專利名稱：一種構(gòu)建人體實(shí)質(zhì)臟器仿生三維血管網(wǎng)絡(luò)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種構(gòu)建人體實(shí)質(zhì)臟器仿生三維血管網(wǎng)絡(luò)的方法，屬于仿生臟器制作
技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在每年由于機(jī)械創(chuàng)傷、衰老以及各種疾病，大量患者需要進(jìn)行組織和器官移植。 僅以我國(guó)為例，每年大約有150萬(wàn)人因末期器官功能衰竭需要器官移植，但每年能夠使用
的器官數(shù)量不到i萬(wàn)，供求比例達(dá)到i : 150。因此，目前采用不同的途徑和方法去解決移
植用臟器數(shù)量嚴(yán)重短缺的問(wèn)題顯得十分迫切。 目前臨床常用的器官移植供體及缺點(diǎn)①異種組織器官移植，主要問(wèn)題在于移植 物與受體相容性差。②同種異體組織器官移植，主要問(wèn)題在于免疫排斥和供體有限。③自 體組織器官移植，主要問(wèn)題在于供體有限和功能紊亂。④人工合成組織代用品移植，主要問(wèn) 題在于異物反應(yīng)和感染。⑤組織工程器官，具有良好的組織相容性，可以大量制備，不需要 免疫抑制治療；主要問(wèn)題在于構(gòu)建組織工程臟器的技術(shù)尚不成熟，離大規(guī)模臨床運(yùn)用還有 一定距離。 20世紀(jì)80年代以來(lái)，組織工程學(xué)得到了長(zhǎng)足的進(jìn)步。在組織工程產(chǎn)生地美國(guó)，對(duì) 人體的皮膚、軟骨、骨、韌帶、肌肉、心臟瓣膜、肝、血管都進(jìn)行了體外培養(yǎng)分化工作，并取得 一定成果。根據(jù)組織工程構(gòu)建組織的結(jié)構(gòu)和功能不同，組織臟器構(gòu)建分為兩個(gè)領(lǐng)域①結(jié)構(gòu) 性組織和臟器的構(gòu)建此類組織臟器結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，如骨、軟骨、肌腱等。目前國(guó)內(nèi)外都已 有臨床應(yīng)用報(bào)告，并取得了良好社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。②相對(duì)于結(jié)構(gòu)性組織臟器的構(gòu)建，具 有代謝功能的組織和臟器的構(gòu)建(如心、肝、腎等的構(gòu)建)是組織工程的終極目標(biāo)，但是目 前需要攻克的難點(diǎn)較多。組織工程臟器的構(gòu)建有四個(gè)主要問(wèn)題需要解決(l)生物支架材 料的選擇和支架微觀宏觀結(jié)構(gòu)的構(gòu)建；(2)臟器血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建；(3)種子細(xì)胞的選擇和培 養(yǎng)；(4)細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境。 構(gòu)建能夠運(yùn)送氧氣、營(yíng)養(yǎng)和代謝產(chǎn)物的血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)是構(gòu)建大尺寸三維組織工程 臟器需要攻克的主要難點(diǎn)之一。為了能夠構(gòu)建出滿足大尺寸三維組織工程臟器的血管網(wǎng) 絡(luò)，有研究者通過(guò)體外構(gòu)建支架系統(tǒng)然后將支架系統(tǒng)移植入動(dòng)物體內(nèi)，借助于動(dòng)物的血管 生成形成毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)。但是這種血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法存在諸多缺點(diǎn)(l)需要手術(shù)實(shí)現(xiàn) 體內(nèi)植入；(2)周期長(zhǎng)；(3)支架系統(tǒng)厚度不能過(guò)大；(4)血管網(wǎng)絡(luò)內(nèi)血流量小，不能滿足組 織工程心臟、腎臟、肝臟要求。近年來(lái)，已有國(guó)外研究者利用立體打印機(jī)技術(shù)構(gòu)建空間組織 工程支架，并在其中預(yù)設(shè)微血管的生長(zhǎng)空間，但是這種技術(shù)的精度仍不能在微米級(jí)別達(dá)到 構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)的要求，同時(shí)也不能使微血管完全按其預(yù)設(shè)通道進(jìn)行生長(zhǎng)。隨著納米技術(shù)的 發(fā)展，現(xiàn)在已有研究者能夠通過(guò)在薄膜上利用激光預(yù)設(shè)通道精確導(dǎo)引細(xì)胞生長(zhǎng)方向，另有 研究者利用可降解納米纖維上引導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，以上構(gòu)建的血管網(wǎng)絡(luò)是規(guī)則的血管走 行而非仿生血管網(wǎng)絡(luò)，規(guī)則的血管走行較之仿生血管網(wǎng)絡(luò)血細(xì)胞在其管腔內(nèi)流動(dòng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生 較多的微型湍流，從而引起血栓形成幾率增高。因此，仿生血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將是今后組織工
3程臟器構(gòu)建的發(fā)展方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建人體實(shí)質(zhì)臟器仿生三維血管網(wǎng)絡(luò)的方法。 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種構(gòu)建人體實(shí)質(zhì)臟器仿生三維血
管網(wǎng)絡(luò)的方法，其特征在于，具體步驟為 第一步利用CT采集正常人肝臟心臟或者腎臟血管網(wǎng)絡(luò)圖像，對(duì)血管網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行三
維重建，將三維血管模型縮小，利用計(jì)算機(jī)將三維血管模型轉(zhuǎn)換成二維血管斷層圖，并引入
平面坐標(biāo)，對(duì)各個(gè)血管斷面進(jìn)行二維平面坐標(biāo)精確定位和血管直徑小測(cè)定； 第二步將可降解材料P(CL-EC)制備的膜片浸于纖維蛋白膠溶液中后陰干，制成
可降解膜片，并精確切割成與二維血管斷層圖相同面積，將膜片從上向下編號(hào)，膜片個(gè)數(shù)與
二維血管斷層圖的個(gè)數(shù)相同，膜片的總厚度與三維血管模型的厚度相同； 第三步根據(jù)不同層面的二維血管斷層的平面坐標(biāo)圖，利用計(jì)算機(jī)激光高精度打
孔機(jī)對(duì)可降解膜片進(jìn)行打孔得到血管預(yù)制孔； 第四步分離、培養(yǎng)轉(zhuǎn)EGFP基因C57BL/6J小鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞和野生型C57BL/6J 小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用脂質(zhì)體將SDF-1基因和VEGF基因轉(zhuǎn)染部分野生型C57BL/6J 小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 第五步將可降解膜片與野生型C57BL/6J小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，其中
中間編號(hào)的部分可降解膜片與轉(zhuǎn)染SDF-1基因和VEGF基因的野生型C57BL/6J小鼠骨髓間
充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，待細(xì)胞基本覆蓋膜片后，將材料按編號(hào)進(jìn)行堆壘，放入細(xì)胞培養(yǎng)器，1天
后，在血管預(yù)制孔中注入轉(zhuǎn)EGFP基因C57BL/6J小鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞，培養(yǎng)得到人體實(shí)質(zhì)臟器
仿生三維血管網(wǎng)絡(luò)。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下 1.經(jīng)文獻(xiàn)查新，本發(fā)明采用空間轉(zhuǎn)換定位技術(shù)來(lái)構(gòu)建組織工程肝臟三維血管網(wǎng) 絡(luò)、具有良好的創(chuàng)新性。經(jīng)過(guò)查詢專利數(shù)據(jù)庫(kù)，我們發(fā)現(xiàn)西安交通大學(xué)利用可降解膜巻曲折 疊進(jìn)行構(gòu)建的肝臟組織工程構(gòu)架(專利號(hào)CN 100369590-C)并不能完全對(duì)肝臟血管網(wǎng)絡(luò)進(jìn) 行仿生，且只能構(gòu)建較小尺度的組織工程肝臟。本發(fā)明涉及的方法能夠仿生構(gòu)建人體各實(shí) 質(zhì)臟器血管網(wǎng)絡(luò)且不受尺寸限制。仿生血管網(wǎng)絡(luò)血細(xì)胞在其管腔內(nèi)流動(dòng)時(shí)不會(huì)產(chǎn)生明顯的 湍流，從而降低血栓形成幾率，保證臟器的氧氣和營(yíng)養(yǎng)供給。 2.本發(fā)明采用多排高速螺旋CT采集的高精度正常人實(shí)質(zhì)臟器血管網(wǎng)絡(luò)圖形，并 進(jìn)行二維轉(zhuǎn)換，平面血管坐標(biāo)定位，這將保證臟器血管的精確仿生定位。激光打孔技術(shù)的引 入，將保證膜片材料的精確打孔和三維血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)原。高精度的定位技術(shù)將為今后組織 工程臟器的構(gòu)建提供了形態(tài)學(xué)上的保證。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例來(lái)具體說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例 1.采集血管圖像，建立平面坐標(biāo)圖復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院影像科已有64排CT 增強(qiáng)掃描采集的不同造影劑時(shí)相的人體肝臟血管CT斷層圖像。利用計(jì)算機(jī)對(duì)這些平面斷層圖像進(jìn)行三維重建。按一定比例將肝血管模型縮小入50cmX 50cmX 50cm的區(qū)域內(nèi)。利用 相應(yīng)軟件對(duì)圖像中各血管進(jìn)行空間定位，并轉(zhuǎn)換成50cmX50cm平面血管斷層圖。對(duì)平面血 管斷層圖引入平面坐標(biāo)(X， Y)，對(duì)各個(gè)血管斷面進(jìn)行二維平面坐標(biāo)精確定位和血管管徑精 確測(cè)定。按12.5 : 1的比例縮小平面，形成4cmX4cm的平面血管斷層圖，此時(shí)高4cm的三 維模型，按層高O. 05cm/層，將有80層平面血管斷層圖，對(duì)其從上向下進(jìn)行編號(hào)1，2，3…… 80。 2.可降解三維支架斷層膜片的制備將可降解材料P(CL-EC)(聚己內(nèi)酯-碳酸亞 乙酯)和纖維蛋白膠壓制成厚0. 05cm可降解膜片，并精確切割成4. 0cmX4. OcmXO. 05cm 大小。將膜片從上向下編l-80號(hào)。 3.膜片精確激光打孔將編好號(hào)碼的可降解膜片固定在特制的固定架上，置于計(jì) 算機(jī)激光打孔機(jī)操作平臺(tái)，往計(jì)算機(jī)輸入不同層面的血管斷層的平面坐標(biāo)圖及管徑，利用 計(jì)算機(jī)激光打孔機(jī)對(duì)可降解膜片進(jìn)行程序設(shè)定打孔。打孔完成后送掃描電鏡檢測(cè)，對(duì)孔徑、 位置不合要求編號(hào)的可降解膜片進(jìn)行重新制備。
4.血管內(nèi)皮祖細(xì)胞分離、體外擴(kuò)增、純化 (1)5只6-8周齡增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠，處死取骨髓，用GIBCO公司生產(chǎn)的D-Hanks液20ml稀釋。將 稀釋之血液按l : 2的體積比置于淋巴細(xì)胞分離液的上方。水平離心機(jī)以2000rpm去閘離 心20分鐘。小心吸出單核細(xì)胞層，用5倍體積的M199培養(yǎng)液洗滌2次，培養(yǎng)液為80vo1 % GIBCO公司生產(chǎn)的M199培養(yǎng)液+20vol %胎牛血清(FBS)，再加入終濃度為20ng/mL的 VEGF(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)以及終濃度為2ng/mL的bFGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，并 分別離心，2000rpm和1500rpm各8分鐘，棄上清，重懸。 (2)細(xì)胞沉淀與培養(yǎng)液混懸后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1X107L，移至 25cm2CELLBIND培養(yǎng)瓶，置于37°C 、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)第3天換液，用D-Hanks液 洗掉未貼壁的細(xì)胞，加入新培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。以后每3天換一次液。用倒置顯微鏡觀察細(xì) 胞形態(tài)。 (3) —周后當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到107收集貼壁細(xì)胞予以0034+/^0133+磁珠篩選。調(diào)節(jié) 細(xì)胞濃度到10780ul，加入20ul單抗標(biāo)記磁珠，6。C放置15min。 (pH7. 4)PBS洗滌，500rpm 離心10min，用PBS調(diào)整體積為500ul。過(guò)柱、洗滌、洗脫陰性細(xì)胞；將柱子脫離磁場(chǎng)，獲取陽(yáng) 性細(xì)胞。 5.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng) (1)取野生型C57BL/6J小鼠，與GIBCO公司生產(chǎn)的DMEM培養(yǎng)液(含16%胎牛血 清)混合后，鋪于6ml的淋巴細(xì)胞分離液(1.073g/l)之上。離心，取中層單個(gè)核細(xì)胞，置于 含DMEM液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37t:，含5% C02飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(2) 24h后首次換液，以后每5天換液一次。經(jīng)不斷增殖培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)達(dá)107/瓶，
細(xì)胞總數(shù)io8。 (3)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，自第3代至第6代，采用流式細(xì)胞儀對(duì)MSCs表面抗原 CD29、 CD44、 CD45、 HLA-DR的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)篩選。 (4)取第三代細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天將MSCs接種于六孔板中，其中一孔為空白對(duì)照，細(xì) 胞密度為40-60%。稀釋10iiL Lipofectin2000(脂質(zhì)體，Invitrogen公司生產(chǎn))試劑于100 P L無(wú)血清、無(wú)抗菌素的DMEM(GIBCO公司生產(chǎn))培養(yǎng)基?；靹蚝笫覝仂o置5min洞時(shí)稀 釋1-2 ii g待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA(pcDNA3. 1-VEGF/SFD-1 Invitrogen公司構(gòu)建)于100 ii L無(wú)血 清、無(wú)抗菌素的DMEM(GIBCO公司)培養(yǎng)基。混勻后室溫靜置5min ;混合兩種溶液，室溫靜 置25-30min。然后再加入800 y L無(wú)血清，無(wú)抗菌素的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)，棄掉六 孔板中的舊培養(yǎng)基，用2mL無(wú)血清、無(wú)抗菌素的DMEM(GIBC0公司)培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次；將 Lipofectin試劑-DNA混合物lmL覆蓋細(xì)胞，撫育6h ;吸出轉(zhuǎn)染液，加入含10%血清(GIBCO 公司)正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基DMEM， (GIBCO公司)37"培養(yǎng)；G418 (Invitrogen公司)篩選陽(yáng)性細(xì) 胞。Western Blot， RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后VEGF， SDF-1蛋白和mRNA的表達(dá)。
5.三維血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將可降解膜片與野生型C57BL/6J小鼠的骨髓間充質(zhì)干 細(xì)胞共培養(yǎng)，(GIBC0公司DMEM培養(yǎng)基)，其中21-60編號(hào)的可降解膜片與轉(zhuǎn)染SDF-1/VEGF 的野生型C57BL/6J小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)(GIBC0公司DMEM培養(yǎng)基)，待細(xì)胞基 本覆蓋膜片后，將材料按編號(hào)進(jìn)行堆壘，放入細(xì)胞培養(yǎng)器，1天后，在血管預(yù)制孔中注入轉(zhuǎn) EGFP基因C57BL/6J小鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞，培養(yǎng)7天。 6.血管網(wǎng)絡(luò)的觀測(cè)采用上海同步輻射光源實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，在7d，14d，30d，45d，60d利 用同步輻射光衍射成像技術(shù)對(duì)新生的微血管網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè)；在觀測(cè)期結(jié)束后用常規(guī)切 片染色和免疫組化(CD31，VI11因子)對(duì)血管網(wǎng)絡(luò)的形成情況進(jìn)行觀察。
權(quán)利要求
一種構(gòu)建人體實(shí)質(zhì)臟器仿生三維血管網(wǎng)絡(luò)的方法，其特征在于，具體步驟為第一步利用CT采集正常人肝臟心臟或者腎臟血管網(wǎng)絡(luò)圖像，對(duì)血管網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行三維重建，將三維血管模型縮小，利用計(jì)算機(jī)將三維血管模型轉(zhuǎn)換成二維血管斷層圖，并引入平面坐標(biāo)，對(duì)各個(gè)血管斷面進(jìn)行二維平面坐標(biāo)精確定位和血管直徑φ測(cè)定；第二步將可降解材料P(CL-EC)制備的膜片浸于纖維蛋白膠溶液中后陰干，制成可降解膜片，并精確切割成與二維血管斷層圖相同面積，將膜片從上向下編號(hào)，膜片個(gè)數(shù)與二維血管斷層圖的個(gè)數(shù)相同，膜片的總厚度與三維血管模型的厚度相同；第三步根據(jù)不同層面的二維血管斷層的平面坐標(biāo)圖，利用計(jì)算機(jī)激光高精度打孔機(jī)對(duì)可降解膜片進(jìn)行打孔得到血管預(yù)制孔；第四步分離、培養(yǎng)轉(zhuǎn)EGFP基因C57BL/6J小鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞和野生型C57BL/6J小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用脂質(zhì)體將SDF-1基因和VEGF基因轉(zhuǎn)染部分野生型C57BL/6J小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；第五步將可降解膜片與野生型C57BL/6J小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，其中中間編號(hào)的部分可降解膜片與轉(zhuǎn)染SDF-1基因和VEGF基因的野生型C57BL/6J小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，待細(xì)胞基本覆蓋膜片后，將材料按編號(hào)進(jìn)行堆壘，放入細(xì)胞培養(yǎng)器，1天后，在血管預(yù)制孔中注入轉(zhuǎn)EGFP基因C57BL/6J小鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞，培養(yǎng)得到人體實(shí)質(zhì)臟器仿生三維血管網(wǎng)絡(luò)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種構(gòu)建人體實(shí)質(zhì)臟器仿生三維血管網(wǎng)絡(luò)的方法，其特征在于，具體步驟為采集正常人肝臟心臟或者腎臟血管網(wǎng)絡(luò)圖像，將三維血管模型轉(zhuǎn)換成二維血管斷層圖；將P(CL-EC)置于纖維蛋白膠中間，壓制成膜片；利用計(jì)算機(jī)激光高精度打孔機(jī)對(duì)可降解膜片進(jìn)行打孔；將可降解膜片與野生型C57BL/6J小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，其中中間編號(hào)的可降解膜片與轉(zhuǎn)染SDF-1/VEGF的野生型C57BL/6J小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，待細(xì)胞基本覆蓋膜片后，將材料按編號(hào)進(jìn)行堆壘，在血管預(yù)制孔中注入轉(zhuǎn)EGFP基因C57BL/6J小鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能夠仿生構(gòu)建人體各實(shí)質(zhì)臟器血管網(wǎng)絡(luò)且不受尺寸限制。
文檔編號(hào)A61F2/06GK101751696SQ200910201588
公開日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者凌志青, 劉震杰, 史振宇, 張祥滿, 符偉國(guó) 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院