專利名稱：一種建立慢性阻塞性肺疾病疊加哮喘模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學領(lǐng)域，涉及呼吸系統(tǒng)疾病實驗模型，具體涉及一種建立慢性阻 塞性肺疾病(COPD)疊加哮喘模型的方法
背景技術(shù)：
臨床醫(yī)學中，將支氣管哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)分屬呼吸系統(tǒng)不同的常 見疾病，均具有氣道炎癥的特點，但有時二者之間的界限不很明顯，特別是吸煙的哮喘患者 或者是重度發(fā)作的COPD患者，都兼有哮喘和COPD的病理生理特征，其發(fā)病機制、病理生理 變得更加復雜，從而給臨床防治帶來挑戰(zhàn)，另有研究表明，哮喘和COPD等氣道炎癥性疾病， 均存在HPA軸等機體應激系統(tǒng)的變化，但結(jié)論往往前后不一或自相矛盾，因此建立相關(guān)的 動物模型并探討其發(fā)病機制對臨床COPD合并哮喘的防治具有重大意義。至今為止，國內(nèi)外 尚未見有相應的動物模型的建立方法及相關(guān)的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種呼吸系統(tǒng)疾病實驗模型，尤其涉及一種建立慢性阻塞 性肺疾病(COPD)疊加哮喘模型的方法。本發(fā)明針對COPD合并哮喘這一臨床上常見疾病狀態(tài)，提供用于一種用于基礎研 究的動物模型的建立方法，并評價其可靠性。本發(fā)明按時間順序，采用內(nèi)毒素并熏煙與卵 蛋白致敏激發(fā)相結(jié)合的方法，從肺組織病理、氣道反應性、血清中細胞因子以及下丘腦-垂 體_腎上腺軸等方面評價該模型的可靠性，并與單純的慢性阻塞性肺疾病和哮喘大鼠模型 進行對比觀察分析。具體而言，本發(fā)明方法建立慢性阻塞性肺疾病(COPD)疊加哮喘模型的方法，其特 征在于，其包括下述步驟1)制備哮喘模型，以含卵蛋白加氫氧化鋁凝膠混合液誘發(fā)哮喘；2)制備慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型；內(nèi)毒素加熏煙誘發(fā)慢阻肺；3)制備COPD+哮喘模型；內(nèi)毒素并熏煙與卵蛋白致敏激發(fā)COPD+哮喘；4)氣道高反應性的測定；5)血清細胞因子及皮質(zhì)酮(CORT)檢測；6)下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)mRNA檢測；7)促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)檢測。結(jié)果證實，本發(fā)明方法所建立的實驗動物模型兼有慢性阻塞性肺疾病(COPD)和 哮喘的特征性改變，并出現(xiàn)特征性病理生理改變的弱化或強化的現(xiàn)象，具有可靠性、重復性 好，符合人類慢性阻塞性肺疾病(COPD)合并哮喘的疾病病理生理特點等，該模型可用于慢性阻塞性肺疾病(COPD)合并哮喘致病機制、預防和治療以及藥物篩選等的研究。


圖1是正常對照組肺組織病理圖(20*2)。圖2是哮喘模型組肺組織病理圖(20*2)。圖3是圖3C0PD模型組肺組織病理圖(20*2)。圖4是COPD+哮喘模型組肺組織病理圖(20*2)。圖5是實驗氣道阻力變化曲線圖。
具體實施方案實施例1實驗動物采用健康清潔級雄性BN大鼠，體重180 220g，購自北京維通利華實 驗動物技術(shù)公司。動物飼養(yǎng)于上海復旦大學實驗動物中心，飼養(yǎng)條件清潔級，光照時間固 定，水、食物自由攝取。主要試劑及儀器卵蛋白(上海麗珠東風生物技術(shù)有限公司)；氫氧化鋁凝膠 (Sigma. Co.)；戊巴比妥鈉(上海化學試劑公司，進口分裝)；IL-4、5、6、8試劑盒、IFN-γ 試劑盒、TNF-α試劑盒(Biosource進口分裝)；皮質(zhì)酮試劑盒(R&D公司)；ACTH放免試劑 盒(第二軍醫(yī)大學神經(jīng)生物學研究所)；SN-695B型智能放免、測量儀(上海原子核研究 所朗日環(huán)儀器一廠)；DL-8R冷凍離心機(上海離心機械研究所)；FeroTec GradienPCR基 因擴增儀(杭州大和熱磁電子有限公司)；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(上海琪特分析儀器 有限公司)；H6-1微型電泳槽(上海精益有機玻璃制品儀器廠)；倒置顯微鏡(Leica德國 萊卡)；YS9801型醫(yī)用超聲霧化器(上海億圣科技有限公司)；小型動物呼吸機(上海奧 爾科特生物科技有限公司)；Powerlab生理記錄儀(ADInstruments埃德儀器有限公司)； Rotor-Gene3000Real time PCRft (Corbett Research)；弓LiSi十(Primer Premier 5.0)；動物誘喘裝置不完全封閉有機玻璃箱，28X15X13cm3，箱體一端為通氣孔，另一端 連接超聲霧化器；動物熏煙裝置完全封閉式木箱，60X80X 100cm3。制備模型(1)制備哮喘模型第一天給與含卵蛋白IOOmg加氫氧化鋁凝膠混合液1ml，第15天時，以5%的卵蛋 白生理鹽水溶液5L/min霧化吸入20分鐘誘發(fā)哮喘發(fā)作，每天1次，連續(xù)7天，停止霧化7 天后，再連續(xù)激發(fā)7天；對照組以生理鹽水代替OVA。(2)制備 COPD 模型第1、14天氣管內(nèi)給與內(nèi)毒素0. 2ml(200ug/200ml)，第2 13天、15 28天每日 上午在木箱內(nèi)熏煙(香梅牌過濾嘴香煙)，每次12支，一天兩次，共24支，40min。(3)制備COPD+哮喘模型第1天用IOOmg卵蛋白加氫氧化鋁凝膠Iml的混懸液按常規(guī)方法致敏，第7天氣管 內(nèi)給與內(nèi)毒素(LPS) 0. 2ml (200ug/200ml)，第8天開始熏煙，24支/天，分兩次，每次12支， 40min/每日上午。第14天用濃度為5%的卵蛋白生理鹽水溶液進行霧化激發(fā)，每天1次， 連續(xù)7天，停止激發(fā)7天之后，再激發(fā)7天。霧化期間熏煙不停止，先霧化后熏煙。第21天氣管內(nèi)給與內(nèi)毒素，大鼠出現(xiàn)心跳加快，呼吸急促癥狀，判斷給藥成功；造模時間共五周。動物行為學觀察，結(jié)果顯示哮喘模型組大鼠吸入卵蛋白霧化后出現(xiàn)打噴嚏、咳嗽、呼吸急促、張口呼吸、弓背 滯伏，反復發(fā)作出現(xiàn)毛色干枯，體重增長緩慢；COPD模型組咳嗽，呼吸短促，拱背蜷縮，皮膚松弛，食量減少，行動遲緩，毛色更 為干枯，個體瘦小。COPD+哮喘模型組一般狀況最差，咳嗽，呼吸急促，喉中有哮鳴聲，分泌物增多， 食量減少，毛枯易脫、蜷臥少動，毛色干枯，個體更顯瘦小。檢測肺組織切片觀察病理學改變常規(guī)制作實驗動物肺組織病理切片，HE染色后光鏡下觀察淋巴細胞計數(shù)、嗜酸粒 細胞計數(shù)、支氣管及肺泡腔內(nèi)滲出、支氣管粘膜下水腫、支氣管平滑肌增生等。結(jié)果顯示；與對照組相比，哮喘模型組大氣道炎癥改變明顯，支氣管腔內(nèi)滲出增多，支氣管壁 及支氣管周圍組織中有明顯增多的炎性細胞，特別是嗜酸粒細胞的浸潤同時伴有支氣管粘 膜下水腫和平滑肌增生(見圖2)；與對照組相比，COPD模型組肺實質(zhì)有炎癥改變，支氣管腔內(nèi)炎性滲出增多，以中性 粒細胞、淋巴細胞浸潤為主，同時伴有支氣管壁平滑肌增生等(見圖3)；COPD+哮喘模型組與COPD模型組有相似之處，但是伴有明顯的嗜酸粒細胞浸潤， 病變范圍更加彌漫(見圖4)。測定氣道高反應性變化觀察不同劑量乙酰甲膽堿(Mch) 0. 125,0. 25,0.5,1.0,2. Omg/kg,每次間隔4分 鐘，激發(fā)后大鼠的氣道阻力、潮氣量變化情況。結(jié)果顯示，以氣道阻力(Raw)為觀測指標，與對照組相比，哮喘模型組、COPD模型 組、COPD+哮喘模型組BN大鼠Raw均顯著升高(P < 0. 05)，且哮喘模型組大鼠升高最明顯， 其次為COPD+哮喘模型組。隨著乙酰甲膽堿濃度(Mch)的增加，對照組的氣道阻力沒有明 顯變化；Mch注射濃度最低時，COPD組的氣道阻力最大，但隨著Mch濃度增加，Raw沒有明顯 變化；COPD+哮喘與哮喘組變化趨勢相似，隨著Mch濃度的增加氣道阻力相應增大，但COPD+ 哮喘組的氣道阻力變化比哮喘組變化略輕(見圖5)。表1是BN大鼠模型組與對照組Mch氣道反應性比較。表 權(quán)利要求
1.一種建立慢性阻塞性肺疾病疊加哮喘模型的方法，其特征在于，采用內(nèi)毒素并熏 煙與卵蛋白致敏和激發(fā)相結(jié)合，建立慢性阻塞性肺疾病疊加哮喘實驗模型，其包括下述步 驟1)制備哮喘模型，以含卵蛋白加氫氧化鋁凝膠混合液誘發(fā)哮喘；2)制備慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型；內(nèi)毒素加熏煙誘發(fā)慢阻肺；3)制備慢性阻塞性肺疾病+哮喘模型；內(nèi)毒素并熏煙與卵蛋白致敏激發(fā)慢性阻塞性肺疾病+哮喘；4)氣道高反應性的測定；5)血清細胞因子及皮質(zhì)酮檢測；6)下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素mRNA檢測；7)促腎上腺皮質(zhì)激素檢測。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，第一天給與含卵蛋白加氫氧 化鋁凝膠混合液后，第15天時給與卵蛋白水溶液霧化吸入誘發(fā)哮喘。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中，給與內(nèi)毒素的時間為第1、 14天，給與熏煙的時間為第2 13天、15 28天。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中，給與內(nèi)毒素并熏煙與卵蛋白 致敏和氣管激發(fā)的時間先后順序為第1天用卵蛋白加氫氧化鋁凝膠混懸液致敏，第7天給與內(nèi)毒素，第8天熏煙，第14天 用卵蛋白水溶液霧化激發(fā)，每天1次，連續(xù)7天，停止激發(fā)7天之后，再激發(fā)7天。
5.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的慢性阻塞性肺疾病疊加哮喘模型具 有如下特征其肺組織切片有明顯嗜酸粒細胞浸潤，病變范圍彌漫；其氣道高反應性變化 為氣道阻力顯著升高；其血清細胞因子及皮質(zhì)酮、下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素及 促腎上腺皮質(zhì)激素兼有慢性阻塞性肺疾病和哮喘的特征性改變。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)學領(lǐng)域，涉及一種建立慢性阻塞性肺疾病疊加哮喘模型的方法，本發(fā)明采用氣管內(nèi)滴注內(nèi)毒素并熏煙與卵蛋白致敏激發(fā)相結(jié)合的方法，從肺組織病理、氣道反應性、血清中細胞因子以及下丘腦-垂體-腎上腺軸等方面評價其可靠性，并與單純的慢性阻塞性肺疾病或哮喘模型比較，結(jié)果證實，而該模型兼有慢性阻塞性肺疾病和哮喘的特征性改變，并出現(xiàn)特征性病理生理改變的弱化或強化，具有制作簡單、可靠性、重復性好，符合人類慢性阻塞性肺疾病合并哮喘的疾病病理生理特點，可用于慢性阻塞性肺疾病合并哮喘致病機制、防治等的研究。
文檔編號A61K31/739GK101991842SQ200910194630
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月26日
發(fā)明者劉寶君, 吳金峰, 崔焱, 徐長青, 曹玉雪, 董競成, 蔡萃 申請人:復旦大學附屬華山醫(yī)院