)菌包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌。4.副溶血弧菌外膜蛋白VP2850在制備抗細(xì)菌感染制劑中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的細(xì)菌包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌。全文摘要本發(fā)明公開了副溶血弧菌外膜蛋白VP2850的制備方法、免疫保護(hù)功能及其作為免疫組分和抗細(xì)菌感染制劑的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明，副溶血弧菌外膜蛋白VP2850具有明顯的免疫保護(hù)作用，能夠有效抵抗副溶血弧菌、溶藻弧菌、熒光假單胞桿菌和嗜水氣單胞菌的感染，以及防治這些細(xì)菌感染所導(dǎo)致的疾病。文檔編號(hào)A61K39/106GK101703767SQ200910193558公開日2010年5月12日申請(qǐng)日期2009年11月2日優(yōu)先權(quán)日2009年11月2日發(fā)明者葉明芝,彭宣憲,李惠申請(qǐng)人:中山大學(xué)