專利名稱：β-干擾素在制藥中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種β -干擾素的醫(yī)藥用途，尤其涉及一種β -干擾素作為一種藥物 在免疫干預(yù)和治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RheumatoidArthritis-RA)屬于一種病因未明的以侵犯四肢關(guān)節(jié)
為主的自身免疫病，其發(fā)病率高達(dá)0.4%-1%。目前治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的傳統(tǒng)藥物分 為四大類；非甾體抗炎藥(NSAIDs)、改善病情的抗風(fēng)濕藥(DMARDs)、糖皮質(zhì)激素和 植物藥。糖皮質(zhì)激素是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的傳統(tǒng)藥物，由于嚴(yán)重的副作用和停藥后反 跳，限制了其廣泛應(yīng)用。改善病情的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物(DMARDs)對于控制病情， 減少或滯緩軟骨和骨的破壞都非常有利，目前認(rèn)為應(yīng)在臨床上盡早使用。這類藥物除了 傳統(tǒng)的細(xì)胞毒類例如MTX、AZA, CTX等外，免疫抑制劑(來氟米特、環(huán)孢素A等)、 柳氮磺胺吡啶、抗瘧藥(羥氯喹)都被廣泛使用。但是該類藥物在臨床劑量稍大、療程 稍長時均出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，臨床治療中也受到很大限制。因此，同其它自身免疫病 一樣，目前仍限于用激素或非甾體類藥物姑息治療為主。已有證據(jù)表明RA可能是以免疫紊亂為主的一種自身免疫性疾病，如遺傳 因素、內(nèi)分泌因素，尤其是病毒感染與其發(fā)病密切關(guān)聯(lián)。一種同時具有免疫調(diào)節(jié)和抗 病毒雙重功能的藥物將能更有利于RA治療。在動物模型和在多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis, MS)中的應(yīng)用證明IFN-β可以抑制MS患者自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的增殖、 抑制CD8+T細(xì)胞、調(diào)控細(xì)胞因子產(chǎn)生(IL-10和IL-12)等。目前認(rèn)為，促炎癥的Thl 細(xì)胞因子和抗炎癥的Th2細(xì)胞因子之間的平衡與自身免疫病的發(fā)病過程存在著密切的關(guān) 聯(lián)。在應(yīng)用IFN-β治療MS患者過程中發(fā)現(xiàn)IFN-β具有調(diào)節(jié)趨化因子的產(chǎn)生，降低其 濃度梯度和T細(xì)胞受體CCR5表達(dá)而抑制炎性T細(xì)胞從外周向大腦中樞(CNS)遷移。在 體外，還發(fā)現(xiàn)IFN-β還可以抑制MS關(guān)聯(lián)的HHV-6/EBV等病毒的復(fù)制，發(fā)揮其抗病毒 的生物學(xué)效應(yīng)，并明顯減少RR-MS患者復(fù)發(fā)期HHV-6/EBV病毒的復(fù)制。經(jīng)過IFN-β 治療的MS患者其血清中特異的抗HHV-6/EBV的IgM抗體(可以作為病毒擴(kuò)增的指標(biāo)) 含量也有相應(yīng)的下降。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種干擾素的用途，在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中的應(yīng)用。本發(fā)明將β-干擾素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行一周以上的免疫干預(yù)后，患者 體內(nèi)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)的免疫應(yīng)答物質(zhì)，如T淋巴細(xì)胞抗原受體、自身反應(yīng)性 CD3+T細(xì)胞增殖、血清中的基質(zhì)金屬蛋白酶和滑液中的核因子κ B受體活化因子配體的 水平均顯著下降，能作為一種藥物用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。β-干擾素還可用于抑制T淋巴細(xì)胞抗原受體、CD3+T細(xì)胞增殖、血清中的基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)和滑液中的核因子κ B受體活化因子配體的表達(dá)。對滑液(Synovial Fluid)中細(xì)胞因子IL-17、IL-10禾Π IFN-Y下降亦有作用。正常人外周血T淋巴細(xì)胞95%的T淋巴細(xì)胞抗原受體(Τ cell receptor, TCR)由 α和β兩條多肽鏈組成。β -鏈可變區(qū)(TCR BV)可分為保守性基因家族TCR BVl、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、24 和 25。與正常人相比，RA患者體內(nèi)的自身反應(yīng)性CD3+T細(xì)胞普遍含量較高。測定自 身反應(yīng)性CD3+T細(xì)胞增殖水平也直接反應(yīng)藥物的效用?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases，MMP)屬鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，能 夠降解一種或幾種細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix, ECM)。它與多種疾病如心血管
病和腫瘤等有關(guān)。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，MMP-3是導(dǎo)致軟骨降解的最重要的蛋白酶，是系 統(tǒng)性的炎癥標(biāo)志物，可作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜損傷和預(yù)后的主要指標(biāo)之一。核因子K B 受體活化因子配體(Receptor Activator of NF- κ B Ligand, RANKL)， 也稱為骨保護(hù)素受體(Osteoprotegerin Ligand, 0PGL)，它主要表達(dá)于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞 表面，是參與破骨細(xì)胞分化、激活、存活和淋巴結(jié)形成的主要介質(zhì)。近年來對RA軟骨 和骨破壞的研究證實(shí)了骨骼和免疫系統(tǒng)的相互作用的重要性。同時對免疫缺陷動物模型 進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，RANKL在RA骨破壞中發(fā)揮了重要作用。本發(fā)明使用定量PCR檢測TCR BV，方法簡述如下TCR BV 基因和 BC 基因的引物設(shè)計使用 Applied Biosystems 的 Prime Exoress 2.0軟件，序列參見附表1。TCRBV基因表達(dá)采用real-time PCR方法，內(nèi)參用TCRBC
基因，同時不加模板為陰性對照。每反應(yīng)用0.5 μ IcDNA樣本，分別后25對BV特異 性引物和1對BC引物混合，引物終濃度為O.lmM，再各加2XSYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)至反應(yīng)終體積為10 μ 1，加入384孔PCR反應(yīng)板，按50°C 2分鐘 —95 0C 10 分鐘一95 0C 15 秒一60 °C 1 分鐘(40 個循環(huán))，在 ABI 7900 Sequence Detection System中進(jìn)行反應(yīng)。然后根據(jù)PCR反應(yīng)信號強(qiáng)度Ct值計算每個樣本的TCRBV基因相 對表達(dá)量TCRBVn(%) =[2-(BVnQ-BCQ)X100/Z(2-(BV1-25Q-BCQ)X100)]X100，其中 Ct 為 循環(huán)次數(shù)。表1用于RA患者TCRBV/C分析的RT-PCR弓丨物對基因_前引物5’端一3’端_后引物5，端一3’端_
BVlAAGCACCTGATCACAGCAACTTAGTTCAGAGTGCAAGTCAGG
BV2GGTTATCTGTAAGAGTGGAACCTAGGATGGGCACTGGTCACTGT
BV3TCGAGA TATCTAGTCAAAAGGACGGGTGCTGGCGGACTCCAGAAT
BV4AAGCAGGGATATCTGTCAACGTTTCAGGGCTCATGTTGCTCAC
BV5GATCAAAACGAGAGGACAGCAAGCACCAAGGCGCTCACATTCA
BV6CTCAGGTGTGATCCAATTTCACCCCCGCTCTGTGCGCTGGAT
BV7CATGGGAATGACAAATAAGAAGTCTTGGCTGCAGGGCGTGTAGGTG
BV8CCCCGCCATGAGGTGACAGAGGAGTCCCTGGGTTCTGAGGGC
BV9CCAAAATACCTGGTCACACAGCCAGGGAATTGATGTGAAGATT
BVlOACCTAGACTTCTGGTCAAAGCAGGACTGGATCTCCAAGGTACA
BVllTTATAGGGACAGGAAAGAAGATCATGTG AGGGCCTGGC AGACTC
BVl 2CAAGACACAAGATCACAGAGACAGGCAGCAGACTCCAGAGTGAG
B V3TGAAGACAGGACAGAGCATGACACACAGATGTCTGGGA GGGAGC
BV14ACCCAAGATACCTCATCACAGTGAGAGGTCTGGTTGGGGCTGGG
BVl 5TCAC AAAGAC AGG AA AGAGG ATTGGGG ATGGC AGACTCTAGGG A
BV16GTTCCCCAGCCACAGCGTAATACAGTTCTGCAGGCTGCACCTT
BV17GTCCCCAAAGTACCTGTTCAGAAGCTGTCGGGTTCTTTTGGGC
BV18AGACACCTGGTCAGG.AGGAGGTGCCGAATCTCCTCGC ACTAC
BV19CCAGGACATTTGGTCAA AGGAAA ACAGTGCCGTGTCTCCCGGTTC
BV20GACCCTGGTGCAGCCTGTGGAGGAGGAGCTTCTTAGAACT
BV21CCCAGA TA TAAGATTACAGAGAAACTGGATCTTGAGAGTGGAGTC
BV22CACAGA TGGGACAGGAAGTGA TCGTCCTCCAGCTTTGTGGACCG
BV23AAGAGGGAAACAGCCACTCTGCAGCTCCAAGGAGCTCATGTT
BV24CCAAGA TACCAGGTTACCCAGTTTCAGGCCTGGTGAGCGGATGTC
BV25AAAACATCTTGTCAGAGGGGAATGAATCCTCAAGCTTCGTAGC
TCRBC CAGCGCCCTTGTGTTGATG_AAGCGCTGGCAAAAGAAGAA本發(fā)明中自身 反應(yīng)性CD3+T細(xì)胞分離使用美國Miltenyi Biotec, MACS 磁珠分
選試劑盒及其操作說明進(jìn)行。
本發(fā)明按照R&D公司Quantikine 提供的夾心法ELISA試劑盒的操作說明，檢 測標(biāo)本血清和滑液中IL-10、IL-17和IFN- Y的水平。本發(fā)明按照R&A公司Quantikine 提供的夾心法ELISA試劑盒的操作說明，檢 測標(biāo)本血清和滑液中MMP-3水平。本發(fā)明按照Apotech公司提供的雙抗體夾心法ELISA試劑盒的操作說明，檢測標(biāo) 本血清和滑液中可溶的RANKL水平。本發(fā)明血清、滑膜液、滑膜液細(xì)胞、外周血單個核細(xì)胞和滑膜組織制備方法如 下 血清(Serum)制備患者靜脈血2ml，5000rpm離心20分鐘，吸取血清置
eppendorf管中，-80°C保存，待測細(xì)胞因子?；ひ?SF)制備無菌穿刺抽取SF (無血液污染)，置于肝素抗凝管中。吸取 約1毫升于epppendorf管中，離心去細(xì)胞后置_80°C保存，待測細(xì)胞因子之用。滑膜液細(xì)胞(SFC)制備無菌穿刺抽取SF(無血液污染)，置于肝素抗凝管 中。用 RPMI-1640 (Invitrogen, GIBCO )稀釋 3-4 倍后，置于 Ficoll(Axis-shield， Lymphoprep )上，2500rpm離心20分鐘，吸出SFC，用RPMI-1640洗滌兩次，計數(shù)備 用。外周血單個核細(xì)胞(PBMC)制備20毫升置肝素抗凝血用RPMI-1640稀釋2_3 倍后，置于Ficoll-Hp上，2500rpm離心20分鐘分離獲PBMC。用RPMI-1640洗滌兩
次，計數(shù)備用?；そM織(SMT)制備滑膜組織于層流室中無菌去除非滑膜組織(無脂肪 組織)，在平皿中用無菌RPMI-1640充分洗滌并剪成數(shù)小快，放置于epppendorf管 中，-80°C保存。本發(fā)明自身反應(yīng)性CD3+T細(xì)胞增殖的方法如下自身反應(yīng)性CD3+T細(xì)胞種于96孔圓底平板，密度為1 X 105Cells/well，將經(jīng)磁珠 分選后的非CD3+T細(xì)胞輻照，作為APC(CD3+T APC = 2 1)。將各種合成的偶聯(lián)肽 (見表2)按照終濃度為40 μ g/ml加入培養(yǎng)體系中，并加入微量IL-2。放置在37°C 5% CO2孵育箱培養(yǎng)7天。經(jīng)抗原肽刺激7天前16-18小時，每孔加入1 μ Ci的[3H]_TdR。 收集細(xì)胞，經(jīng)β液閃儀檢測[3H]-TdR摻入的CPM值。本發(fā)明外周血單個核細(xì)胞增殖的方法如下將PBMC細(xì)胞種于96孔圓底平板，濃度為1 X 105Cells/well。將各種合成的偶聯(lián) 肽(見表2)按照終濃度為40 μ g/ml加入培養(yǎng)體系中，并加入微量IL-2。放置在37°C5% CO2孵育箱培養(yǎng)7天。經(jīng)抗原肽刺激7天前16-18小時，每孔加入1 μ Ci的[3H]_TdR。 收集細(xì)胞，經(jīng)β液閃儀上檢測[3H]-TdR摻入的CPM值。表2用于CD3+T細(xì)胞和PBMC細(xì)胞增殖的偶聯(lián)肽
權(quán)利要求
1.一種β-干擾素在制備治療類風(fēng)濕疾病藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干擾素的用途，其特征是所述的類風(fēng)濕疾病為類風(fēng)濕關(guān) 節(jié)炎。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的β-干擾素的用途，其特征是所述的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物 是抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者病灶滑液中的核因子κ B受體活化因子配體藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的β-干擾素的用途，其特征是所述的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物 是抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者病灶T淋巴細(xì)胞抗原受體寡克隆擴(kuò)增藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的β-干擾素的用途，其特征是所述的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物 是抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者病灶自身反應(yīng)性CD3+T細(xì)胞增殖藥物。
全文摘要
一種β-干擾素在制藥中的用途。經(jīng)β-干擾素免疫干預(yù)后，與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病密切相關(guān)的免疫學(xué)效應(yīng)物質(zhì)如T淋巴細(xì)胞抗原受體、自身反應(yīng)性CD3+T細(xì)胞增殖、基質(zhì)金屬蛋白酶和核因子κB受體活化因子配體在患者的血清和病灶滑液中的水平顯著下降。從而表明，β-干擾素可用于免疫干預(yù)和治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
文檔編號A61P19/02GK102008716SQ20091019524
公開日2011年4月13日 申請日期2009年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月7日
發(fā)明者何東儀, 余奇文, 張冬青, 張繼英, 沈杰, 程偉志, 肖漣波, 胡朝英, 許榮, 錢柳, 陳雪華, 黃秋愉 申請人:上海市免疫學(xué)研究所, 上海市長寧區(qū)光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院