專利名稱：Gpr116基因及其編碼的受體蛋白和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的GPR116 0i protein-coupled receptor 116)GPRl 16 基因及其編碼的受體蛋白，具體地，本發(fā)明涉及一種與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)的GPR116基 因及其編碼的受體蛋白，該基因的表達(dá)載體，以及其在制備治療乳腺癌的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7% 10%，成為婦女健康的重大威脅。乳腺癌是全身性疾病，腫瘤細(xì)胞的淋巴道和血道播散導(dǎo)致 的全身轉(zhuǎn)移時乳腺癌患者治療失敗和死亡的關(guān)鍵所在。盡管近些年來對乳腺癌的生理學(xué)研 究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但是對于其發(fā)病機制和轉(zhuǎn)移機制還不甚清楚。因此發(fā)現(xiàn)與乳腺 癌有關(guān)的新基因及其表達(dá)的蛋白，無論對于進(jìn)一步深入研究乳腺癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機制，還 是由此獲得治療乳腺癌的新的靶位點都具有十分重大的意義。人表皮生長因子受體2 (HEM)基因異常擴增或過表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù) 后密切相關(guān)，已成為乳腺癌復(fù)發(fā)、患者生存期判斷的一個獨立指標(biāo)。并且已經(jīng)成功應(yīng)用于臨 床乳腺癌的治療上，赫賽停(here印tin)就是以HER2為靶標(biāo)開發(fā)的藥物，其對HER2陽性 的乳腺癌有較好的療效。和HER2相似，GPR116也是一種細(xì)胞膜表面受體，一種G蛋白偶聯(lián) 受體(GPCR)，G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)是細(xì)胞膜上常見的重要受體，具有典型的七次跨膜結(jié) 構(gòu)，是細(xì)胞信號從胞外向胞內(nèi)傳遞的重要媒介。目前世界藥物市場上有1/3的小分子藥物 是GPCR的激活劑或拮抗劑；在當(dāng)今前50種最暢銷的上市藥物中，20%屬于G蛋白受體相關(guān) 藥物；2001年世界上前50位銷售額最高的藥物中，有23個直接或間接地通過GPCR發(fā)揮藥 效。G蛋白偶聯(lián)受體已經(jīng)被證明是臨床廣泛應(yīng)用藥物的重要靶點，作用于G蛋白偶聯(lián)受體的 藥物對疼痛認(rèn)知障礙、高血壓、胃潰瘍、鼻炎、哮喘等各類疾病均具有良好的治療作用，深入 研究這類靶點的特性，可以進(jìn)一步開發(fā)出更好的新藥。腫瘤中失調(diào)基因的鑒定有助于更加準(zhǔn)確地和精確地診斷各種腫瘤，并尋找新的 治療靶標(biāo)。為了發(fā)現(xiàn)乳腺新的受體類診斷靶分子，并研制新的受體類治療藥物，本發(fā)明對 GPCR Adhesion家族的成員在乳腺癌中進(jìn)行篩選，以期找到與乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的新受 體。GPCR Adhesion家族是GPCR大家族中年輕的一員，在2000年后才被發(fā)現(xiàn)，到目前為止 關(guān)于該家族基因已發(fā)表的研究十分有限。因為這個家族的成員都具有較長的胞外段，且常 具備一些與細(xì)胞粘附有關(guān)的結(jié)構(gòu)域，故預(yù)測該家族可能會在細(xì)胞粘附過程中起到作用，將 其命名為Adhesion GPCR。人類GPR116基因定位于染色體的6pl2. 3上，其編碼了一個含 有1346個氨基酸的細(xì)胞膜受體蛋白。關(guān)于人類GPR116，到目前為止沒有一篇相關(guān)的研究 報告，可以說是一個完全嶄新又很有前景的領(lǐng)域。本發(fā)明揭示了 GPCR Adhesion家族中的 GPR116在乳腺癌中有特異性表達(dá)，并且其表達(dá)和乳腺癌的惡化程度成正相關(guān)，具有制備治 療乳腺癌的藥物或診斷乳腺癌的試劑的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是篩選并克隆出GPCR Adhesion家族中的與乳腺癌發(fā)生 和發(fā)展相關(guān)的GPR116基因及其編碼表達(dá)的受體蛋白，將其用于制備治療或預(yù)防乳腺癌疾 病中進(jìn)行藥物應(yīng)用，且將其應(yīng)用于制備診斷乳腺癌的診斷試劑，以及藥物組合物。本發(fā)明提供了 一種分離純化的GPIU16基因，該基因編碼所述GPIU16受體蛋白，且在 人類惡性乳腺癌中過表達(dá)。所述GPIU16基因具有SEQ ID NO. 1所示的多核苷酸序列。所述 多核苷酸序列還具有SEQ ID NO. 1中從核苷酸第290-4330位的核苷酸序列；或者具有與SEQ IDN0. 1中從核苷酸第290-4330位的核苷酸序列有至少70%同源性的序列；或者所述多核苷 酸序列在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第290-4330位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明所指的“分離的GPR116基因”，是指其結(jié)構(gòu)與天然存在的多核苷酸或者天 然存在的跨越3個以上獨立基因的基因組多核苷酸片段不同的多核苷酸。術(shù)語“分離的 GPR116基因”包括例如(a)具有其天然存在的生物體基因組中天然存在的基因組DNA分 子的部分序列的DNA ； (b)摻入到載體或者原核生物或真核生物基因組DNA中，從而使所產(chǎn) 生的分子與任何天然存在的載體或基因組DNA不同的多核苷酸；(c)獨立的分子例如cDNA、 基因組片段、由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備的片段或者限制性片段和(d)雜合基因，即編 碼融合多肽的基因的部分重組核苷酸序列。該定義具體排除的是存在于不同(i)DNA分子， ( )轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或(iii)細(xì)胞克隆的混合物中的DNA分子的多核苷酸；例如，存在于DNA文 庫例如cDNA或基因組DNA文庫的中的這些多核苷酸。本發(fā)明提供了一種GPR116基因編碼的GPR116受體蛋白，所述蛋白具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼GPR116蛋白或其功能等價體的，與SEQ ID NO. 1所示的多核苷酸序列雜交并至少有15%，更優(yōu)選至少25%與之互補的多核苷酸。本發(fā)明還提供了一種載體，一種用于基因過表達(dá)的質(zhì)粒載體，用經(jīng)典分子生物學(xué) 酶切連接的方法，將全長GPR116基因連入載體相應(yīng)的多克隆位點，使得該載體包含了所述 GPRl 16基因。該載體可用于在宿主細(xì)胞中維持本發(fā)明的GPR116的DNA序列。本發(fā)明還提供了一種所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、 真核細(xì)胞。原核生物如大腸桿菌BL21、Dffia菌株，真核生物如人源的鼠源細(xì)胞。本發(fā)明的用于PCR擴增GPR116全長基因的方法是經(jīng)典分子生物學(xué)PCR克隆 基因方法，見Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)本發(fā)明的用于PCR擴增GPRl 16全長基因的引物是正義鏈5，GGGGTACCTGGACAGGCCAACCAACTC3，反義鏈5，CCCTCGAGTGAGTTGAGCAACGAAGAAG3，本發(fā)明還提供一種用于檢測乳腺癌的診斷試劑，其有效成分包含與所述GPR116 基因或GPR116受體蛋白發(fā)生反應(yīng)的檢測試劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的診斷試劑包含與本發(fā)明的 多核苷酸雜交的寡核苷酸，或者可與本發(fā)明蛋白結(jié)合的抗體可以作為這些化合物來用的。 使用診斷試劑的結(jié)果，是可以通過標(biāo)準(zhǔn)臨床方法或通過檢測GPR116的異常表達(dá)水平或活 性進(jìn)行鑒定。本發(fā)明還提供一種用于診斷和治療乳腺癌的生物芯片，所述生物芯片的載體上含 有下列(i)-(iv)的序列或者它們的連續(xù)片段(i)SEQ ID N0:1所示的編碼序列；(ii)與SEQ ID NO 1中的四0-4330位核苷酸序列至少有70%同源性的序列；(iii)在中度嚴(yán)緊條 件下與SEQ IDNO :1中的四0-4330位核苷酸雜交的序列；(iv)具有與SEQ ID NO. 2所示氨 基酸序列至少70%同源性的序列。本發(fā)明的生物芯片，用獲取的GPR116基因的核苷酸序列設(shè)計引物，擴增出全長的 GPR116基因或該基因的部分片段，用作生物芯片點樣的樣品。本發(fā)明還提供所述GPR116基因或GPR116受體蛋白在制備治療或預(yù)防乳腺癌的藥 物中的應(yīng)用。本發(fā)明的藥物應(yīng)用可以通過降低GPR116基因的表達(dá)或功能進(jìn)行，可以降低其 過度表達(dá)進(jìn)行。施藥可以是全身的或局部的。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，包含與GPRl 16基因或GPRl 16受體蛋白結(jié)合反應(yīng) 的有效成分，以及一種或多種可藥用的其他載體。本發(fā)明還提供GPR116多核苷酸或GPR116 受體蛋白用作治療乳腺癌的藥物靶標(biāo)。本發(fā)明還提供了用于治療或者預(yù)防乳腺癌的藥物組合物。該藥用組合物可以是例 如抗癌藥物，還可以是包含通過本發(fā)明之篩選用于治療或預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移諸如乳腺癌轉(zhuǎn)移的 化合物的方法選擇的化合物的藥用組合物。本發(fā)明的藥用組合物或化合物的篩選獲得，是以GPR116作為靶點，將待選化合物 或組合物與表達(dá)GPR116的細(xì)胞接觸，如果待選化合物能夠激動或抑制GPR116的表達(dá)活性， 則可篩選該待選化合物或組合物作為具有針對性藥效的藥物。本發(fā)明還提供包含與小干擾RNA(SiRNA)序列結(jié)合反應(yīng)的有效成分以及一種或多 種可藥用的其他載體的藥物組合物。所述藥物組合物包含有效量地針對GPRl 16的特異的 小干擾siRNA序列，所述siRNA包含SEQ ID NO 3的核苷酸序列，可優(yōu)選地選作治療或預(yù) 防乳腺癌的靶。本發(fā)明提供的可特異有效地降低GPR116表達(dá)水平的小干擾RNA(SiRNA)序 列5，CCUU⑶⑶UCCAUAUCAUATT 3，(SEQ ID NO :3)。本發(fā)明還提供了特異有效地降低GPR116表達(dá)水平的反義多核苷酸，序列如下GTGATGCAGGTGAATATGTTTCAAGAGAACATATTCACCTGCATCAC(SEQ ID NO 4)CACTACGTCCACTTATACAAAGTTCTCTTGTATAAGTGGACGTAGTG(SEQ ID NO 5)與哺乳動物無序列同源性的對照發(fā)夾結(jié)構(gòu)反義寡聚核苷酸，序列如下GTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAAC(SEQ ID NO 6)CAAGAGGCTTGCACAGTGCAAAGTTCTCTTGCACTGTGCAAGCCTCTTG(SEQ ID NO 7)發(fā)明還提供用于構(gòu)建針對GPR116的siRNA慢病毒表達(dá)載體的人工合成寡核苷酸， 序列如下正義鏈(SEQID NO 8)TGTGATGCAGGTGAATATGTTTCAAGAGAACATATTCACCTGCATCACTTTTTTC反義鏈(SEQID NO 9)ACACTACGTCCACTTATACAAAGTTCTCTTGTATAAGTGGACGTAGTGAAAAAAGAGCT用于構(gòu)建針對與哺乳動物無序列同源性的對照siRNA慢病毒表達(dá)載體的人工合 成寡核苷酸，序列如下正義鏈(SEQID NO 10)TGTTCTCCGAACGTGTCACGT TTCAAGAGA ACGTGACACGTTCGGAGAACTTTTTTC
反義鏈(SEQID NO 11)ACAAGAGGCTTGCACAGTGCAAAGTTCTCTTGCACTGTGCAAGCCTCTTGAAAAAAGAGCT提供上述慢病毒載體及其其包裝出來的慢病毒和被該有效慢病毒成功感染的細(xì) 胞株。本發(fā)明提供針對GPR116的多克隆抗體，該抗體可以阻止GPR116的基因及其受體蛋 白的表達(dá)，從而抑制其活性。
GPRl 16基因的表達(dá)還可通過本領(lǐng)域已知的數(shù)種方式進(jìn)行抑制，包括對受試者施用 能抑制或拮抗基因表達(dá)的核酸。能破壞基因表達(dá)的反義寡核苷酸、小干擾RNA或核酶可用 于抑制基因的表達(dá)。對應(yīng)于GPR116基因核酸序列的反義寡核苷酸可用于降低GPR116基因的表達(dá)水 平。本發(fā)明之反義寡核苷酸可通過結(jié)合GPR116基因編碼的任何多肽或與其對應(yīng)的mRNA，從 而抑制基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進(jìn)mRNA的降解，和/或抑制由基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)，及最 終抑制GPR116蛋白質(zhì)的功能來起作用。通過與對衍生物無活性的適當(dāng)基礎(chǔ)材料混合，反義 寡核苷酸及其衍生物可制成外用制劑，諸如搽劑或敷劑，用于本發(fā)明中治療或預(yù)防前列腺 癌的方法。抑制過度表達(dá)基因的一種或多種基因產(chǎn)物的核酸還包括小干擾RNA(SiRNA)，它包 含編碼GPR116基因的核苷酸序列的有義鏈核酸和反義鏈核酸的組合體。將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞 的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于本發(fā)明中的治療和預(yù)防，包括以DNA為模板轉(zhuǎn)錄得到RNA的方法。siRNA 構(gòu)建成包含來自靶基因的有義序列和互補反義序列的單一轉(zhuǎn)錄本，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)。siRNA與靶 細(xì)胞中GPR116基因轉(zhuǎn)錄本的結(jié)合導(dǎo)致該細(xì)胞中GPR116蛋白質(zhì)產(chǎn)量下降。抑制過度表達(dá)基 因的一種或多種基因產(chǎn)物的核酸還包括針對過度表達(dá)基因(GPR116基因)的核酶。本發(fā)明通過將哺乳動物GPCR Adhesion家族的34個成員在六種轉(zhuǎn)移能力依次遞 增的乳腺癌細(xì)胞系中做表達(dá)水平的檢測，發(fā)現(xiàn)GPR116基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平都與乳 腺癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移能力成正相關(guān)。由于癌細(xì)胞系和真實的臨床病理情況存在很大的不同， 因此我們進(jìn)行了臨床乳腺癌標(biāo)本的檢測。通過比較M例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺癌患者的 原發(fā)癌和配對的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織，以及75例不同惡化程度的乳腺癌標(biāo)本和正常乳腺標(biāo) 本中GPR116的表達(dá)，進(jìn)一步確定GPR116與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。實驗結(jié)果表明， GPR116僅特異地在乳腺癌細(xì)胞里表達(dá)，而在癌旁組織或乳腺正常細(xì)胞中無表達(dá)，并且其表 達(dá)量和乳腺癌惡化程度成正相關(guān)。人類GPRl 16基因定位于染色體的6pl2. 3上，其編碼了一個含有1346個氨基酸的 細(xì)胞膜受體蛋白。為揭示GPR116在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起的具體作用，本發(fā)明一方面克隆了 編碼GPR116的基因，構(gòu)建了含有該基因的表達(dá)載體和含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，另一方 面確定了特異靶向干擾GPR116的小干擾RNA，構(gòu)建了 GPR116的反義核苷酸載體和對應(yīng)的干 擾慢病毒，獲得干擾慢病毒感染的穩(wěn)定細(xì)胞系。發(fā)現(xiàn)該G蛋白偶連受體可以影響乳腺癌的 發(fā)生和發(fā)展。本發(fā)明還提供了診斷或判斷乳腺癌易感性(predisposition to breast cancer) 的方法，包括測定源自患者的乳腺癌組織樣品中GPR116的表達(dá)水平。當(dāng)組織樣品中GPR116 表達(dá)水平和乳腺正常細(xì)胞對照水平相比發(fā)生上升的情形，則表明受試者還有乳腺癌或者存 在患乳腺癌的風(fēng)險。本發(fā)明還提供了評價和判斷乳腺癌惡化程度的方法，為乳腺癌病人適時個體化治療提供客觀依據(jù)，包括測定源自患者的乳腺癌組織樣品中GPR116的表達(dá)水平。當(dāng)樣品中 GPR116表達(dá)水平和乳腺正常細(xì)胞對照水平相比，超出對照水平越多，表示惡化程度越高。本發(fā)明還提供監(jiān)測乳腺癌的治療過程的方法，該方法包括將治療后采集的源自患 者的生物樣品中GPR116水平與治療前采集的源自患者的生物樣品的GPR116水平比較的步 驟，治療后GPR116表達(dá)水平降低，表明治療有效。反之，治療后GPR116表達(dá)水平上升或沒 有變化，表明治療無效。本發(fā)明提供治療或預(yù)防臨床乳腺癌的方法。該方法包括給受試者施用反義組合物 的步驟。在本發(fā)明的上下文中，反義組合物能降低指定靶基因的表達(dá)。反義化合物可以是 含有與GPR116序列互補的核苷酸，或是慢病毒。此外，本發(fā)明的方法可以包括給受試者施 用小干擾RNA(siRNA)組合物和慢病毒的步驟，在本發(fā)明的上下文中，siRNA組合物和慢病 毒都能降低GPR116的表達(dá)。本發(fā)明也已經(jīng)確認(rèn)了 siRNA和慢病毒對GPR116的抑制效應(yīng)。 例如，通過本申請的實施例，明確地證實了針對GPR116的siRNA和慢病毒都可以抑制乳腺 癌細(xì)胞的遷移。因此，在本發(fā)明中GPR116是乳腺癌的優(yōu)選治療靶標(biāo)。本發(fā)明還提供了篩選用于治療或預(yù)防乳腺癌化合物的方法，該方法包括使測試化 合物與導(dǎo)入了下述載體的細(xì)胞接觸，所述載體在報告基因上游包含GPR116的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)， 并選擇抑制GPR116表達(dá)水平的測試化合物。本發(fā)明的優(yōu)點在于該基因只在乳腺癌中有陽性信號，所以可以作為乳腺癌特異標(biāo) 志，檢測結(jié)果明確、易于判斷；GPR116作為細(xì)胞膜受體的一員，用于乳腺癌治療藥物篩選的 靶分子，具有信號通路上游，位點易接近的優(yōu)點。許多抗癌藥物不僅對癌細(xì)胞有毒，對正常 生長細(xì)胞同樣有毒，然而，基于GPR116在乳腺癌中特異表達(dá)的事實，抑制GPR116表達(dá)的藥 物可能就不會對正常細(xì)胞有不良作用，因而可以方便地用于治療或預(yù)防乳腺癌。結(jié)合附圖

和實施例以及附于本說明書的權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他目 的、特點和優(yōu)勢能夠更清楚地顯現(xiàn)出來。

圖1 六種乳腺癌細(xì)胞系中的GPRl 16表達(dá)譜圖1 (a) :RT-PCR定性測定的GPR116 mRNA在六種乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)，以GAPDH 表達(dá)作為內(nèi)部對照。圖1 (b) :Real-time PCR定量測定的GPR116mRNA在六種乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)， 以GAPDH表達(dá)作為內(nèi)部對照。圖1(c) =Western印跡分析測定GPR116蛋白在六種乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)，以 β -actin表達(dá)作為內(nèi)部對照。圖2 :BR721組織芯片的GPRl 16免疫組化結(jié)果。圖2(a)為三個不同乳腺癌病人(行)的乳腺癌及其匹配的癌旁和正常組織(列) 中GPRl 16的免疫組化圖。圖2(b)將GPR116的表達(dá)強度量化打分，分為3、2、1、0. 8、0. 5、0. 3、0七個等級。 根據(jù)打分結(jié)果和BR721組織芯片提供的信息，統(tǒng)計出M例臨床病人乳腺癌及其匹配的癌旁 和正常組織中GPR116的表達(dá)情況表。圖3 :BR8010組織芯片的GPRl 16免疫組化結(jié)果。
圖3 (a)顯示了 BR8010組織芯片的GPRl 16的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。圖3(b)軟件分析GPR116細(xì)胞膜表面光密度，根據(jù)光密度數(shù)值劃分信號強度。圖3(c)根據(jù)BR8010組織芯片提供的信息結(jié)合實驗結(jié)果，統(tǒng)計的GPR116在正常 乳腺組織及良性、惡性和轉(zhuǎn)移了乳腺癌中的表達(dá)情況。圖3(d)根據(jù)BR8010組織芯片提供的信息和實驗結(jié)果，統(tǒng)計的GPR116和乳腺癌 臨床各因素的關(guān)系。圖4 在低轉(zhuǎn)移能力乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(ER+)、SK-BR-3 (ER-)中過表達(dá)GPR116，顯 著增強其遷移、侵襲能力圖4 (a) :MCF-7細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株的PCRJestern Blot鑒定，MCF-7/空載體代表穩(wěn)定表 達(dá)pcDNA3. 1/myc-His C空載體的MCF-7，MCF-7/GPR116代表穩(wěn)定表達(dá)GPRl 16全長載體的 MCF-7。圖4(b)舊0 -7空載體穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞和1 ^-7過表達(dá)6 1 116細(xì)胞分別用于遷移和侵襲 實驗，和空載體穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞相比，穩(wěn)轉(zhuǎn)了 GPR116的MCF-7細(xì)胞在遷移和侵襲能力得到了顯著 的加強。圖4 (c) :SK-BR-3細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株的PCR鑒定，SK3/空載體代表穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3. 1/ myc-HisC空載體的SK-BR-3，SK3/GPR116代表穩(wěn)定表達(dá)GPR116全長載體的SK-BR-3。圖4(d) :SK-BR_3空載體穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞和SK-BR-3過表達(dá)GPR116細(xì)胞分別用于遷移和 侵襲實驗，和空載體穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞相比，穩(wěn)轉(zhuǎn)了 GPR116的SK-BR-3細(xì)胞在遷移和侵襲能力得到 了顯著的加強。圖5 在高轉(zhuǎn)移能力乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 (ER-)中干擾下調(diào)GPR116后，顯著 降低了其遷移、侵襲能力。圖5 (a) =SiRNA瞬時轉(zhuǎn)染M小時后，RT-PCR檢測siRNA的效果，相比于和哺乳動 物無序列同源性的對照siRNA(siNC)，該siRNA(siGPRl 16)有效的降低了 MDA-MB-231細(xì)胞 系中內(nèi)源性的GPRl 16表達(dá)水平。圖5 (b) =SiRNA瞬時轉(zhuǎn)染48小時后，siNC和siGPR116轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞分 別用于遷移和侵襲實驗。和轉(zhuǎn)染siNC的MDA-MB-231相比，siGPR116的MDA-MB-231細(xì)胞 無論在遷移還是侵襲能力上都有顯著的下降。圖5(c)帶有反義多核苷酸序列的plentilOX3.7載體包裝出的慢病毒感染 MDA-MB-231后，分別用PCR和^festern Blot檢測GPR116的干擾效果，由圖片可見，和對照 無靶標(biāo)特特異性的shRNA相比，GPRl 16shRNAl有良好的干擾效果，而GPR116shRNA2干擾效果較差。圖5(d):用這三種反義多核苷酸處理的乳腺癌細(xì)胞分別做遷移和侵襲實驗，可 見，干擾效果最好的GPRl 16shRNAl感染的MDA-MB-231遷移和侵襲能力明顯下降，顯著低于 對照shRNA和GPR116shRNA2感染的MDA-MB-231。乳腺癌MDA-MB-231本身是一個遷移和侵 襲能力十分高的細(xì)胞系，降低在MDA-MB-231中高表達(dá)的GPR116能顯著降低其遷移和侵襲 能力。圖6 在matrigel3D培養(yǎng)中，過表達(dá)GPR116的MCF-7細(xì)胞比對照MCF-7細(xì)胞有更 強的生長和向鄰近組織轉(zhuǎn)移的能力。圖7 小鼠肺組織切片，進(jìn)一步說明了在惡性乳腺癌細(xì)胞中降低GPR116的表達(dá)水平可以阻止惡性乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移，降低了其惡性程度。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另有說明，本說明書中使用的全部專業(yè)術(shù)語和科學(xué)用語的含義均與本發(fā)明所 屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員一般理解的含義相同。但如有沖突，以包含定義的本說明書為準(zhǔn)。實施例1不同轉(zhuǎn)移能力乳腺癌細(xì)胞系中GPR116的表達(dá)為了了解GPR116在不同轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，選擇 MDA-MB-231、MDA-MB-435, MDA-MB-468、MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-453 這六種轉(zhuǎn)移能力由高 到低遞減的乳腺癌細(xì)胞系，利用RT-PCR、Real-time PCR技術(shù)和^festern Blot分析技術(shù)分 別定性、定量檢測GPR116mRNA和蛋白在其中的表達(dá)情況，以GAPDH和β -actin的表達(dá)分 別作為mRNA水平和蛋白水平的內(nèi)部對照。實驗結(jié)果顯示無論是mRNA水平還是蛋白水平， GPR116在高轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)異常高，而在良性乳腺癌細(xì)胞中弱或者無表達(dá)。RT-PCR (定性檢測mRNA水平)RNA在實驗中利用Trizol試劑(Invitrogen)根據(jù)制造商的方案通過提取總RNA 進(jìn)行制備。用I^rimeScript TM RT試劑盒(TaKaRa公司)從Iug總RNA中逆轉(zhuǎn)錄出單鏈 cDNA,按照說明書提供方法。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA平均分為兩份，分別用內(nèi)參GAPDH引 物()和GPRl 16基因特異性引物(上游引物5，CCTACGGCTGAAGAATACAC 3，下游引物 5，CGTCACGCTCTTGACAAATG 3，)進(jìn)行 PCR 擴增，反應(yīng)體系依照 TaKaRaPrimeScript TM RT 試劑盒說明書，反應(yīng)條件為94°C 4分鐘，循環(huán)反應(yīng)94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 30秒，30 個循環(huán)，72°C8分鐘。PCR產(chǎn)物在1.5%西班牙瓊脂糖凝膠中電泳。實驗結(jié)果見圖1(a)。 Real-time PCR (定量檢測mRNA水平)用TAKARA 公司的 STOR Premix Ex Taq (Prefect Real Time)試劑盒，按照說明書 的反應(yīng)體系做管，每個樣品均平行重復(fù)三個復(fù)孔，反應(yīng)條件94°C 10秒，循環(huán)反應(yīng)94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 30 秒，40 個循環(huán)。所用 real-time PCR 儀器為 Mx3005p Real-Time PCR CyclerSTATAGENE (Mx3005p)。實時定量PCR過程中熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時所經(jīng)過的循環(huán) 數(shù)為CT值，計算各個樣本GPRl 16的CT值與管家基因GAPDH的CT值的差值Δ CT, 2_Δ Δετ即 為各個樣本中GPR116相對于同一樣本中GAPDH的表達(dá)量。這樣可以定量的表示各乳腺癌 細(xì)胞系中GPRl 16基因的相對表達(dá)水平。實驗結(jié)果見圖1 (b)。Western Blot (定性蛋白水平)Western Blot基本原理為抗原抗體反應(yīng)。細(xì)胞蛋白提取物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳 分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上(本實驗采用硝酸纖維素膜)。與特異的一抗反應(yīng)，再與辣根過 氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗孵育顯色，可以得到特異蛋白分子的免疫印跡圖。該方法具有 從混雜抗原中檢測出特定的抗原的特點。細(xì)胞用PBS 洗三遍，用細(xì)胞裂解 buffer RIPA 溶液(50mM Tris-HCl, ph7. 4,10150mMNaCl, 1% ΝΡ40，0· 25% Na-deoxycholate，ImMPMSF 使用時現(xiàn)加 1 IOOcocktail)裂 解細(xì)胞，4°C混合15分鐘，12000rpm 4°C離心20分鐘，收集上清。電泳及免疫反應(yīng)，流程如 下A、制膠(8%濃縮膠，10%分離膠)；B、50ug蛋白樣品加入上樣緩沖液，煮沸，上樣；C、電 泳，濃縮膠60V電壓，分離膠100V電壓D、轉(zhuǎn)膜，100V, 1. 5h ；E、5 %脫脂牛奶，封閉Ih ；F、一 抗反應(yīng)，4°C，過夜；G、TBST洗膜，三次，每次100分鐘；H、二抗反應(yīng)，避光Ih ；I、TBST洗膜， 三次，每次10分鐘；J、顯色、曝光。實驗結(jié)果見圖1 (c)。實施例2免疫組織化學(xué)組織芯片由陜西超英生物科技有限公司提供，產(chǎn)品編號分別為BR721和 BR8010 (均來自美國Biomax)。BR721乳腺癌及其匹配的正常和癌旁組織組合芯片，對例/72 點，和BR8010病例不重復(fù)，M例乳腺癌及其匹配的正常和癌旁組織，每例一點。BR8010，乳 腺纖維腺瘤芯片，71例/80點，其中含有10例正常和癌旁邊緣，20例纖維瘤，10例小葉癌， 30例浸潤性導(dǎo)管癌，10例轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，每例一點。BR721芯片結(jié)果顯示在病人乳腺癌組織 中GPRl 16高度表達(dá)，且只特異地表達(dá)在癌細(xì)胞中，而在相對應(yīng)的癌旁和正常組織中GPRl 16 弱表達(dá)，甚至無表達(dá)?？梢奊PR116對于區(qū)分乳腺癌變細(xì)胞和正常細(xì)胞有很好的指示作用， 在癌細(xì)胞中表達(dá)強度高且特異，可作為臨床乳腺癌診斷的分子標(biāo)志。BR8010芯片結(jié)果顯示 GPRl 16在正常乳腺組織無表達(dá)或弱表達(dá)，在良性乳腺癌中以弱表達(dá)為主，強表達(dá)于高度惡 化和轉(zhuǎn)移的乳腺癌中。并且在良性、惡性和轉(zhuǎn)移的乳腺癌中GPR116的表達(dá)是遞增的，呈現(xiàn) 出和乳腺癌惡化程度的正相關(guān)?？梢奊PR116不僅可以區(qū)分乳腺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞，而且它 的表達(dá)強度還可以用于評價乳腺癌進(jìn)程，為乳腺癌的臨床治療提供指導(dǎo)。免疫組化檢測步驟如下1.垂直放置烤片，在62°C恒溫烘箱烤1小時。2.拿出后依次放入二甲苯5分鐘，100%乙醇2次2分鐘，95%乙醇2次2分鐘， 70%乙醇1次2分鐘，50%乙醇1次2分鐘，IXTBS 2次5分鐘。3.組織預(yù)備處理，用檸檬酸鈉溶液進(jìn)行組織修復(fù)100°C修復(fù)20-35分鐘；放置室 溫，讓其降至25-30°C ；PAP筆將組織圈住；3% H202,15分鐘在濕盒內(nèi)去內(nèi)源過氧化氫酶； IXTBS洗涂切片3次5分鐘4.封閉block reagent濕盒孵育30分鐘洗滌3次5分鐘5. 一抗(1 100)4°C過夜。6. IXTBS 4次5分鐘；用濾紙吸干加Anti-Rabbit 二抗15分鐘；IXTBS 4次5分 鐘；HRP (粉紅)覆蓋樣本10分鐘；1 X TBS洗4次5分鐘；150ul DAB顯色5分鐘；自來水沖 洗10分鐘；蘇木精復(fù)染10分鐘。1 1鹽酸酒精分色，用肉眼分辨變成紅色(比紫色淡)用蒸餾水洗兩次后，放在 自來水下沖洗10分鐘左右。依次放在50 %乙醇2分鐘，75 %乙醇2分鐘，85 %乙醇2分鐘， 95%乙醇2次3分鐘，100%乙醇2次5分鐘。7. 二甲苯2次5分鐘，吸干后加中性樹脂1-2滴，封片。8.萊卡正置顯微鏡(Leica DM4000B)拍照。結(jié)果見圖2和圖3。實施例3GPRl 16全長載體構(gòu)建和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的獲得
6 1 116全長？0 克隆自乳腺癌細(xì)胞系10^-]\^-231的00嫩，用恥11 I和)(ho I酶切 位點連入pcDNA3. 1/myc-His C載體相應(yīng)位點，經(jīng)測序證實片段連入成功且正確。所用PCR 引物如下正義鏈5，GGGGTACCTGGACAGGCCAACCAACTC3，反義鏈5，CCCTCGAGTGAGTTGAGCAACGAAGAAG3，將上述全長載體和pcDNA3. 1/myc-His C 空載體用 Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (invitrogen)分別轉(zhuǎn)染入MCF-7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染方法按照試劑說明 書，隔天加入含有G418700ug/mL的MCF-7完全培養(yǎng)基，三至五天后大量細(xì)胞死亡，每兩天換 液一次，二十天后單克隆形成，挑單克隆入M孔板，每孔一個單克隆，此時培養(yǎng)基中G418濃 度下降至400ug/mL，擴大培養(yǎng)至6孔板后，分別做PCR和flfestern Blot檢測每個單克隆細(xì) 胞株GPR116的表達(dá)情況，與轉(zhuǎn)染空載體單克隆細(xì)胞株比較。最終挑選出真正高表達(dá)GPR116 的MCF-7細(xì)胞株。空載體和過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株均用含G418 400ug/mL的完全培養(yǎng)基穩(wěn)定傳 代，結(jié)果見圖4(a)，和空載體細(xì)胞相比，過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞GPR116的表達(dá)水平有明顯的提 高，說明過表達(dá)成功。SK-BR-3過表達(dá)GPR116的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞獲得方法同MCF-7，篩選G418濃 度為500ug/mL，維持G418濃度為200ug/mL。實驗結(jié)果見圖4 (c)，和載體細(xì)胞相比，過表達(dá) 的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞GPR116的表達(dá)水平也有明顯的提高，說明也過表達(dá)成功了。實施例4Matrigel的3D腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)三維細(xì)胞培養(yǎng)已被廣泛運用到腫瘤學(xué)研究，在腫瘤的實驗性治療、腫瘤的侵襲性、 轉(zhuǎn)移和中心壞死的機制、腫瘤的血管形成和營養(yǎng)供給、體內(nèi)基因表達(dá)的模擬等方面發(fā)揮了 不可替代的作用。人們觀察到，腫瘤細(xì)胞不僅能夠在普通培養(yǎng)皿上形成單層，還能通過胞間 信息傳遞離開基底面，而向空間發(fā)展成三維組織。因此，腫瘤學(xué)家專門建立了一套回旋三維 培養(yǎng)技術(shù)，以研究在沒有血管提供營養(yǎng)的情況下，能最大程度產(chǎn)生多少細(xì)胞聚集體而又不 發(fā)生壞死現(xiàn)象。另外，利用三維培養(yǎng)還可以有效地測試腫瘤生長和向鄰近組織轉(zhuǎn)移的能力。具體實驗方法如下1. Matri-gel (BD)至冰上于4°C解凍過夜，實驗用六孔板也與前夜放置于4°C過 夜。2.第二天，拿出預(yù)冷的六孔板每孔鋪Matri-gel 120ul，置于37°C 15 30min使 Matri-gel 凝固。3.消化細(xì)胞，計數(shù)，每孔接細(xì)胞10，000/250ul，將細(xì)胞均勻鋪在Matri-gel上，待 細(xì)胞貼于Matri-gel后，補加250ul含有10% Matri-gel的完全培養(yǎng)基。若需要TGF-beta 培養(yǎng)時，使上層培養(yǎng)基中TGF-beta的濃度為lOng/ml。放回37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4.約每兩天換液，細(xì)胞培養(yǎng)3-4d后，出現(xiàn)3D克隆生長的細(xì)胞團(tuán)。拍照?？梢钥闯鰺o論是在有還是無TGF-beta細(xì)胞因子刺激的情況下，過表達(dá)GPR116的 MCF-7細(xì)胞相比對照MCF-7細(xì)胞都有更多的小聚集體出現(xiàn)。說明GPR116使得良性的MCF-7 乳腺癌細(xì)胞在沒有血管提供營養(yǎng)的情況下，產(chǎn)生更多的小聚集體而又不發(fā)生壞死現(xiàn)象，并 且具有更強的向周圍細(xì)胞外基質(zhì)的能侵襲延展的能力。提示GPRl 16可以使得乳腺腫瘤具 有更強的生長和向鄰近組織轉(zhuǎn)移的能力。實施例5GPRl 16全長載體轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞12
這里所用的原核細(xì)胞為大腸桿菌，包括DH5ci、BL21大腸桿菌菌株。1.將制備好的感受態(tài)大腸桿菌從-80°C取出，放置在冰上化凍。2.取l-2uLGPR116全長載體質(zhì)粒和30_50uL化凍的感受態(tài)大腸桿菌輕柔混勻，放 置在冰上30分鐘。3.將混合物放在42°C水浴鍋內(nèi)水浴1分鐘，立即放冰上，2分鐘。4.加入600uL無抗性的溫浴過的LB培養(yǎng)基，37°C，搖菌40-60分鐘。5.取出100-200UL菌液均勻涂布在事先溫?zé)岷玫腖B平板上，倒置放入37°C恒溫 培育箱子內(nèi)過夜。實施例6細(xì)胞遷移侵襲實驗細(xì)胞侵襲實驗4 °C條件下解凍Matrigel (BD)過夜，空白培養(yǎng)基按1 10的比例稀釋 Matrigel，于每個 Transwell(Millipore)小室上室底部均勻平鋪 Matrigel 100 μ 1， 并置于37 °C放置2小時使基底膜膠凝固，然后用37 °C空白培養(yǎng)基浸浴水化小室膜 30分鐘。0.25%胰酶消化處于指數(shù)增殖期的細(xì)胞，用空白培養(yǎng)基懸浮并計數(shù)，接入 1X105(MDA-MB-231) 1. 5X 105(MCF_7、SK-BR-3)細(xì)胞，每組設(shè)3個平行孔，并加空白培養(yǎng)基 200 μ L.下室內(nèi)加入600 μ 1完全培養(yǎng)基。37°C培養(yǎng)16小時(MDA-MB-231) 24小時(MCF-7、 SK-BR-3)后，拿出，吸凈上室液體，用棉簽將上室的細(xì)胞擦掉，百分之四預(yù)冷多聚甲醛固定 10分鐘，蘇木精染色30分鐘，光學(xué)顯微鏡下QOOX)隨機選取15個視野進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，算 出每個視野的平均值.上述實驗重復(fù)3次。細(xì)胞遷移實驗采用Transwel 1穿膜運動實驗方法，檢測細(xì)胞的遷移能力，具體方法除Transwel 1 小室上室不鋪膜外，其余均與侵襲實驗相同。實施例7GPR116siRNA 的瞬時轉(zhuǎn)染
于轉(zhuǎn)染前一天將MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度以第二天長到匯合度 50%左右為宜。第二天用1Trans-EZ siRNA轉(zhuǎn)染試劑(SunBio)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siRNA，注意所 有轉(zhuǎn)染用的溶液、槍頭、操作環(huán)境都要注意沒有RNase污染，轉(zhuǎn)染方法參照試劑說明書。于 轉(zhuǎn)染后4-8小時換液(完全培養(yǎng)基)，24小時收樣用于PCR檢測干擾效果，見圖5 (a)，顯示 成功的干擾下降了 GPR116的表達(dá)。48小時后，消化細(xì)胞用于做功能相關(guān)實驗(遷移和侵 襲實驗)，結(jié)果見圖5 (b)，降低了 GPRl 16以后的MDA-MB-231在遷移和侵襲能力上都顯著降 低。實施例8GPRl 16反義多核苷酸慢病毒載體構(gòu)建和慢病毒包裝、感染1. GPRl 16反義多核苷酸載體構(gòu)建用于構(gòu)建針對GPR116的siRNA表達(dá)載體的人工合成寡核苷酸序列正義鏈TGTGATGCAGGTGAATATGTTTCAAGAGAACATATTCACCTGCATCACTTTTTTC反義鏈ACACTACGTCCACTTATACAAAGTTCTCTTGTATAAGTGGACGTAGTGAAAAAAGAGCT用于構(gòu)建針對與哺乳動物無序列同源性的對照siRNA表達(dá)載體的人工合成寡核苷酸序列正義鏈TGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAACTTTTTTC反義鏈ACAAGAGGCTTGCACAGTGCAAAGTTCTCTTGCACTGTGCAAGCCTCTTGAAAAAAGAGCT載體構(gòu)建步驟如下(1).將單鏈用無菌水溶至:3mg/mL(2).相互配對的兩條單鏈各取IuL加入到48uL退火緩沖液中(IOOmM NaCl and 50mM HEPESpH 7. 4)。(3).將混合物按以下程序退火90°C 4分鐘，700C 10分鐘，37°C 20分鐘，最后緩 慢冷卻到IO0Co(4).pletiloX3. 7空載體用Xho I和Hpa I雙酶切3小時后，1 %西班牙瓊脂糖，跑 膠，用DNA割膠回收試劑盒(天根)，割膠回收，步驟照試劑盒說明書。(5).連接體系如下2uL退火混合物，IuL 10XT4DNA連接緩沖液，1 μ 1酶切載體 (濃度在 0. 2 μ g/ μ 1-0. 5 μ g/ μ 1 之間)，5 μ 1 無菌水，1 μ 1 T4DNA 連接酶，共 10 μ 1，16°C 連接過夜。(6).轉(zhuǎn)化入DH5CI感受態(tài)大腸桿菌中，涂板(氨芐抗性LB平板)，37 °C培養(yǎng)過夜。 挑單克隆，搖菌，質(zhì)粒小抽，測序鑒定。2.慢病毒包裝和靶細(xì)胞感染(1)用三質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞包裝病毒，三質(zhì)粒分別為PSPAX2、PMD2G、 plentiloX3. 7按照2 1 2的比例共轉(zhuǎn)染。(2)前一天接入10厘米培養(yǎng)皿，密度以第二天至50% -60%為宜。
(3)次日，磷酸鈣法轉(zhuǎn)染三質(zhì)粒入(4)4-6小時后換液，加入6到7毫升完全培養(yǎng)基，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(5)36-48小時后，吸取上清，4000rpm，4°C離心5分鐘。(6)吸取上清，用0. 22uM濾嘴過濾(7)將液體加入前一天接板的靶細(xì)胞中，70%以下的細(xì)胞密度為宜。(8) 48小時后觀察感染效率。慢病毒感染干擾GPRl 16的效果見圖5 (c)，和對照(沒有降低GPRl 16水平)細(xì)胞 相比，成功干擾降低了 GPR116的MDA-MB-231細(xì)胞表現(xiàn)出更低的遷移和侵襲能力。實施例9GPR116基因用于制備生物芯片用獲取的GPR116基因的核苷酸序列設(shè)計引物，擴增出全長的GPR116基因或該基 因的部分片段，用作生物芯片點樣的樣品。用英國的BioRobotics自動點膜儀將樣品點在8X 12cm尼龍膜上，每一標(biāo)本點4 個點，每點的DNA量約為10ng。陽性對照是重復(fù)4次點樣的人β -actin基因，陰性對照是 重復(fù)4次點樣的噬菌體DNA。含有GPR116基因的芯片可作為乳腺癌的診斷標(biāo)志物并可用于藥物篩選。實施例10診斷乳腺癌本發(fā)明提供了利用GPR116基因作為診斷標(biāo)志診斷癌癥的方法。該診斷方法包括14步驟(a)測定標(biāo)本的生物樣品中.GPRl 16基因的表達(dá)水平；(b)將GPR116基因的該表達(dá)水平與正常樣品中的進(jìn)行比較，和(c)將樣品中GPRl 16基因的高表達(dá)水平定義為具有癌癥。GPRl 16基因在具體標(biāo)本中的表達(dá)水平可以通過定量相應(yīng)于GPRl 16基因的mRNA或 者由GPR116基因編碼的蛋白進(jìn)行評估。mRNA定量方法是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的。例 如，與.GPRl 16基因相應(yīng)的mRNA可以通過RNA印跡或者RT_PCR進(jìn)行評估。GPR116基因的表達(dá)水平可以根據(jù)該GPR116基因編碼的蛋白的活性或量進(jìn)行分 析。測定GPR116蛋白量的方法顯示于下。例如，免疫測定法可用來測定生物材料中的上述 蛋白。任何生物材料都可以用于該蛋白或其活性的測定。例如，分析血樣以評估由血清標(biāo) 志所顯示的蛋白。另一方面，可以根據(jù)待分析的每種蛋白的活性選擇合適的方法用于測定 GPR116基因所編碼的蛋白的活性。評估標(biāo)本(受試樣品)中GPR116基因的表達(dá)水平并與正常樣品中的進(jìn)行比較。當(dāng) 這種比較證明GPR116基因的表達(dá)水平高于正常樣品中的水平時，則判定受試者染有癌癥。 來自正常樣品和受試者的標(biāo)本中GPR116基因的表達(dá)水平可以同時進(jìn)行測定。作為選擇地， 可以根據(jù)對事先從對照組收集的標(biāo)本中GPR116基因的表達(dá)水平的分析所獲得的結(jié)果，通 過統(tǒng)計學(xué)方法確定表達(dá)水平的正常范圍。將通過檢查受試者樣品所獲得的結(jié)果與該正常范 圍進(jìn)行比較；當(dāng)結(jié)果未落在正常范圍內(nèi)時，受試者被判定染有癌癥。在本發(fā)明中，待診斷的 癌癥優(yōu)選為乳腺癌。實施例11診斷乳腺癌的試劑本發(fā)明的診斷試劑包含與本發(fā)明的DNA或蛋白結(jié)合的化合物。優(yōu)選地，與本發(fā)明 的多核苷酸雜交的寡核苷酸，或者可與本發(fā)明蛋白結(jié)合的抗體可以作為這些化合物來用。實施例12治療或預(yù)防乳腺癌的方法本發(fā)明提供了用于在受試者中治療或預(yù)防乳腺癌的方法。為了預(yù)防或治療目的將 治療性化合物施用于患有或有風(fēng)險(或易于)發(fā)展成乳腺癌的受試者。此類受試者是通過 標(biāo)準(zhǔn)臨床方法或通過檢測GPRl 16的異常表達(dá)水平或活性得到鑒定的。預(yù)防性施用發(fā)生在 疾病的明顯臨床癥狀出現(xiàn)以前，從而預(yù)防疾病或紊亂，或延緩其進(jìn)程。治療性方法包括降低 GPR116基因的表達(dá)或功能。在這些方法中，受試者接受有效量化合物的治療，以降低受試者 中過度表達(dá)的基因(GPR116基因)。施藥可以是全身的或局部的。治療性化合物包括能降 低在乳腺癌細(xì)胞中內(nèi)源性存在的此類基因的表達(dá)水平的化合物(即下調(diào)過度表達(dá)基因的 表達(dá)的化合物)。施用此類治療性化合物抵消受試者細(xì)胞中異常過度表達(dá)基因的效果，并期 望能改善受試者的臨床狀況。此類化合物可通過上文所述本發(fā)明之篩選方法得到。GPR116基因的表達(dá)還可通過本領(lǐng)域已知的數(shù)種方式進(jìn)行抑制，包括對受試者施用 能抑制或拮抗基因表達(dá)的核酸。能破壞基因表達(dá)的反義寡核苷酸、小干擾RNA或核酶可用 于抑制基因的表達(dá)。如前所述，對應(yīng)于GPR116基因核酸序列的反義寡核苷酸可用于降低GPR116基因 的表達(dá)水平。具體地，本發(fā)明之反義寡核苷酸可通過結(jié)合GPR116基因編碼的任何多肽或與其對應(yīng)的mRNA，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進(jìn)mRNA的降解，和/或抑制由基因編碼的蛋 白質(zhì)的表達(dá)，及最終抑制GPR116蛋白質(zhì)的功能來起作用。通過與對衍生物無活性的適當(dāng)基礎(chǔ)材料混合，反義寡核苷酸及其衍生物可制成外 用制劑，諸如搽劑或敷劑，用于本發(fā)明中治療或預(yù)防前列腺癌的方法。抑制過度表達(dá)基因的一種或多種基因產(chǎn)物的核酸還包括小干擾RNA(SiRNA)，它包 含編碼GPR116基因的核苷酸序列的有義鏈核酸和反義鏈核酸的組合體。將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞 的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于本發(fā)明中的治療和預(yù)防，包括以DNA為模板轉(zhuǎn)錄得到RNA的方法。siRNA 構(gòu)建成包含來自靶基因的有義序列和互補反義序列的單一轉(zhuǎn)錄本，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)。本方法用于抑制GPRl 16基因表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞中的基因表達(dá)。siRNA與靶細(xì)胞中 GPRl 16基因轉(zhuǎn)錄本的結(jié)合導(dǎo)致該細(xì)胞中GPR116蛋白質(zhì)產(chǎn)量下降。抑制過度表達(dá)基因的一種或多種基因產(chǎn)物的核酸還包括針對過度表達(dá)基因 (GPR116基因)的核酶。實施例13篩選化合物本發(fā)明提供了篩選用于治療或預(yù)防乳腺癌的化合物的方法。通過控制GPR116的 表達(dá)水平，可控制乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。這樣，可通過利用GPR116的表達(dá)水平作為指標(biāo)的 篩選方法來鑒定可用于治療或預(yù)防乳腺癌的化合物。此類篩選可包括例如以下步驟a)使表達(dá)GPRl 16的細(xì)胞與測試化合物接觸；并b)選擇與測試化合物缺失的情況下的表達(dá)水平相比能降低GPR116表達(dá)水平的化合物。表達(dá)GPR116的細(xì)胞包括例如由乳腺癌建立的細(xì)胞系；這些細(xì)胞可用本發(fā)明的上 述篩選方法(如MDA-MB-231)。表達(dá)水平可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來評估。在篩 選方法中，可選擇能降低GPR116表達(dá)水平的化合物作為用于治療或預(yù)防乳腺癌的候選藥 物?；蛘?，本發(fā)明的篩選方法可包括以下步驟a)使測試化合物與導(dǎo)入了下述載體的細(xì)胞接觸，所述載體包含GPR116的轉(zhuǎn)錄調(diào) 控區(qū)及在該轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)控制下表達(dá)的報告基因。b)測量所說報告基因的表達(dá)水平；并c)選擇與對照相比能降低所說報報告基因表達(dá)水平或活性的化合物。合適的報告基因和宿主細(xì)胞為本領(lǐng)域所熟知。篩選所需的報告基因構(gòu)建物可用 GPR116的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)來構(gòu)建。而GPR116的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，可以用已知 的序列信息來構(gòu)建報告基因載體。實施例14小鼠體內(nèi)實驗4周齡的NOD-SCID雌性小鼠，隨機分成2組，每組5只。將IX 106/100uL的對數(shù) 生長期的MDA-MB-231細(xì)胞和穩(wěn)定降低GPR116表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞分別通過尾靜脈注 射的方式打入兩組老鼠體內(nèi)。常規(guī)飼養(yǎng)，九周后處死小鼠，取肺組織切片，HE(蘇木精伊紅 染色)后，顯微鏡拍照。切片結(jié)果可見，對照組注射了正常MDA-MB-231細(xì)胞的小鼠肺切片里有大量轉(zhuǎn)移的乳腺腫瘤細(xì)胞(箭頭所示，腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的比值比周圍正常組 織細(xì)胞大，且常伴有核異型現(xiàn)象的出現(xiàn))的存在，而注射穩(wěn)定降低GPR116的MDAA-MB-231 組的小鼠肺切片顯示肺組織結(jié)構(gòu)正常，沒有任何腫瘤細(xì)胞。小鼠活體實驗進(jìn)一步說明降低 惡性乳腺癌細(xì)胞中GPR116的表達(dá)，可以降低乳腺癌細(xì)胞的惡性程度，阻止惡性乳腺癌的轉(zhuǎn)移。序列表〈110〉華東師范大學(xué)<120>GPR116基因及其編碼的受體蛋白和應(yīng)用〈160>13<170>PatentIn Version 2. 1<210>1<211>5822<212>DNA〈213〉智人(Homo sapiens)〈220〉<221>CDS<222>(290). . (4330)<400>11actttttgtttttaaaacagcagcgcggctctcagggatgactctgtgagactgggagga61tcatagctgggggaggctgagcgtgggagcggtgctgccagtcctgcctgaaaacgcgaa121atgagtcttgcttggttctccctccactgggcgtgagagcccctgcccaggaggcccagg181acaaatggccccatagtggaaactgggaagcttttaggcatctgatcagagcgggagcca241gccgggggaccacagtgctggacaggccaaccaactcaaacttgaagacatgaaatcccc301aaggagaaccactttgtgcctcatgtttattgtgatttattcttccaaagctgcactgaa361ctggaattacgagtctactattcatcctttgagtcttcatgaacatgaaccagctggtga421agaggcactgaggcaaaaacgagccgttgccacaaaaagtcctacggctgaagaatacac481tgttaatattgagatcagttttgaaaatgcatccttcctggatcctatcaaagcctactt541gaacagcctcagttttccaattcatgggaataacactgaccaaattaccgacattttgag601cataaatgtgacaacagtctgcagacctgctggaaatgaaatctggtgctcctgcgagac661aggttatgggtggcctcgggaaaggtgtcttcacaatctcatttgtcaagagcgtgacgt721cttcctcccagggcaccattgcagttgccttaaagaactgcctcccaatggacctttttg781cctgcttcaggaagatgttaccctgaacatgagagtcagactaaatgtaggctttcaaga841agacctcatgaacacttcctccgccctctataggtcctacaagaccgacttggaaacagc901gttccggaagggttacggaattttaccaggcttcaagggcgtgactgtgacagggttcaa961gtctggaagtgtggttgtgacatatgaagtcaagactacaccaccatcacttgagttaat1021acataaagccaatgaacaagttgtacagagcctcaatcag3.C C 3.0 3.3.3.3.tggactacaa1081ctcctttcaagcagttactatcaatgaaagcaatttctttgtcacaccagaaatcatctt1141tgaaggggacacagtcagtctggtgtgtgaaaaggaagttttgtcctccaatgtgtcttg1201gcgctatgaagaacagcagttggaaatccagaacagcagcagattctcgatttacaccgc17
126132138144150156162168174180186192198204210216222228234240246252258264270276282288294300306312318324330336342348354acttttcaac tgcaggtgaa aatagatgtt caatcctgta gaagcaggaa cagcagatac agtcatctac agtgacattc gggacaaaac gaacacttct tggagcagaa ctgcatattt gctgcctcta ttcccatcac gggttcctca caatttcaat taccaatgct ggaaaacatc gaagctatgc cacttacaaa aataaacagt gctccctaca ctcttctcct aacccaagta caagcccgtc gctactacat gtccttctcc aacctatcaa caagagctat tctccaagcc gacaaccact caatagccct cacagggggg ctgtatctgt tagttctctc cttgagcttg ccggacttct caacacctgg agcctgtgtgaacatgactt tatgtttgca atgcccatcc tctttgaact ggaaaaataa accctcaagg acttgtgagt atctctgtgg ttttctataa gctggaatta tcagtactga agatataaga aagctgaaca atcaagtgct tcccttcctg gcaagctcag gctaataatt acatgccagg cggttctcaa tgtgtaggct ctgctccaga tacctgaagg gggagtctgg aattcagaaa ttgaacacct tcagtggaaa caaactaatg cagaggtttg ctagaaaact atccttgccc gtcagccaca tcaggcggcg tgggacagca gaccacctaa ctgggaatac gcagcctgtc tatatgcgcc ttcattgtgg gctgccacctcggtgtccaa aactgatatt aaattttggc gctgcagtca atattccagg ctgatggaac tcatcagtgc ccaatctaac aatgcatcag aaatatacca cagtcaagac attcatacag tcatggttga gcatagagga ctgcaaaaga tttcctggtg cagtctggag atcccgtaat acgttcccag cccagtggga tggctaaggc atctttctat gagccattat tgatgacgca ggaaggtttt gattttccca tgcagatgag ttttcccata tgcagtcgga aggatatcca atacaactat aaacgaagtg gtgggtgcta catcattctc tcctggatat tagttgtgga acacctgcat tcgctgccat tcttcatccagctcaccatc agacattttt aaatgaagaa gggtaatgtt aacccctgag ccagtgccca ctatggagcc aataaccccg tgatgtgagt aagattttat ctcgaccagg tattgcaacc tcctttggaa ggatggagac agttaacaaa ttcaaaaact cccatctatg aggtgtcgga cagccctgag ggagaagaga tttgatcaag tagcatagac taacatcctt cgtgctctct acaacagcaa agcattacag cagcatggta ctttgacctc ttcgtctatt ggaaaataac gccattcagg tgtcttctgg tgtagaagaa catcctcatg tatttcttat agctgtggtg agtgaatatc ccaggacaat cttcttctaccacaacatca gaatatgagt atgaaggtga aattggagca acagacatag agcgggtcgt agaggcagtg gacccaattt aactatgatg accacgagga gagtggaatg aaagacgtca gctactgttt tacaaagtta aaacaagtgt gttgatgtgt aagctgaatc gagccgggga agtcccattg aatgactgca agcccctctc aaagcggaac gatctgctct acggttaatg tggaccaatc tcgggagata atcaagtcca tggggcaatg gtcaccatgg tttgcagaga atttcaatga aacttcaggc ggtgatgggg tcccctgact gttggggtgg tggaaatcgg gctgcctccc cgctacatac ctcagcgtctctccaggtga gcaagaagaa tgtgcgacaa aagtagaatg attctagctg ctggaacaac caaacataaa ctgtttctga aggtttattg ggtatcttga gaacctatca ttgttcaccc catgcagtgg ctttccatac gctacaaaca gttgtcactt tggttcctgg aagtcatcca gcgggaccat tctctgcccc aggatgagat atgaaatcag caacagttcc tcatccttgg agagttcaca gccctccttt gccacccaga tggtcattga ctttcccaac gcttagtgat cttttaagaa ttgccaacaa acaatgtcac ccccagatcc gcttttccat tgaccaagaa ttctggtcgc tctgcaagac tcttctggat
3601gctgacactgggcctcatgctgttctatcgcctggttttcattctgcatgaaacaagcag3661gtccactcagaaagccattgccttctgtcttggctatggctgcccacttgccatctcggt3721catcacgctgggagccacccagccccgggaagtctatacgaggaagaatgtctgttggct3781caactgggaggacaccaaggccctgctggctttcgccatcccagcactgatcattgtggt3841ggtgaacataaccatcactattgtggtcatcaccaagatcctgaggccttccattggaga3901caagccatgcaagcaggagaagagcagcctgtttcagatcagcaagagcattggggtcct3961cacaccactcttgggcctcacttggggttttggtctcaccactgtgttcccagggaccaa4021ccttgtgttccatatcatatttgccatcctcaatgtcttccagggattattcattttact4081ctttggatgcctctgggatctgaaggtacaggaagctttgctgaataagttttcattgtc4141gagatggtcttcacagcactcaaagtcaacatccctgggttcatccacacctgtgttttc4201tatgagttctccaatatcaaggagatttaacaatttgtttggtaaaacaggaacgtataa4261tgtttccaccccagaagcaaccagctcatccctggaaaactcatccagtgcttcttcgtt4321gctcaactaagaacaggataatccaacctacgtgacctcccggggacagtggctgtgctt4381ttaaaaagagatgcttgcaaagcaatggggaacgtgttctcggggcaggtttccgggagc4441agatgccaaaaagactttttcatagagaagaggctttcttttgtaaagacagaataaaaa4501taattgttatgtttctgtttgttccctccccctcccccttgtgtgataccacatgtgtat4561agtatttaagtgaaactcaagccctcaaggcccaacttctctgtctatattgtaatatag4621aatttcgaagagacattttcactttttacacattgggcacaaagataagctttgattaaa4681gtagtaagtaaaaggctacctaggaaatacttcagtgaattctaagaaggaaggaaggaa4741gaaaggaaggaaagaagggagggaaacagggagaaagggaaaaagaagaaaaagagaaag4801atgaaaataggaacaaataaagacaaacaacattaagggccatattgtaagatttccatg4861ttaatgatctctcagtgcaacattgagaatttttttttaatggctcaaaa4921atggaaactgaaagcaagtcatggggaatgaatactttgggcagtatcttcctgatgtct4981tcttagctaagaggaggaaaaaaaggctgaaaaaatagggaggaaattccttcatcagaa5041cgacttcaagtggataacaatatttataagaaatgaatggaaggaaatatgatcctcctg5101agactaactttgtatgttaaggtttgaactaagtgaatgtatctgcagaggaagtattac5161aaagatatgtcattagatccaagtgctgattaaatttttatagtttatcagaaaagcctt5221atattttagtttgttccacattttgaaagc3.3.3.3.3.3. 3. 3.tatttgatatacccttcaat5281tgccaaatttgatatgttgcactgaagacagaccctgtcatatatttaatggcttcaagc5341aggtacttctctgtgcattatagaatagattttaataatcttatagcattgtatattatt5401attgctgttgtcactgttattattattgtggatactggcccttggtgtgttgcatagctc5461cctatgtattctctgtttccatctttaagttcccagaccaagagttttgc5521atggtctaaattgtgtttattccaaccacgtggaaagctcctggaaagaaattttacatt5581cggttgttctgtgctcctaatgacacttgaccttgttgaacaaatggcagagcctttccc5641aaggatttgattgtttgtgaattatctgcatgtgtgcttttttttggtgtgtatttcatt57013.3.3.3.3.3. 3. 3.aatatttatgaaaattgcacgcatattagagttaaccatgtactattgat5761acagcaacgctacattgcaaataaaagtccgatcccaaaaggagaatgag3. C 3.3.3.3.3.3.3.3.5821aa<210>219
<211>1346<212>氨基酸<213><400>21MKSPRRTTLCLMFIVIYSSKAALNWNYESTIHPLSLHEHEPAGEEALRQKRAVATKSPTA61EEYTVNIEISFENASFLDPIKAYLNSLSFPIHGNNTDQITDILSINVTTVCRPAGNEIffC121SCETGYGffPRERCLHNLICQERDVFLPGHHCSCLKELPPNGPFCLLQEDVTL匪RVRLNV181GFQEDLMNTSSALYRSYKTDLETAFRKGYGILPGFKGVTVTGFKSGSVVVTYEVKTTPPS241LELIHKANEQVVQSLNQTYKMDYNSFQAVTINESNFFVTPEIIFEGDTVSLVCEKEVLSS301NVSffRYEEQQLEIQNSSRFSIYTALFNNMTSVSKLTIHNITPGDAGEYVCKLILDIFEYE361CKKKIDVMPIQILANEEMKVMCDNNPVSLNCCSQGNVNWSKVEffKQEGKINIPGTPETDI421DSSCSRYTLKADGTQCPSGSSGTTVIYTCEFISAYGARGSANIKVTFISVANLTITPDPI481SVSEGQNFSIKCISDVSNYDEVYffNTSAGIKIYQRFYTTRRYLDGAESVLTVKTSTREffN541GTYHCIFRYKNSYSIATKDVIVHPLPLKLNIMVDPLEATVSCSGSHHIKCCIEED ⑶ IV601TFHTGSSSLPAAKEVNKKQVCYKHNFNASSVSffCSKTVDVCCHFTNAANNSVffSPSMKLN661LVPGENITCQDPVIGVGEPGKVIQKLCRFSNVPSSPESPIGGTITYKCVGSQffEEKRNDC721ISAPINSLLQMAKALIKSPSQDEMLPTYLKDLSISIDKAEHEISSSPGSLGAIINILDLL781STVPTQVNSEMMTHVLSTVNVILGKPVLNTWKVLQQQffTNQSSQLLHSVERFSQALQSGD841SPPLSFSQTNVQMSSMVIKSSHPETYQQRF VFPYFDLffGNVVIDKSYLENLQSDSSIVTM901AFPTLQAILAQDIQENNFAESLVMTTTVSHNTTMPFRISMTFKNNSPSGGETKCVFffNFR961LANNTGGffDSSGCYVEEGDGDNVTCICDHLTSFSILMSPDSPDPSSLLGILLDIISYVGV1021GFSILSLAACLVVEAVVffKSVTKNRTSYMR HTCIVNIAASLLVANTffFIVVAAIQDNRYI1081LCKTACVAATFFIHFFYLSVFFWMLTLGLMLFYRLVFILHETSRSTQKAIAFCLGYGCPL1141AISVITLGATQPREVYTRKNVCffLNWEDTK ALLAFAIPALIIVVVNITITIVVITKILRP1201SIGDKPCKQEKSSLFQISKSIGVLTPLLGLTffGFGLTTVFPGTNLVFHIIFAILNVFQGL1261FILLFGCLffDLKVQEALLNKFSLSRffSSQH SKSTSLGSSTPVFSMSSPISRRFNNLFGKT1321GTYNVSTPEATSSSLENSSSASSLLN<210>3<211>21<212>RNA<213>人工序列<400>3ccuuguguuc cauaucauat t<210>4<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><221>用于合成針對GPR116的發(fā)夾siRNA的寡聚核苷畫I序列
<400>4gtgatgcagg tgaatatgtt tcaagagaac atattcacct gcatcac<210>5<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><221>用于合成針對GPR116的發(fā)夾siRNA的寡聚核苷酸序列<400>5cactacgtcc acttatacaa agttctcttg tataagtgga cgtagtg<210>6<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><221>用于合成與哺乳動物無序列同源性的對照發(fā)夾siRNA的寡聚核苷酸序列<400>6gttctccgaa cgtgtcacgt ttcaagagaa cgtgacacgt tcggagaac<210>7<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><221>用于合成與哺乳動物無序列同源性的對照發(fā)夾siRNA的寡聚核苷酸序列<400>7caagaggctt gcacagtgca aagttctctt gcactgtgca agcctcttg<210>8<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><221>用于構(gòu)建針對GPR116的siRNA表達(dá)載體的人工合成寡核苷酸序列<400>8tgtgatgcag gtgaatatgt ttcaagagaa catattcacc tgcatcactt ttttc<210>9<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>用于構(gòu)建針對GPR116的siRNA表達(dá)載體的人工合成寡核苷酸序列<400>9acactacgtc cacttataca aagttctctt gtataagtgg acgtagtgaa aaaagagct<210>10<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><221>用于構(gòu)建針對與哺乳動物無序列同源性的對照siRNA表達(dá)載體的人工合成 寡核苷酸序列<400>10tgttctccga acgtgtcacg tttcaagaga acgtgacacg ttcggagaac ttttttc<210>11<211>61<212>DNA<213>人工序列<220><221>用于構(gòu)建針對與哺乳動物無序列同源性的對照siRNA表達(dá)載體的人工合成 寡核苷酸序列<400>11acaagaggct tgcacagtgc aaagttctct tgcactgtgc aagcctcttg aaaaaagagc t<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>用于PCR擴增GPR116全長的人工合成引物序列<400>12ggggtacctg gacaggccaa ccaactc<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><221>用于PCR擴增GPR116全長的人工合成引物序列<400>13ccctcgagtg agttgagcaa cgaagaag2權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人GPR116蛋白質(zhì)活性的多 肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第四0-4330位的核苷 酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO. 1 中從核苷酸第四0-4330位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQID NO. 2所示 的氨基酸序列的多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQID NO. 1中從核苷酸第 290-4330位的核苷酸序列。
4.一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA。
5.一種由權(quán)利要求4所述載體按照經(jīng)典生物學(xué)方法轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，包括原核 細(xì)胞和真核細(xì)胞。
6.一種用于PCR擴增GPRl 16全長的引物，具有如SEQ ID NO. 12和13所示的序列。
7.一種用于構(gòu)建針對GPR116的siRNA表達(dá)載體的人工合成寡核苷酸序列，具有如SEQ ID N0. 8和9所示的序列，和用于構(gòu)建針對與哺乳動物無序列同源性的對照siRNA表達(dá)載體 的人工合成寡核苷酸序列序列，具有如SEQ ID NO. 10和11所示序列。
8.一種用于合成針對GPRl 16的發(fā)夾siRNA的寡聚核苷酸序列，具有如SEQ ID N0. 4和 5所示序列，和用于合成與哺乳動物無序列同源性的對照發(fā)夾siRNA的寡聚核苷酸序列，具 有如SEQ ID N0. 6和7所示序列。
9.GPRl 16基因作為乳腺癌診斷標(biāo)志物的應(yīng)用，其特征在于惡性乳腺癌細(xì)胞中GPR116 強表達(dá)，而良性乳腺癌細(xì)胞中GPRl 16低表達(dá)，正常乳腺組織細(xì)胞中無GPRl 16表達(dá)。GPRl 16 表達(dá)強度的無、弱和強的定義用光密度數(shù)值劃分，把光密度數(shù)值小于0. 1的定義為無表達(dá)， 0. 2-0. 5之間為弱表達(dá)，大于0. 5的為強表達(dá)。由于GPR116的N末端能被水解酶水解成很 多片段，釋放進(jìn)入血液，因此病人的血清也可以作為利用GPR116診斷其乳腺癌測試樣品之ο
10.一種用于診斷和治療乳腺癌的生物芯片，其特征在于所述生物芯片的載體上含 有下列序列(I)-(iv)的序列或者它們的連續(xù)片段，(i)SEQID NO 1所示的編碼序列；(ii)與SEQID NO 1中的四0_4330位核苷酸序列至少有70%同源性的序列；(iii)在中度嚴(yán)緊條件下與SEQID NO :1中的四0_4330位核苷酸雜交的序列；(iv)具有與SEQID N0. 2所示氨基酸序列至少70%同源性的序列；
11.一種多核苷酸序列在制備治療乳腺癌的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的多核苷 酸是具有SEQ ID NO :1所示的編碼序列，或者與SEQ ID NO :1中的四0_4330位核苷酸序列 至少有70%同源性的序列，或者在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO 1的四0_4330位核苷酸 序列雜交的序列。
12.如權(quán)利要求12所述的一種多核苷酸序列在制備治療乳腺癌的藥物中的應(yīng)用，其特 征在于，所述的多核苷酸編碼具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽。
13.—種篩選用于治療或預(yù)防乳腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)使候選化合物與表達(dá)GPRl 16的細(xì)胞接觸。b)選出這樣的候選化合物，其中，與不存在該候選化合物時檢出的GPR116的表達(dá)水平 相比，該候選化合物降低GPR116的表達(dá)水平。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述細(xì)胞包括乳腺癌細(xì)胞。
15.一種篩選用于治療或預(yù)防乳腺癌的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a)使候選化合物與導(dǎo)入了載體的細(xì)胞接觸，其中所述載體含有GPR116的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū) 及在該轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的調(diào)控下表達(dá)的報告基因。b)測定所述報告基因的表達(dá)水平或活性。c)選擇這樣的候選化合物，該候選化合物降低所述報告基因的表達(dá)水平或活性。
16.用于乳腺癌檢測的試劑盒，其含有與(a)GPRl 16核酸序列或者(b)多肽結(jié)合的檢測 試齊LU
17.一種治療或預(yù)防乳腺癌的組合物，所述組合物含有藥物有效量的針對GPR116的多 核苷酸的反義多核苷酸或siRNA。
18.權(quán)利要求17的組合物，所述siRNA包含含有SEQID NO 3的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開一種分離的具有SEQ ID NO.1所示的GPR116基因，以及其編碼的SEQ ID NO.2所示的GPR116受體蛋白，以及所述GPR116基因或GPR116受體蛋白在制備治療或診斷乳腺癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明公開一種GPR116的反義基因或小干擾siRNA序列及其在制備治療或診斷乳腺癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還公開包含有效量的GPR116基因或GPR116受體蛋白或反義基因或小干擾siRNA序列的藥物組合物。
文檔編號A61K48/00GK102041259SQ20091019700
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月12日
發(fā)明者劉明耀, 唐小龍, 汪秀, 羅劍, 金蓉蓉 申請人:華東師范大學(xué)