專利名稱::一種來自蝎尾的纖溶活性蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域,尤其是蝎尾中纖溶活性蛋白的提取。本發(fā)明從蝎尾中提取一種纖溶活性蛋白,并且涉及這種纖溶活性蛋白的制備方法,以及這種纖溶活性蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù):
:蝎子為進(jìn)化上最古老的物種之一,距今已經(jīng)有4億年的歷史,在漫長的進(jìn)化過程中,其形態(tài)幾乎沒有改變。世界各地大約有1500多種蝎,分為6個(gè)科,蝎之所以引起科學(xué)家的極大興趣,不僅是因?yàn)樾?jīng)歷了漫長的進(jìn)化歷程,更重要的是由于蝎尾腺分泌的蝎毒具有極大的醫(yī)學(xué)價(jià)值。蝎毒含有多種生物活性組分,包括酶、多肽、核苷、脂類、粘蛋白、生物胺及其他未知成分。蝎毒的主要活性成分是一類由28-76個(gè)氨基酸殘基組成的小分子多肽。它們絕大多數(shù)含3-4對(duì)二硫鍵,可選擇性地與動(dòng)物可興奮細(xì)胞膜上的鈉鉀鈣氯離子通道結(jié)合,改變細(xì)胞對(duì)離子的通透能力;少數(shù)不含二硫鍵,具有舒緩激肽增效肽或抗菌等功能及功能有待確定的新的蝎毒液多肽。蝎作為一種傳統(tǒng)的藥物應(yīng)用于臨床已于人有悠久的歷史,蝎是一種傳統(tǒng)的中藥材,其藥性味成、辛、平,有毒,歸肝經(jīng);具有熄風(fēng)鎮(zhèn)痙、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止疼的功效;傳統(tǒng)驗(yàn)方中主要用于治療小兒驚風(fēng)、抽搐痙攣、中風(fēng)、半身不遂、破傷風(fēng)、風(fēng)濕頑痹、瘡瘍、瘰疬和癲癇。但用蝎毒制成注射劑或口服膠囊用來治病歷史卻不長。蝎毒臨床應(yīng)用方面的研究在國外幾乎是空白,多以理論研究為主,沒有成型的蝎毒藥品,臨床應(yīng)用只是用抗蝎毒血清治療被蝎蟄傷患者。中國對(duì)蝎毒的理論研究比國外晚,但蝎毒制藥進(jìn)展較快,目前中國的蝎毒藥品按劑型有3種第1種為注射粉劑;第2種為口服膠囊;第3種為藥膏。1蝎毒注射粉劑蝎毒千粉經(jīng)過生化分離,除去致痛物質(zhì)和其他不需要組分,經(jīng)常規(guī)制藥而成。這種制劑的主要成分是蝎毒神經(jīng)毒素。由于蝎毒成分復(fù)雜,因此從中純化特異的成分比較困難。蝎毒藥品注射粉刻工藝較復(fù)雜,一般有以下3大步驟第1步,蝎毒中藥用成分的分離純化。本步驟的技術(shù)含量最高,為制藥過程的關(guān)鍵。因?yàn)樾局泻惺畮追N至幾十種蛋白質(zhì),許多蛋白質(zhì)是有毒的或不需要的成分,該步的任務(wù)是將蝎毒通過生化方法分離,取出藥用蛋白。不同廠家(有些尚處于試驗(yàn)階段)使用的方法不同,但都通過離子交換凝膠柱和分子篩層析進(jìn)行分離、純化。常用的離子交換凝膠有CM-S印hadexC_50,CM-S印hadexC-25和DEAE-S印hadexA-50;常用的分子篩凝膠為S印hadexC-75和S印hadexC_50。一般先進(jìn)行離子交換層析,用含NaCl的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫;然后進(jìn)行分子篩層析。為獲得高純度蛋白質(zhì),往往需要反復(fù)使用離子交換層析和分子篩層析。目前利用基因工程制備蝎毒特異蛋白質(zhì)的研究正在進(jìn)行之中,但成本過高,數(shù)量有限,蝎毒仍是獲得蝎毒蛋白質(zhì)的主要來源。第2步,蝎毒有效成分濃度的測(cè)檢。該步驟的目的有2個(gè),一是檢測(cè)蝎毒是否分離合格,是否還有其他毒性物質(zhì)存在。這些毒性物質(zhì)包括出血毒素、細(xì)胞毒素和其他神經(jīng)毒素等。該步驟第2個(gè)目的是為第3步做準(zhǔn)備,因?yàn)榈?步是分裝階段,如果不知道蛋白質(zhì)的濃度,就不知道要加多少稀釋液。目前定量測(cè)定蝎毒的方法有免疫擴(kuò)散、蛋白質(zhì)含量的定量測(cè)定和半數(shù)致死量測(cè)定。第3步,一般制藥過程。包括稀釋、過濾滅菌、分裝、冷凍干燥,封口和包裝。由北京醫(yī)科大學(xué)中國藥物依賴性研究所和溫州復(fù)旦生物工程有限公司研制的蝎毒注射液(scorpionvenominjection)已經(jīng)獲得生產(chǎn)批號(hào),新藥批準(zhǔn)號(hào)為(96)衛(wèi)制申體第11號(hào),商品名為"施康寧注射液",臨床多用于鎮(zhèn)痛。尹燕東等,報(bào)道了蝎毒膚對(duì)動(dòng)物具有抗栓及纖溶作用之后,又對(duì)大鼠腦血栓模型進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究,旨在開發(fā)適宜消化系統(tǒng)用藥,而且簡(jiǎn)便、安全和有效的溶栓制劑。2膠囊類藥品膠囊類藥品的工藝包括原料的粉碎、各種原料的配比和膠囊制備。蝎毒制劑一痹痛靈膠囊是以蝎毒為主要原料的蝎毒膠囊類藥品,批號(hào)為粵湛衛(wèi)藥制劑[98]DA10-01-121號(hào),臨床用于鎮(zhèn)痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。3蝎毒藥膏國內(nèi)蝎毒藥膏一般停留在自制自用的狀態(tài),沒有批號(hào)和形成批量生產(chǎn)。至今仍未見到有關(guān)于蝎毒纖溶活性蛋白的相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種來自蝎尾的分子量為37.69千道爾頓kD的單一組分的纖溶活性蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述纖溶活性蛋白的制備方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有所述纖溶活性蛋白的抗腫瘤藥物組合物。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述纖溶活性蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的1)將蝎尾洗凈,磨碎,加入磷酸鈉緩沖液,4t:浸提過夜;2)離心去沉淀,分段鹽析,取40%_70%部分;3)最后進(jìn)行二乙氨基乙基-32纖維素離子交換層析柱純化,用Tris-HCl緩沖液洗脫,收集活性蛋白峰,濃縮,凍干。所述步驟1)中緩沖液是pH7.2濃度為0.02mol/L的磷酸鈉溶液,蝎尾重量與磷酸鈉緩沖液體積之比為1:5。所述步驟2)中分段鹽析是,在上清液中加固體硫酸銨達(dá)40%飽和度,8500轉(zhuǎn)/分,4°C離心泵中離心,收集上清液;再加入固體硫酸銨達(dá)70%飽和度,8500轉(zhuǎn)/分,4°C離心泵中離心,收集沉淀。所述步驟3)中洗脫緩沖液是含有l(wèi)mol/L氯化鈉的0.02mol/LpH8.0的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸。所述步驟3)中對(duì)纖溶組分濃縮是指超濾濃縮而且濃縮之前要用透析袋進(jìn)行除鹽,凍干是指冷風(fēng)吹干或冷凍干燥。含有所述纖溶活性蛋白的抗腫瘤藥物組合物。所述纖溶活性蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是發(fā)明涉及的纖溶活性蛋白是蝎尾中的一種單組分蛋白,分子量在37.69KD的一種純的纖溶活性蛋白,易于純化和批量制備,并且纖溶活性強(qiáng),比活高,無毒性;分子量小、抗原反應(yīng)低,是理想的抗腫瘤藥物。圖1,SDS-PAGE測(cè)定蝎毒纖溶活性蛋白的分子量。具體實(shí)施例方式下面能過實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明,但是這些實(shí)施例不在任何方面限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1:蝎毒纖溶活性蛋白的制備。[OO31]材料東亞鉗蝎(產(chǎn)地中國)制備1、粗提液的制備取蝎子,剪蝎尾,稱重,剪碎,按1:5(重量體積)的比例加入預(yù)冷的0.02mol/L磷酸鈉緩沖液PH7.2,研磨至糜狀,4t:浸提過夜。將浸提液在8500轉(zhuǎn)/分,4。C的離心泵中離心15min,收集上清液,在上清液中加固體硫酸銨達(dá)40X飽和度,8500轉(zhuǎn)/分,4t:離心泵中離心,收集上清液;再加入固體硫酸銨達(dá)70%飽和度,8500轉(zhuǎn)/分,4。C離心泵中離心,收集沉淀進(jìn)行透析濃縮,得到粗提液。2、離子交換層析預(yù)先用0.02mol/LpH8.0的Tris-HCl緩沖液平衡DEAE-32纖維素柱,用含lmo1/LNaCl的O.02mol/LpH8.0的Tris-HCl緩沖液梯度洗脫,分部收集器收集,流速為lml/min,收集各個(gè)峰,透析除NaCl,濃縮,凍干。3、電泳將純品用使用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,用5%的濃縮膠和12%的分離膠進(jìn)行電泳,考馬斯亮蘭R-250染色,測(cè)定蛋白質(zhì)純品的分子量為37.69KD(如圖l所示),具有纖溶活性。此為本發(fā)明的纖溶活性蛋白。實(shí)施例2:本發(fā)明纖溶酶生物活性的測(cè)定。試劑牛血纖維蛋白原溶液濃度10mg/mL。牛血纖維蛋白原為Sigma公司產(chǎn)品。牛凝血酶濃度100U/mL。牛凝血酶為Sigma公司產(chǎn)品。操作配制O.8X的瓊脂糖,煮沸冷卻至45-55t:,加入7mg/ml的牛血纖維蛋白原O.8ml,6U/ml的凝血酶O.5ml,迅速搖勻倒入直徑9cm的培養(yǎng)皿中,蓋上玻璃蓋,冷卻凝固后移到4t:冰箱中保存半小時(shí),用0.2ml槍頭在制備好的纖維蛋白凝膠板上打孔,每孔加樣20iiL,置37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí),考馬斯亮蘭R-250染色30min,脫色2h,測(cè)定溶圈兩垂直直徑的大小算出溶解圈的面積,對(duì)照尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線得出酶活力。實(shí)施例3:含有本發(fā)明纖溶活性蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。分別測(cè)定此纖溶活性蛋白對(duì)小鼠腹水瘤細(xì)胞S180的抑制作用,設(shè)計(jì)腹腔注射、腋下注射實(shí)體瘤相關(guān)實(shí)驗(yàn),以及運(yùn)用MTT檢測(cè)法檢測(cè)此纖溶活性蛋白對(duì)S180細(xì)胞的直接作用。1)小鼠腹腔注射S180實(shí)驗(yàn)?zāi)P偷慕⒓敖Y(jié)果接種老鼠(20±2g)細(xì)胞密度8Xl(f,腹腔注射,每組設(shè)定8只重復(fù)組,陽性對(duì)照環(huán)磷酰胺組濃度為20mg/ml,陰性對(duì)照組為等體積生理鹽水,藥物濃度組為上述蝎尾纖溶活性蛋白濃度組25mg/ml、100mg/ml,腹腔注藥7天,每次20yL,7天后測(cè)腹水細(xì)胞濃度,計(jì)算各組平均信,記錄數(shù)據(jù),結(jié)果如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>根據(jù)抑瘤率計(jì)算公式抑瘤率=(對(duì)照組平均值_治療組平均值)/對(duì)照組平均值X100%得出抑瘤率見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表可以看出蝎尾纖溶活性蛋白的抑瘤率在高濃度組時(shí)接近于陽性對(duì)照組環(huán)磷酰胺。2)小鼠S180實(shí)體瘤模型的建立及結(jié)果接種老鼠(20±2g)細(xì)胞密度7.6Xl(f,每組設(shè)定8只重復(fù)組,腋下注射,陽性對(duì)照環(huán)磷酰胺組濃度20mg/ml,陰性對(duì)照組為等體積生理鹽水,藥物濃度組為上述蝎尾纖溶活性蛋白濃度組,設(shè)定低中高濃度三個(gè)濃度組。濃度分別為25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml,腹腔注藥7天,每次20L,7天后測(cè)實(shí)體瘤體積和脾重,計(jì)算平均值,記錄數(shù)據(jù),結(jié)果如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由上表可知,蝎尾纖溶活性蛋白的脾重指數(shù)都高于陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組,說明其對(duì)小鼠的生長具有很小的毒害作用,同時(shí)在中濃度組和高濃度組的抑瘤率明顯高于陽性對(duì)照組環(huán)磷酰胺,但在低濃度組時(shí)效果不明顯。3)MTT檢測(cè)蝎毒纖溶活性蛋白對(duì)的S180作用取對(duì)數(shù)生長期S180細(xì)胞,用培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度至5X10Vml,將細(xì)胞加入96孔板,每孔加樣100i!L,將細(xì)胞放入37°C(A培養(yǎng)箱培養(yǎng)6個(gè)小時(shí),加藥,設(shè)空白對(duì)照組和陽性對(duì)照組,空白對(duì)照組加入消毒滅菌過的PBS20iiL,陽性對(duì)照組加入0.5mg/ml的順鉑20yL,設(shè)定蝎毒纖溶活性蛋白藥物濃度組為1、2、4、8、16mg/ml,培養(yǎng)24h、48h、72h,于培養(yǎng)結(jié)束前4h,各孔加入5mg/ml的MTT20yL,4h后取出,棄去上清液,各孔加入DMS0100yL,震蕩5min,使紫色結(jié)晶物溶解,離心,在酶標(biāo)儀中測(cè)定490nm處的OD值,結(jié)果如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(*P<0.1,**P<0.05)由上表可以看出24h時(shí)16mg/ml的纖溶活性蛋白的抑瘤率與陽性對(duì)照組相近,隨著濃度的降低抑瘤率慢慢下降,48h時(shí)纖溶活性蛋白的抑瘤率隨著濃度的降低也在逐漸降低,72h使抑瘤率達(dá)到最大,高濃度組達(dá)到56%左右,與陽性對(duì)照組相近。因此,實(shí)施例3可以證明蝎尾纖溶活性蛋白具有抗腫瘤作用。權(quán)利要求一種來自蝎尾的纖溶活性蛋白,其分子量為37.69kD。2.權(quán)利要求1所述的纖溶活性蛋白的制備方法,其特征在于如下步驟1)將蝎尾洗凈,磨碎,加入磷酸鈉緩沖液,4t:浸提過夜;2)離心去沉淀,分段鹽析,取40%_70%部分;3)最后進(jìn)行二乙氨基乙基-32纖維素離子交換層析柱純化,用Tris-HCl緩沖液洗脫,收集活性蛋白峰,濃縮,凍干。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的纖溶活性蛋白的制備方法,其特征在于所述步驟1)中緩沖液是pH7.2濃度為0.02mol/L的磷酸鈉溶液,蝎尾重量與磷酸鈉緩沖液體積之比為1:5。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的纖溶活性蛋白的制備方法,其特征在于所述步驟2)中分段鹽析是,在上清液中加固體硫酸銨達(dá)40%飽和度,8500轉(zhuǎn)/分,4t:離心泵中離心,收集上清液;再加入固體硫酸銨達(dá)70%飽和度,8500轉(zhuǎn)/分,4"C離心泵中離心,收集沉淀。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的纖溶活性蛋白的制備方法,其特征在于所述步驟3)中洗脫緩沖液是含有l(wèi)mol/L氯化鈉的0.02mol/LpH8.0的三羥甲基氨基甲烷_鹽酸。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的纖溶活性蛋白的制備方法,其特征在于所述步驟3)中對(duì)纖溶組分濃縮是指超濾濃縮而且濃縮之前要用透析袋進(jìn)行除鹽,凍干是指冷風(fēng)吹干或冷凍干燥。7.含有權(quán)利要求1所述纖溶活性蛋白的抗腫瘤藥物組合物。8.權(quán)利要求1所述的纖溶活性蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種來自蝎尾的纖溶活性蛋白及其制備方法和應(yīng)用,本發(fā)明的一種來自蝎尾的分子量為37.69kD纖溶活性蛋白其制備方法是將蝎尾洗凈,磨碎,加入磷酸鈉緩沖液,4℃浸提過夜;離心去沉淀,分段鹽析,取40%-70%部分;最后進(jìn)行二乙氨基乙基-32纖維素離子交換層析柱純化,用Tris-HCl緩沖液洗脫,收集活性蛋白峰,濃縮,凍干;本發(fā)明的纖溶活性蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用;發(fā)明涉及的纖溶活性蛋白是蝎尾中的一種單組分蛋白,易于純化和批量制備,并且纖溶活性強(qiáng),比活高,無毒性;分子量小、抗原反應(yīng)低,是理想的抗腫瘤藥物。文檔編號(hào)A61P35/00GK101709083SQ200910194210公開日2010年5月19日申請(qǐng)日期2009年11月27日優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日發(fā)明者丁鴻,譚竹鈞,陳雅雄,韓雅莉,黃錦兵申請(qǐng)人:廣東工業(yè)大學(xué)