專利名稱：一種防治類風濕關(guān)節(jié)炎的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥，具體涉及一種防治類風濕關(guān)節(jié)炎的藥物組合物。
背景技術(shù)：
類風濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性 全身性自身免疫性自身免疫性疾病。滑膜炎持久反復發(fā)作，可導致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨和骨的破 壞，關(guān)節(jié)功能障礙，甚至殘廢。它是一種病因尚未明了的慢性全身性炎癥性疾病，以慢性、 對稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，屬于自身免疫炎性疾病。常發(fā)于 手、腕、足等小關(guān)節(jié)，易反復發(fā)作，呈對稱分布。早期有關(guān)節(jié)紅腫熱痛和功能障礙，晚期關(guān) 節(jié)可出現(xiàn)不同程度的僵硬畸形，并伴有骨和骨骼肌的萎縮，極易致殘。從病理改變的角度 來看，類風濕性關(guān)節(jié)炎是一種主要累及關(guān)節(jié)滑膜(以后可波及到關(guān)節(jié)軟骨、骨組織、關(guān)節(jié) 韌帶和肌鍵)，其次為漿膜、心、肺及眼等結(jié)締組織的廣泛性炎癥性疾病。類風濕性關(guān)節(jié)炎 的全身性表現(xiàn)除關(guān)節(jié)病變外，還有發(fā)熱、疲乏無力、心包炎、皮下結(jié)節(jié)、胸膜炎、動脈炎、周 圍神經(jīng)病變等。目前，對于類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療的藥物主要分兩類一類是非甾族抗炎 藥物(麗-steroidalanti-infla,tory drugs, NSAIDs);—類是病癥緩解性抗風濕藥 (Disease-modifying antirheumatic drugs，D廳Ds) 。 NSAIDs是治療RA的首選藥物，包括 水楊酸類、傳統(tǒng)非甾族抗炎藥物及選擇性環(huán)氧化酶-2(CyClo-OXgenase-2， C0X-2)抑制劑。 病人出現(xiàn)癥狀的最初幾個星期內(nèi)用NSAIDs有非常好的療效，但NSAIDs主要作用是緩解RA 患者關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及改善關(guān)節(jié)功能，難以阻止疾病的發(fā)展，也不能防止關(guān)節(jié)的破壞，另外 對胃腸道的嚴重不良反應使其應用受到限制；DMARDs如甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)可 快速并持久的抑制炎癥，但由于毒性作用大，加之昂貴的價格限制了這些藥物在RA中的應 用。近年來研究者們從各個角度來尋找治療契機，中草藥以其低毒性、多靶點治療及廉價的 特點越來越受到重視，成為研發(fā)治療RA藥物的新熱點。 目前RA的藥物治療除了化學治療藥物，近年來有多種生物類制劑在臨床上用于 治療RA，其在療效和毒副作用方面較化學類藥物呈現(xiàn)出明顯的優(yōu)越性。有些針對TNF- a 的生物類制劑(如infliximab, etanerc印t和adalim麗b)及針對IL-1的生物類制劑 (anakinra)已應用于臨床來治療RA。其中Infliximab是一種人-鼠嵌合IgGl型抗TNF-a 單克隆抗體，它與表達TNF- a的關(guān)節(jié)組織細胞相互作用，破壞關(guān)節(jié)組織細胞并使其活性下 降，從而減輕炎癥反應和組織破壞，其臨床效果顯著。但生物類制劑這種療法所針對的任意 的一個調(diào)節(jié)途徑在正常細胞中同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用，干擾這些調(diào)節(jié)途徑對機體的固有免疫 和適應性免疫存在潛在的危害。 黃連解毒湯首載于葛洪《肘后備急方》，已有一千七百年的應用歷史。本方由黃連、 黃芩、黃柏、梔子4味中藥組成，是清熱解毒的經(jīng)典方劑，具有清熱、瀉火、解毒之功，主治實 熱火毒、三焦熱盛之證。本發(fā)明人在黃連解毒湯血清藥物化學研究的基礎(chǔ)上，經(jīng)大量試驗證 實，該藥物能較好的治療類風濕性關(guān)節(jié)炎，可明顯減輕CIA小鼠的發(fā)病嚴重程度，病灶部位 的炎癥及免疫損傷情況與對照組相比有非常明顯的改善。進一步探索黃連解毒湯的新適應癥是研究的方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于研究設計防治類風濕性關(guān)節(jié)炎藥物的藥物組合 物。 本發(fā)明提供了一種防治類風濕關(guān)節(jié)炎的藥物組合物。其中制成活性成分的中藥原 料組成為下列重量配比 本發(fā)明所述防治類風濕關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，其中制成活性成分的中藥原料組 成為下列重量配比小檗堿6. 32mg，巴馬汀O. 39mg，藥根堿1. 95mg，木蘭花堿1. 79mg，黃 柏堿0. 13mg，黃連堿0. 31mg，黃吝苷62. 50mg，黃吝素1. 72mg，漢黃吝素7. 26mg，漢黃吝苷 0. 04mg，梔子苷23. 75mg，藏紅花素0. 2mg，綠原酸0. 31mg ; 本發(fā)明所述防治類風濕關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，其中制成活性成分的中藥原料組成 為下列重量配比小檗堿5. 75mg，巴馬汀0. 35mg，藥根堿1. 75mg，木蘭花堿1. 65mg，黃柏堿 0. 15mg，黃連堿0. 25mg，黃吝苷57. 5mg，黃吝素1. 75mg，漢黃吝苷6. Omg，漢黃吝素0. 04mg， 梔子苷22. 5mg，藏紅花素0. 15mg，綠原酸0. 2757mg ; 本發(fā)明所述防治類風濕關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，其中制成活性成分的中藥原料組 成為下列重量配比小檗堿3. 79mg，巴馬汀O. 24mg，藥根堿1. 17mg，木蘭花堿1. 07mg，黃 柏堿0. 08mg，黃連堿0. 19mg，黃吝苷37. 50mg，黃吝素1. 03mg，漢黃吝素4. 35mg，漢黃吝苷 0. 02mg，梔子苷14. 25mg，藏紅花素0. lmg，綠原酸0. 18mg。 在這個藥物組合物中，小檗堿，巴馬汀，藥根堿，木蘭花堿，黃柏堿，黃連堿等生物
堿類成分和綠原酸有較好的抗菌、抗病毒及免疫調(diào)控作用，為藥物組合物的主要成分；黃
芩苷，黃芩素，漢黃芩苷和漢黃芩素等黃酮類成分有較好的抗炎、抗病毒、抗氧化、清除自由
基、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等多方面的藥理作用，可與生物堿類成分協(xié)同發(fā)揮抗炎及免疫調(diào)節(jié)功效；
梔子苷，藏紅花素具有保肝利膽及對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的等作用可保護機體免受生物堿毒性干
擾。本發(fā)明提供的防治療類風濕關(guān)節(jié)炎藥物藥物組合物，經(jīng)大量試驗證實，該藥物有較好的
治療類風濕性關(guān)節(jié)炎療效。 本發(fā)明的藥理學實驗結(jié)果如下 1、本發(fā)明所述中藥黃連解毒湯可抑制類風濕性關(guān)節(jié)炎CIA的臨床發(fā)病
在CIA的實驗中，用雞II型膠原(C II)誘導CIA模型，初次免疫為第0天，第21 天加強免疫后小鼠隨機分為6組模型組、空白對照組、陽性對照組和三組本發(fā)明所述組份 藥物1、組份藥物2、組份藥物3。于第20天開始給，陽性對照組每兩天給予甲氨喋呤藥2mg/ kg，本發(fā)明所述藥物組合物組分別給予配好的藥物50mg/kg，連續(xù)給藥14天，直到實驗結(jié) 束。每天觀察小鼠并依據(jù)評分標準給每只小鼠評分。 C II誘導CIA，加強免疫后小鼠陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病，對照組與用藥組在發(fā)病時間上沒有 明顯差異。發(fā)病后，模型組組小鼠疾病嚴重程度加重較快，在免疫后第37天達到高峰，而給 藥組小鼠發(fā)病后疾病發(fā)展較對照組小鼠緩和(圖l)。從發(fā)病率來看，模型組為95%，對照 組為66 % ，本發(fā)明組份藥物1 、 2 、 3三個劑量組分別為62 % ， 65 %和65 % 。由此可見，本發(fā)明 所述藥物組合物對CIA發(fā)病時間沒有明顯影響，但明顯抑制了 CIA的發(fā)病嚴重程度和發(fā)病 率，說明本發(fā)明所述藥物組合物對CIA具有明顯的保護作用。
2、本發(fā)明所述藥物組合物能下調(diào)脾細胞上清液中TNF- a 、 IL_17、 IFN_ Y及NO指標
在體內(nèi)給予藥物治療CIA的實驗中，疾病達到平臺期后處死小鼠，取出脾臟細胞， 制成單細胞懸液，每孔1. 5 X 106個細胞鋪板，在體外用20 g/ml的抗原C II剌激，培養(yǎng)48 小時后收集上清，用ELISA方法測量細胞因子TNF-a 、 IFN-y的濃度。
如圖2所示，雞II型膠原(CII)剌激后，模型組細胞上清中TNF-a 、IFN_Y，IL_17 及NO均高于各個藥物處理組，與陽性對照組及本發(fā)明所述藥物組相比，存在統(tǒng)計學差異(p < 0. 05)。說明體內(nèi)給予藥物治療后，能夠抑制促炎細胞因子TNF- a 、 IFN- y 、 NO和IL-17 的分泌，并能從而對CIA疾病具有保護作用。 本發(fā)明所述藥物組合物的有效成分可抑制炎性細胞因子如TNF- a 、 IFN_ Y分泌。 TNF-a和IFN-Y在RA發(fā)病機制中起著重要作用。TNF-a可直接誘導蛋白水解酶的合成， 如基質(zhì)金屬蛋白酶(匪Ps)，造成基質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞。實驗結(jié)果也表明，本發(fā)明所述藥物組合物 可大降低脾臟細胞分泌TNF- a 。用抗-TNF- a療法在治療RA上取得了良好的效果，不但阻 止了骨組織破壞而且也抑制了 IL-17的產(chǎn)生。本發(fā)明所述藥物組合物對炎癥的控制及對關(guān) 節(jié)組織的保護可能與其降低TNF-a含量有關(guān)。 IFN- Y主要由浸潤在病灶局部的CD4+T細胞分泌，它可以激活巨噬細胞，活化的巨 噬細胞隨后表達多種炎癥因子，參與并加重炎癥反應；IFN- Y還可誘導MIP-1 a 、 MIP-1 P 和IP-10的表達，這些趨化因子參與淋巴細胞向病灶遷移的過程。實驗中，本發(fā)明所述藥物 組合物在體內(nèi)明顯降低了 IFN-Y的蛋白水平，有可能與阻斷了淋巴細胞的后繼遷移有關(guān)。 有研究報道，TNF-a與IFN-Y在體外共同剌激纖維原細胞和人微血管內(nèi)皮細胞可協(xié)同誘 導趨化因子CXCLIO的產(chǎn)生，RA病人滑液中大量CXCLIO的表達導致活化Thl細胞及自然 殺傷細胞的浸潤，對組織造成損傷。本研究中，本發(fā)明所述組份藥物同時降低了 IFN-y及 TNF-a的表達。綜上所述，本發(fā)明所述組份藥物對CIA有明顯的療效，可明顯抑制CIA臨床 發(fā)病，降低炎性細胞因子TNF-a及IFN-Y的分泌，是本發(fā)明所述藥物組合物治療類風濕關(guān) 節(jié)炎的機制。 因此，本發(fā)明所述藥物組合物可以用于制備防治類風濕關(guān)節(jié)炎的藥物。所述藥物 可以是由權(quán)利要求1-4任一項所述活性成分的中藥原料與藥用輔料組成的片劑、分散片、 含片、口崩片、緩釋片、膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸、顆粒劑、注射劑、粉針劑或氣霧劑等。


圖1本發(fā)明所述組份藥物臨床評分圖 +模型組+對照組+組份藥物150mg/kg^^組份藥物250mg/kgi組份藥 物350mg/kg 圖2脾細胞上清細胞因子結(jié)果圖 圖中(l)TNF-a檢測結(jié)果(2)IL-17檢測結(jié)果(3)N0檢測結(jié)果(4) IFN-Y檢測結(jié)果 (5)增殖檢測結(jié)果；口空白組B模型組驪甲氨喋呤組H組份藥物150mg/kgB組份藥物250mg/ kg b組份藥物350mg/kg < 0. 05**P < 0. 0具體實施例方式
實施例1本發(fā)明的藥理學實驗
實驗材料
藥物與試劑 雞II型膠原(C II) :Chondrex， Redmond, WA 98052， USA;不完全弗氏完全佐 劑(IFA)Difco Laboratories, Detroit, MI ;磷酸緩沖鹽溶液(PBS):由本實驗室自行配 制，在800ml蒸餾水中溶解8gNaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HP04和0. 24g KH2P04。用鹽酸調(diào) PH至7. 4，加水定容至1L，過濾除菌后使用；二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMS0)，
為Sigma公司產(chǎn)品；1640培養(yǎng)基吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；小牛血清民海生物有限
公司；96孔平底板，CORNING公司；70 ii m細胞研磨濾網(wǎng)，BD Falcon公司；15ml、50ml離 心管，BD Falcon公司；0. 22iim濾器，Millipore公司；lml旋口注射器，BD公司；貝朗三 通，德國貝朗公司；甲氨喋呤片上海醫(yī)藥(集團)有限公司信誼制藥總廠(080605);本 發(fā)明所述藥物組合物1 :小檗堿6. 32mg，巴馬汀0. 39mg，藥根堿1. 95mg，木蘭花堿1. 79mg， 黃柏堿0. 13mg，黃連堿0. 31mg，黃吝苷62. 50mg，黃吝素1. 72mg，漢黃吝素7. 26mg，漢黃吝 苷0. 04mg，梔子苷23. 75mg，藏紅花素0. 2mg，綠原酸0. 31mg ;本發(fā)明所述藥物組合物2 : 小檗堿5. 75mg，巴馬汀0. 35mg，藥根堿1. 75mg，木蘭花堿1. 65mg，黃柏堿0. 15mg，黃連堿 0. 25mg，黃吝苷57. 5mg，黃吝素1. 75mg，漢黃吝苷6. 0mg，漢黃吝素0. 04mg，梔子苷22. 5mg， 藏紅花素O. 15mg，綠原酸0. 2757mg;本發(fā)明所述藥物組合物3 :小檗堿3. 79mg，巴馬汀 0. 24mg，藥根堿1. 17mg，木蘭花堿1. 07mg，黃柏堿0. 08mg，黃連堿0. 19mg，黃吝苷37. 50mg， 黃吝素1. 03mg，漢黃吝素4. 35mg，漢黃吝苷0. 02mg，梔子苷14. 25mg，藏紅花素0. lmg，綠原 酸O. 18mg。
實驗動物 DBI/I型小鼠，雄性，6-8周，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證 號SCXK(滬)2007-0005，飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學實驗動物中心清潔級環(huán)境中。
儀器與設備 高速臺式離心機，E卯endorf ;高速臺式低溫離心機，HITACHI公司；倒置顯微鏡， Nikon公司；超凈臺，蘇凈集團安泰公司制造；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有 限公司；濕度C02培養(yǎng)箱，Heraus公司；恒溫水浴鍋，上海國華電器有限公司。
實驗方法
模型的建立
實驗準備 完全弗氏佐劑(CFA)的制備在不完全弗氏佐劑中加入熱滅活的結(jié)核分支桿菌至 終濃度4mg/ml ，使用之前充分混勻。 0. OIM冰乙酸制備11. 43iU冰乙酸溶于20ml去離子水中，過濾，4。C備用。 CII制備將CII溶解于0. 01M冰乙酸至終濃度4mg/ml，4。C保存。 抗原的乳化用三通管連接兩支玻璃針管，將PBS、完全弗氏佐劑和抗原CII分別
加入一支針管中(每iooia乳化液含2ooyg c n和50ia完全弗氏佐劑)，排除針管內(nèi)
氣泡后，來回推動針管約500次，將針管內(nèi)各成分充分混勻成乳化狀態(tài)。
CIA模型的誘導 第0天，小鼠尾根部2-3厘米處給予100iU/只乳化好的C II抗原皮下注射免疫； 第21天，加強免疫50 iU C II和150 ii 1 PBS充分混勻，150u1/只腹腔注射；正常組用生理鹽水同法注射。 實驗分組和給藥方案 大鼠隨機分為6組，每組12只，分別為正常組、CIA模型組、陽性對照組(甲氨喋呤2mg/kg)、給藥組(藥物組合物1、藥物組合物2、藥物組合物3，其給藥劑量均為50mg/kg)。于二次免疫前一天(第20天)至第34天給藥組分別連續(xù)灌胃給藥，甲氨喋呤組每兩天給藥一次，正常組和模型組給予等量的飲用水。
多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index, AI)評分 二次免疫后，定期記錄小鼠全身關(guān)節(jié)病變情況，按3級評分法評價，計算發(fā)病率及平均發(fā)病指數(shù)。具體評分標準為0分_關(guān)節(jié)正常；1分_關(guān)節(jié)輕微紅腫；2分_關(guān)節(jié)紅腫嚴重，累及整個關(guān)節(jié)，活動受限；3分-爪子或關(guān)節(jié)功能障礙，關(guān)節(jié)僵硬。四肢的總和為小鼠的評分，最高為12分。 淋巴及脾臟單個核細胞(MNC)懸液的制備 小鼠處死，固定，剪開腹部皮膚，取兩側(cè)腹股溝淋巴結(jié)；后打開腹腔，取出脾臟，立即放入裝有1640培養(yǎng)基的15ml離心管中，置于冰上；將脾臟倒入70iim的細胞研磨濾網(wǎng)中，用lml注射器針芯充分研磨，使之成細胞懸液；收集細胞懸液，4t:，1000rpm，離心8min，離心后棄去上清；打散細胞，加入0.83%氯化銨水(約1.0ml/脾臟)，裂解5min ;加入3倍體積的PBS終止裂解反應，并用玻璃吸管去除細胞懸液中的絮狀物；4t:，1000rpm，離心8min，離心后棄去上清；打散細胞，加入lml 1640培養(yǎng)基(含小牛血清)，混勻后計數(shù)，以1640完全培養(yǎng)基(含小牛血清)在96孔板中培養(yǎng)，5X 106/ml每孔100ul，貼壁2小時。
脾細胞NO測定 在96孔平圓底板中每孔加入5X 106/ml脾臟麗C100ul，每組4復孔；貼壁2小時后，換液DMEM培養(yǎng)基，每孔加LPS (終濃度lug/ml)，將細胞置于37°C ， 5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時后取出上清液檢測N0。
脾細胞增值測定 在96孔平圓底板中分別加入5X 106/ml脾臟及淋巴麗C100ul，每組4復孔；貼壁2小時后，加C II (飾g/ml)，將細胞置于37°C ， 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時后取出加MTS測增值。 脾細胞細胞因子測定 在96孔平圓底板中加入5X 106/ml脾臟麗C100ul，每組4復孔；貼壁2小時后，加C II (100ug/ml)，將細胞置于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后取上清液檢測細胞因子。
權(quán)利要求
一種防治療類風濕關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，其特征在于其中制成活性成分的中藥原料組成為下列重量配比小檗堿3.79-6.32mg，巴馬汀0.24-0.39mg，藥根堿1.17-1.95mg，木蘭花堿1.07-1.79mg，黃柏堿0.08-0.13mg，黃連堿0.19-0.31mg，黃芩苷37.50-62.50mg，黃芩素1.03-1.72mg，漢黃芩素4.35-7.26mg，漢黃芩苷0.02-0.04mg，梔子苷14.25-23.75mg，藏紅花素0.1-0.2mg，綠原酸0.18-0.31mg。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于其中制成活性成分的中藥原料組成為下列重量配比小檗堿6. 32mg，巴馬汀O. 39mg，藥根堿1. 95mg，木蘭花堿1.79mg，黃柏堿0. 13mg，黃連堿0. 31mg，黃吝苷62. 50mg，黃吝素1. 72mg，漢黃吝素7. 26mg，漢黃吝苷0. 04mg，梔子苷23. 75mg，藏紅花素0. 2mg，綠原酸0. 31mg。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于其中制成活性成分的中藥原料組成為下列重量配比:小檗堿5. 05mg，巴馬汀O. 32mg，藥根堿1.56mg，木蘭花堿1. 43mg，黃柏堿0. 10mg，黃連堿0. 25mg，黃吝苷50. OOmg，黃吝素1. 38mg，漢黃吝素5. 81mg，漢黃吝苷0. 03mg，梔子苷19. Omg，藏紅花素0. 13mg，綠原酸0. 25mg。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于其中制成活性成分的中藥原料組成為下列重量配比小檗堿3. 79mg，巴馬汀O. 24mg，藥根堿1. 17mg，木蘭花堿1. 07mg，黃柏堿0. 08mg，黃連堿0. 19mg，黃吝苷37. 50mg，黃吝素1. 03mg，漢黃吝素4. 35mg，漢黃吝苷0. 02mg，梔子苷14. 25mg，藏紅花素0. lmg，綠原酸0. 18mg。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l-4任一項所述藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物為由權(quán)利要求l-4任一項所述活性成分的中藥原料與藥用輔料組成的片劑、分散片、含片、口崩片、緩釋片、膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸、顆粒劑、注射劑、粉針劑或氣霧劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防治療類風濕關(guān)節(jié)炎的藥物組合物。其中制成活性成分的中藥原料組成為下列重量配比小檗堿5.5-6.0mg，巴馬汀0.3-0.4mg，藥根堿1.5-2.0mg，木蘭花堿1.5-1.8mg，黃柏堿0.1-0.2mg，黃連堿0.2-0.3mg，黃芩苷55-60mg，黃芩素1.5-2.0mg，漢黃芩昔5.0-7.0mg，漢黃芩素0.03-0.05mg，梔子苷20-25mg，藏紅花素0.1-0.2mg，綠原酸0.25-0.3mg。經(jīng)藥理學實驗結(jié)果顯示本發(fā)明所述藥物組合物可明顯減輕類風濕關(guān)節(jié)炎CIA小鼠的發(fā)病嚴重程度，病灶部位的炎癥及免疫損傷情況與對照組相比有非常明顯的改善，可用于制備防治療類風濕關(guān)節(jié)炎藥物。
文檔編號A61K31/7048GK101700249SQ20091019534
公開日2010年5月5日 申請日期2009年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月8日
發(fā)明者劉心如, 劉曉華, 單磊, 張衛(wèi)東, 徐希科, 李慧梁, 柳潤輝, 沈云亨, 竇圣姍, 蘇娟 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學