專利名稱:增強抗原免疫原性以及天然和獲得性免疫的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及應(yīng)用從靈芝(Ga"0(ie/7wa /wcWw附,G /wc/(iw附或G 中分離的一種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(flingal immunomodulatory protein, FIP) LZ-8 (或FIP-gts)促進樹突狀細胞(DCs)成熟的用途。本發(fā)明還涉及利 用LZ-8誘導(dǎo)DCs促炎性細胞因子和趨化因子的生成。本發(fā)明更涉及利用 LZ-8作為輔助劑促進DCs誘導(dǎo)的T細胞增殖。
背景技術(shù):
樹突狀細胞(DCs)是專職的抗原提呈細胞(antigen-presenting cell), 作為連接天然和獲得性免疫的橋梁(Steinman, R. M. Nat Med 2007;13:1155-1159.)。 DCs是異源性的,但其所有的亞群具有固有的協(xié)同 免疫調(diào)節(jié)功能(Wu, L. et al, Immunity 2007; 26:741-750; Iwasaki, A. Ann Rev Immunol 2007; 25:381-418.)。當(dāng)暴露于特定的抗原或環(huán)境時,它們能 夠引導(dǎo)天然T細胞朝向免疫原性或免疫耐受性的方向(Abbas, A.K. et al., Nat Immunol 2005; 6:227-228.)。當(dāng)通過炎性介質(zhì)或微生物致病體刺激時, DCs在遷移到淋巴的過程中變成熟,這顯著地增強了 DCs激活抗原專一 性T細胞(antigen-specific T cells)的能力(Reis e Sousa, C Nat Rev Immunol 2006;6:476-483.)。 Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)在天然識別病 原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)禾口啟動 DCs免疫應(yīng)答中發(fā)揮著主要作用(Lee, M.S. et al, Ann Rev Biochem 2007; 76:13.1-13.34.)。 一旦TLR刺激,成熟DCs中II類MHC和協(xié)同刺激分子, 尤其是CD40、 CD80和CD86的表達就被上調(diào)。所有這些分子對啟動T 細胞都是重要的(Kawai, T. et al, Semin Immunol 2007; 19:24-32.)。因DCs 在免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用,目前正在開發(fā)DCs來治療癌癥、變態(tài)反應(yīng)和病毒感染,并作為有效新疫苗的輔助劑來預(yù)防或治療癌癥和感染性疾病
(Banchereau, J. et al, Nat Rev Immunol 2005; 5:296-306.; Steinman, R. M. et al, Nature 2007; 449:419-426.)。促進DC激活的物質(zhì)能夠潛在應(yīng)用于免疫 療法和疫苗接種。
從非褶菌目(々7/^//0/ /zora/^)、多數(shù)被稱為多孔菌中已經(jīng)分離出大量 有生物活性的天然物質(zhì)。多孔菌是屬于擔(dān)子菌亞門(; /^/ww5awfew^coto) (擔(dān)子菌)的一大類陸生真菌,它們與子囊菌門(^scom^oto)的一些種 一起形成了藥理活性物質(zhì)的主要來源(Zjawiony, J. K. et al, J Nat Prod 2004; 67:300-310.).靈芝(Gaw6^r應(yīng)/腦'(i訓(xùn)(Leyss. ex Fr.) Karst. (Ling-Zhi or Reishi))是一種有名的藥用真菌,屬于多孔菌科、菌褶少的擔(dān)子菌類真菌。 在亞洲,這些菇類的醫(yī)藥性質(zhì),包括許多促進健康和治療的效用,已被認 知有多個世紀。已經(jīng)積累了許多關(guān)于靈芝(G/M"V/Wm)在治療多種疾病, 比如腫瘤、癌轉(zhuǎn)移、高血壓、肝炎、胃炎、關(guān)節(jié)炎、支氣管炎、哮喘、厭 食和免疫紊亂中的醫(yī)藥用途的證據(jù)(Lin, Z., Acta Pharmacol Sin 2004; 25:1387-1395; Lin, Z.J Pharmacol Sci 2005; 99:144-153.)。近來,研究人員 已經(jīng)研究了從子實體、純培養(yǎng)菌體和培養(yǎng)濾液(培養(yǎng)液)中提取或純化的 生物活性組分的生物學(xué)作用(Shiao, M.S., The Chem Record 2003; 3:172-180.)。然而,靈芝的醫(yī)藥用途仍需要通過更另人信服的證據(jù)來支持。
從靈芝的擔(dān)子果和菌絲體中分離出的藥用活性化合物包括多糖、三蔽 類化合物、蛋白質(zhì)、凝集素、甾醇、生物堿、核苷酸、內(nèi)酯和脂肪酸(Zhou, X. et al, Phytochemistry 2006; 67:1985-2001.)。許多研究已經(jīng)表明多糖是靈 芝的主要活性成分(Hsu,H.Y.etal, J Immunol 2004; 173:5989-5999.)。此 外, 一些研究已經(jīng)證實靈芝中的天然三萜類化合物具有抗炎、抗肝炎和抗 癌活性(Wang, G. et al, Int Immunopharmacol 2007; 7:864-870.)。在靈芝的 研究中,與多糖和三萜類化合物相比,沒有多少研究著重于蛋白功能的研 究(Jeurink, P. V. et al, Int Immunopharmacol 2008; 8:1124-1133.)。已從靈芝 菌絲體中分離出一種分子量為12.4kDa、命名為LZ-8的免疫調(diào)節(jié)蛋白 (Kino, K. et al, J Biol Chem 1989; 264:472-478.)。從另一個種松杉靈芝(G 中也分離到了該蛋白,命名為FIP-gts(Lin,W.H. etal,JBiolChem1997; 272:20044-20048.)。 一些研究已經(jīng)表明LZ-8對自身免疫性和移植具 有免疫調(diào)節(jié)作用,并且LZ-8作為促細胞分裂劑來激活T細胞(Hsu, H.Y. et al., J Cell Physiol 2008; 215:15-26.)。由于DCs在免疫系統(tǒng)中起著重要的作 用,因此靈芝對DCs的作用己被研究過,但也僅限多糖被鑒定過(Lin,Y. L. et al, Mol Pharmacol 2006; 70:637-644.)。因此,還沒有報道揭示LZ-8 蛋白對DCs的作用。
圖1表示骨髓源性樹突狀細胞(BMDCs)在LZ-8刺激后細胞因子和 趨化因子的生成。(A)劑量響應(yīng)曲線。BMDCs用不同劑量的LZ-8培養(yǎng)6 小時,最后在布雷菲德菌素A的存在下培養(yǎng)4小時。通過流式細胞儀測定 生成的TNFa的CDllc+細胞的百分含量。(B和C) BMDCs用不同劑量的 LZ-8培養(yǎng)24小時(6小時用于TNFa),收集上清液,用ELISA法測定(B) TNFa、 IL-la、 IL-ip、 IL-2、 IL畫6和IL-12, (C) MCP-1、 MIP畫la、 MIP-ip 和RANTES。誤差線表示三份樣品的士SD。所有的數(shù)據(jù)表示三次獨立的實 驗。
圖2表示LZ-8蛋白誘導(dǎo)的BMDC活性并非由污染所造成。BMDCs 用LPS(20ng/ml)或LZ-8(5嗎/ml)培養(yǎng)6小時,最后在布雷菲德菌素A的存 在下培養(yǎng)4小時。通過流式細胞儀測定生成TNFa的CDllc+細胞的百分 含量,并示于區(qū)域標記上方。(A)檢驗LPS、 LZ-8和背景對照組。(B) 在將LPS和LZ-8加入BMDCs之前,用多粘菌素(polymyxin) B(5|ag/ml, Sigma-Aldrich)處理30分鐘。(C)處理之前用蛋白酶K處理LZ國8和LPS 1 小時。(D)處理前將LZ-8和LPS煮沸20和50分鐘。數(shù)據(jù)表示三次獨立 的實驗。
圖3表示LZ-8對BMDC成熟的促進。(A)用LZ-8(5pg/ml)(黑線) 處理或不處理(暗灰線)BMDCs 16小時。淺灰線表示用同類型匹配的對 照抗體染色。用流式細胞儀測定DC的成熟。將細胞用對I-Ab、 CD86、 CD80、 CD40、 CD54和CD119特異的單克隆抗體染色。(B)用 LZ-8(5pg/ml)、對照溶液(LZ-8溶液的背景)和LPS(20 ng/ml)對BMDCs培養(yǎng)或不處理16小時。通過在4。C (背景,灰線)和37。C (黑線)下右 旋糖苷-FITC的攝取來測定DCs的胞吞作用。區(qū)域標記上方表示 DeXtran-FITC+細胞的百分比。所示數(shù)據(jù)為在CDllc+細胞上的篩選。所有
數(shù)據(jù)表示三次獨立的實驗。
圖4表示LZ-8處理的BMDCs對T細胞的激活。(A)從OT-I/OT-II 小鼠中分離出CD8+/CD4+ T細胞,并與LZ-8 (5 pg/ml)-和LPS (20 ng/ml)-激活的BMDCs以DC:T細胞數(shù)為2:l、在OVA257.264/OVA323-339肽(1 |Lig/ml)
的存在下一起培養(yǎng)72小時。在左面,通過[SH]胸腺嘧啶核苷的結(jié)合測定T 細胞的增殖。在右面,通過ELISA法測定IFN-y的生成。(B)經(jīng)足墊注 射僅混有IFA或混有IFA + LZ-8 (10jig)的0¥八323-339肽(10嗎)對C57BL/6 小鼠進行免疫。IO天后收集排出的淋巴結(jié)細胞,在96孔板中用不同濃度 的0¥^23.339肽培養(yǎng)3天。通過[3印胸腺嘧啶核苷的結(jié)合測定T細胞的增 殖。誤差線表示三份樣本士 SD。所有數(shù)據(jù)表示三次獨立的實驗。
圖5表示通過LZ-8對BMDCs的刺激而誘導(dǎo)的MAPKs和NF-kB激 活。收獲BMDCs、使其饑餓、用LZ-8(10 jag/ml)處理,然后在有效的時間 點將其溶解。將樣品分離在SDS-PAGE凝膠上,轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜, 然后用蛋白印跡法(westernblotting)分析。分別用抗-磷酸化特異抗體和 抗-蛋白抗體檢測磷酸化和未磷酸化的JNK、 ERK和p38MAPK蛋白。用 抗-IkB抗體測定IkB的降解。所示數(shù)據(jù)表示三次獨立的實驗。
圖6表示LZ-8對巨噬細胞的激活。將RAW264.7細胞用LZ-8(5pg/ml) 和LPS(100ng/ml)培養(yǎng)16小時。收集上清液,用ELISA法測定TNFa的
生成。所示數(shù)據(jù)表示兩次獨立的實驗。
圖7表示LZ-8對人單核細胞源性樹突狀細胞(monocyte-derived DCs, MoDCs)的激活。將未成熟的MoDCs用LPS(lug/ml)、 poly(I:C) (pIC, 25 ug/ml)或各種濃度的LZ-8處理48小時。(A)將細胞用CD80、 CD86 (Immunotech)和CD83 (BD PharMingen)的抗體染色,然后用流式細胞儀分 析。數(shù)據(jù)表示三次獨立的實驗。(B)收集培養(yǎng)上清液,用人CBA(cytometric bead array)試劑盒分析細胞因子的生成。誤差線表示三次獨立實驗的標準
7差。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了 一種LZ-8蛋白或LZ-8處理的樹突狀細胞通過激活樹突 狀細胞(dendritic cells, DCs)和巨噬細胞來增強天然和獲得性免疫的用 途。本發(fā)明還提供了一種LZ-8蛋白融合抗原(LZ-8 protein-fUsed antigen) 在增強抗原的免疫原性的用途。
本發(fā)明另提供一個組合物,其包含LZ-8蛋白處理的樹突狀細胞。
具體實施例方式
DCs在啟動和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中扮演著重要角色,并作為連接天然和獲 得性免疫的橋梁。成熟的DCs能夠吸引、干擾和激活天然T細胞從而啟 動初級免疫應(yīng)答。DCs還能夠直接激活NK細胞,并能在遭遇病毒病原體 時生成大量的干擾素。本發(fā)明提供了一種LZ-8蛋白或LZ-8處理的樹突狀 細胞通過激活DCs和巨噬細胞增強天然和獲得性免疫的用途。通過給予 LZ-8蛋白,DCs被激活并產(chǎn)生細胞因子和趨化因子。
之前的研究已經(jīng)證實了LZ-8的免疫調(diào)節(jié)活性。然而,還不清楚LZ-8 蛋白是否對DCs發(fā)揮了任何作用。本發(fā)明揭示了 LZ-8蛋白可以激活DCs 和巨噬細胞。因此,在本發(fā)明中,介紹了通過給予LZ-8增強天然和獲得 性免疫。
LZ-8蛋白通過促進DCs激活和成熟來調(diào)節(jié)獲得性免疫。因為促炎因 子的生成是DC激活的主要證據(jù),所以檢測了 LZ-8在骨髓源性DC (BMDCs)中TNF的誘導(dǎo)。用LZ-8處理BMDCs后,生成的TNF與劑 量的關(guān)系表明LZ-8能夠激活DCs (圖1A)。除TNF之外,細胞內(nèi)的IL-6 和IL-12p40也是可檢測的。LZ-8處理后對其他細胞因子也進行了檢測。 如圖IB所示,LZ-8處理的BMDCs顯著地分泌TNFa、 IL-la、 IL-ip、 IL-2、 IL-6和IL-12。趨化因子比如單核細胞趨化蛋白Kmonocyte chemoattractant protein 1, MCP-1)、巨噬細胞炎性蛋白la (macrophage inflammatory protein la, MIP-la)、巨噬細胞炎性蛋白l卩(macrophage inflammatory protein-l卩,MIP-ip)的生成、以及激活后的調(diào)制、正常T細胞的表達和分泌 (RANTES),也通過LZ-8刺激的BMDCs發(fā)生(圖1C)。本發(fā)明中的LZ國8 蛋白激活了 DCs從而分泌細胞因子和趨化因子,并增強了獲得性免疫應(yīng)答。
DCs的成熟是其調(diào)節(jié)功能的一個關(guān)鍵步驟。檢測了 LZ-8刺激后 BMDCs的成熟狀態(tài)。LZ-8通過上調(diào)II類MHC、 CD40、 CD54 (ICAM-1)、 CD80、 CD86的表達,以及下調(diào)CD119 (IFN-y受體)的表達,促進了 BMDC 的成熟(圖3A)。 DC的激活還伴有大分子胞吞作用的降低。LZ-8的處理 降低了 BMDC對FITC-標記的右旋糖苷的攝取(圖3B)。這些結(jié)果證明本 發(fā)明中的LZ-8能夠激活DCs并促進DC成熟。
本發(fā)明證明了LZ-8刺激的BMDCs在體內(nèi)體外均能誘導(dǎo)抗原特異性T 細胞的激活,同時也支持LZ-8能相對增強DC成熟的結(jié)果。誘導(dǎo)抗原特 異性T細胞的激活是成熟DCs的主要功能。LZ-8激活的BMDCs促進了 T 細胞增殖(圖4A,上面)。被以LZ-8刺激的BMDCs激活所有T細胞, 在其刺激下生成更多的IFN-y (圖4A,下面)。本發(fā)明還表明,在亞單位 免疫模型中,從LZ-8免疫小鼠中分離的T細胞,其在通過LZ-8的處理下, 其增殖活性增強(圖4B)。因此,基于這種發(fā)現(xiàn),本發(fā)明進一步提供了用 于增強抗原免疫原性的用途,包括給予受試者LZ-8蛋白融合抗原。本文 使用的LZ-8蛋白作為輔助劑增強受試者的免疫應(yīng)答。在優(yōu)選實施例中, LZ-8蛋白融合抗原經(jīng)注射給予。
為了理解生物機制,本發(fā)明還提供了涉及LZ-8對BMDC激活的路徑。 促分裂原活化蛋白^敫酶(mitogen-activated protein kinase, MAPKs)信號 傳輸路徑和NF-kB路徑被證實涉及DCs的激活和成熟。LZ-8蛋白誘導(dǎo) MAPKs的激活(圖5)。 MAPKs信號傳輸路徑包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶 (extracellular signal-regulated kinases, ERK ) 、 JUN N畫4瑞激酶(JUN N-terminal kinases, JNK)和應(yīng)激活化蛋白激酶2A ( stress-activated protein kinase 2A) (p38)。
本發(fā)明的用途不僅是通過促進DCs的激活和成熟增強天然和獲得性免疫,而且還通過誘導(dǎo)巨噬細胞的激活增強天然免疫。將巨噬細胞
RAW264.7 (RAW)細胞用LZ-8和LPS培養(yǎng),用ELISA法測定TNF 的生 成。如圖所示,LZ-8促進了RAW細胞中TNF的分泌。結(jié)果表明LZ-8 能夠激活巨噬細胞并增強天然免疫。
本發(fā)明已經(jīng)證實了LZ-8對小鼠DCs的影響。此外,由于人DCs與小 鼠DCs相比表現(xiàn)出一些不同的特征,所以還用LZ-8來處理人單核細胞源 性DCs (MoDCs),并觀察細胞集落。本發(fā)明表明LZ-8增強了LZ-8處理 過的MoDCs中CD80、 CD83和CD86的表達(圖7A)。通過LZ-8的刺
激誘導(dǎo)了 MoDCs中細胞因子的生成(圖7B)。細胞因子包括TNFa、IFN-Y、 IL-2和IL-6。數(shù)據(jù)證實了 LZ-8能夠激活人DCs,這與在小鼠DCs上的作 用一致。因此,本發(fā)明還提供了LZ-8在哺乳動物(比如人)中以DC做免疫
治療上的應(yīng)用。
本發(fā)明的LZ-8蛋白分離自靈芝,或者通過重組蛋白技術(shù)在宿主細胞 中制得。宿主細胞可以是酵母或細菌系統(tǒng)。
所述的宿主細胞是釀酒酵母"acc/zaraw少cas ce^WWae)、畢赤酵母 (P油'a戸ton、)、漢遜酵母(//薩謂/" po/,o—")、產(chǎn)阮假絲酵母 (Om^fo W/fc)、波氏假絲酵母(Ca"fife/a 6w'Am7)、麥芽糖假絲酵母 (C朋AWa ma/tosa)、乳酸克魯維斯酵母(K/i(yveramyc" /octo)、耶羅維 亞酵母(!2wTovWa酵母菌(5b/2麗w7/o呼cas oc"We齒/^)、粟 酒裂殖酵母(6b/^zoMcc譜w戸s/ ow6e)、球擬酵母(7brM/op^)、爿削/a "(iew/w/vonms1或曲霉菌(Ape^g7'〃MS) ". wV/w/<ms, vlA j. )、瑞氏木霉(7Hc。(ienwa rease/)。
本發(fā)明中的LZ-8還能在體外激活人MoDCs。因此,本發(fā)明提供了一 種LZ-8體外促進BMDC成熟和功能的用途,以及LZ-8處理的樹突狀細 胞促進BMDC成熟和功能。本發(fā)明能夠應(yīng)用于用于腫瘤治療和感染性疾 病的基于DC的疫苗。
因此,本發(fā)明進一步結(jié)合樹突狀細胞疫苗的應(yīng)用,可應(yīng)用于癌癥的治療。本發(fā)明另提供一個組合物,其包含LZ-8蛋白處理的樹突狀細胞,此
組合物可促進T細胞的增生與活化。
下面的實施例并非用來限制本發(fā)明,而僅用來表示本發(fā)明的幾個方面 和特點。
材料和方法
小鼠和DC培養(yǎng)
如前所述(Chu, C. L., and C. A. Lowell, J Immunol 2005; 175:2880-2889.),從C57BL/6小鼠(國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center),臺北,臺灣)分離的骨髓中制備小鼠DCs。 OT-I禾fl OT-II TCR轉(zhuǎn)基因小鼠由Clifford Lowell博士 (UCSF, CA)提供。所有的動物根 據(jù)實驗動物管理及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)核準的協(xié)議詞養(yǎng)在NHRI (臺灣)的柵欄設(shè)施中。
重組LZ-8的制備
在釀酒酵母(S. cwev&'a)中克隆和表達靈芝的LZ-8。然后將表達LZ-8 的細胞(或空載體作為對照)離心,并經(jīng)過細胞破碎儀。離心溶菌產(chǎn)物, 并將上清液通過0.2|im的真空過濾器和分子篩,獲得10kDa和100kDa之 間的蛋白。進一步利用具有Superdex75柱(GEHealthcare)的快速蛋白液相 色譜(Fast protein liquid chromatography, FPLC)純化濾液。經(jīng)FPLC測 定純度為98%。
人MoDCs的制備
如前所述(Chu,C.L.etal.E J Immunol 2008; 38:166-173.),從外周血 單核細胞(PBMCs)中生成MoDCs。簡言之,用Ficoll-Paque通過密度梯 度離心法富集PBMCs,并在AIM-V培養(yǎng)基(Invitrogen公司)中37。C培 養(yǎng)2小時,然后將粘附的細胞培養(yǎng)在含2%加熱滅活的自體同源血漿、1000 U/mL人IL-4 (Strathmann Biotec AG)和500 U/mL粒細胞巨噬細胞集落 朿U激因子(granulocyte- macrophage-colony-stimulating factor) (Leukomax;
實施例Novartis International AG,瑞士巴塞爾)的X-VIV015培養(yǎng)基中。第7天收 集松散粘附或漂浮的細胞作為未成熟的DCs。
統(tǒng)計學(xué)分析
利用二樣本等方差二尾分布Student's t-檢驗,測定LZ-8處理組與對 照組相比對細胞因子和趨化因子的生成以及T細胞增殖的顯著性影響。誤 差線表示三樣本的平均值士標準差(mean ±SD)。 p值小于0.05被認為具 有顯著性差異。
實施例l
LZ-8刺激BMDCs生成細胞因子和趨化因子
為了測定LZ-8的作用,檢測了 BMDCs中TNF 的誘導(dǎo)。LZ-8處理 后BMDCs的TNFoi生成與劑量相關(guān)(圖1A)表明LZ-8能夠潛在地激活 DCs。除了TNFa夕卜,細胞內(nèi)的IL-6禾口 IL-12 p40也是可檢測的(數(shù)據(jù)未 示)。我們利用ELISA法定量檢測了由LZ-8處理過的BMDCs分泌的細胞 因子。如圖IB所示,LZ-8處理過的BMDCs顯著分泌TNFa、IL-la、IL-l卩、 IL-2、 IL-6和IL-12。我們還檢測了趨化因子的生成,LZ-8剌激的BMDCs 生成MCP-1、 MIP-la、 MIP-1卩和RANTES (圖IC)。
實施例2
由無污染的LZ-8蛋白激活BMDCs
本文使用的LZ-8蛋白來自酵母表達的重組蛋白。為了排除在LZ-8制 備過程中酵母成分污染的可能性,從表達空載體的酵母中制備背景溶液作 為對照。如圖2A所示,對照溶液對BMDCs TNFa的生成沒有影響,排除 了污染的影響。此外,多粘菌素B (PolymyxinB)未顯著地抑制LZ-8的 活性,表明DC的激活不是因為內(nèi)毒素的污染(圖2B)。
此外,在LZ-8蛋白處理BMDCs之前,通過用蛋白酶K對其進行37 °C下1小時或100°C下加熱25和50分鐘使其失活。如圖2C和2D所示, 用蛋白酶K消化和加熱滅活的LZ-8喪失了刺激BMDCs的能力,提示該 活性源自LZ-8蛋白本身。這些數(shù)據(jù)證明LZ-8對DCs的刺激活性不是由酵母成分的污染引起的。
實施例3
LZ-8促進BMDC成熟
通過流式細胞儀檢測了 LZ-8刺激后BMDCs的成熟狀態(tài)。將培養(yǎng)6 天的BMDCs用LZ-8(5ng/ml)處理16小時。然后,將細胞用抗-CD16/CD32 單克隆抗體(mAb) 2.4G2(BDPharmingen)阻斷,用針對CDllc、 CD40、 CD54、 CD80、 CD86、 CD119和I-Ab (Biolegend)的mAbs染色,并用流式 細胞儀分析。如圖3A所示,LZ-8上調(diào)II類MHC、 CD40、 CD54 (ICAM-1)、 CD80和CD86的表達,并下調(diào)CD119 (IFN- 受體)的表達。
此外,已知DC的激活伴有大分子胞吞作用的降低。因此,還檢測了 BMDCs的胞吞作用。將未處理過的或處理過的BMDCs用200pg/ml Dextran-FITC (M.W.~77 kD, Sigma-Aldrich)在4°C或37°C下培養(yǎng)1小時。 用冷PBS洗滌細胞,用抗-CDllc單克隆抗體對其染色,然后通過流式細 胞儀分析。如圖3B所示,LZ-8的處理減少了 BMDCs對FITC-標記的右 旋糖苷的攝取。 一致的結(jié)果是,對照溶液未改變BMDCs的胞吞作用。這 些結(jié)果證明LZ-8能夠激活DCs并促進DC成熟。
實施例4
LZ-8處理的DCs誘導(dǎo)T細胞的激活
誘導(dǎo)抗原特異性T細胞的激活是成熟DCs的主要功能。從OT-I或 OT-IITCR轉(zhuǎn)基因小鼠中分離T細胞,將細胞與LZ-8-處理過的OVA257.264 (OVAw)-或OVA257.264 (OVAp2)-加BMDCs —起培養(yǎng)72小時。然后,通過[3^ 胸腺嘧啶核苷的結(jié)合測定T細胞的增殖。過程如下。如前所述測定BMDCs 的抗原提呈。簡言之,通過使用EasySep陽性選擇試劑盒(EasySep Positive Selection Kit) (StemCell Technology)純化BMDCs,將細胞接種于96孔 平底板(Costar Coming),并加入lpg/ml含或不含LZ-8的OVAPi或OVAp2, 培養(yǎng)3小時。用EasySep陽性選擇試劑盒從OT-I或OT-II TCR轉(zhuǎn)基因小鼠 中分離出T細胞,并以DC/T細胞數(shù)=1/2,將T細胞加入到DC培養(yǎng)液 中。將細胞培養(yǎng)72小時,通過[3印胸腺嘧啶核苷的結(jié)合測定T細胞的增殖。如圖4A所示(上面),LZ-8激活的BMDCs在體外促發(fā)了比對照細 胞更多的T細胞增殖。此外,被以LZ-8刺激的BMDCs激活的所有T細 胞,其生成了比對照組細胞更多的IFN-Y (圖4A,下面)。
還進一步進行了體內(nèi)T細胞激活的檢測。為了測定體內(nèi)LZ-8對T細 胞激活的誘導(dǎo),采用亞單位疫苗模型來評價LZ-8對T細胞啟動的影響。 為了進行檢驗,用10 pg僅混有不完全佐齊y( incomplete Freund,s Adjuvant, IFA) (Sigma-Aldrich)或混有IFA + LZ-8 (lOjag)的OVAp2經(jīng)足墊注射對 C57BL/6小鼠進行免疫。10天后從免疫的小鼠中分離排出的淋巴結(jié)細胞, 并將細胞用OVAp2培養(yǎng)3天。通過[3司胸腺嘧啶核苷的結(jié)合測定T細胞的 增殖。結(jié)果顯示從LZ-8免疫的小鼠中分離的細胞比對照小鼠的細胞在應(yīng) 答OVAp2時表現(xiàn)出更多的增殖(圖4B)。這些數(shù)據(jù)揭示LZ-8刺激的BMDCs 在體內(nèi)和體外均能誘導(dǎo)抗原特異性T細胞的激活,并且也支持LZ-8對DC 成熟有相對增強作用的結(jié)論。
通過LZ-8對BMDCs的刺激誘導(dǎo)的MAPKs和NF-kB的激活
為了探討LZ-8誘導(dǎo)細胞激活的分子機制,檢測了 LZ-8處理過的 BMDCs中MAPKs和NF-kB的激活。用LZ-8處理BMDCs,并通過蛋白 質(zhì)印跡法分析了 JNK、 ERK和p38MAPK的失活和激活形式。過程如下。 收獲BMDCs、使其饑餓3小時,然后用LZ-8處理(10 ng/ml)。將細胞 溶解、煮沸、在SDS-PAGE凝膠上分離,然后轉(zhuǎn)移到ImmunobilonNC薄 膜(Millipore)。阻斷后,將印跡用針對p38MAPK(Thrl80/Tyr182)、 ERK (Thr202/Tyr204)和JNK (Thrl83/Tyr185) (Cell Signaling Technology)的抗磷 酸特異性抗體或抗-p38 MAPK (Millipore) 、 ERK (BD Transduction Laboratories)、 JNK和IkB (Santa Cruz Biotechnology)抗體培養(yǎng),接著用 HRP-共軛的二次抗體培養(yǎng)(Chemicon)。使用ECL檢測試劑(Pierce)檢 測免疫反應(yīng)性。
結(jié)果顯示LZ-8誘導(dǎo)了這些MAPKs的激活(圖5)。此外,LZ-8還誘 導(dǎo)了 IkB的降解,提示該蛋白能夠激活NF-icB路徑。這些結(jié)果提示LZ-8通過激活MAPKs和NF-kB路徑促進DC的成熟和發(fā)揮作用。 實施例6
LZ-8對巨噬細胞的激活
將RAW264.7細胞系培養(yǎng)在含10。/。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、 2 mM谷氨酸鹽、1%非必需氨基酸和1 mM丙酮酸鈉的RPMI中。將細胞 置37。C 、 5% C02的濕潤培養(yǎng)箱中。為了激活,將細胞用LZ-8 (5 mg/ml) 或LPS (100 ng/ml)處理16小時,收集上清液。用ELISA法測定TNFa的 生成。如圖6所示,LZ-8促進了 RAW細胞中TNFa的分泌。這些結(jié)果表 明LZ-8能夠激活巨噬細胞并增強天然免疫。
實施例7
LZ-8對人MoDCs的激活
為了探討LZ-8對人DCs的影響,用LZ-8對人單核源性DCs(MoDCs) 進行處理,在培養(yǎng)物中表現(xiàn)出細胞集落(數(shù)據(jù)未示出)。然后通過流式細 胞儀檢測LZ-8處理的MoDCs的成熟狀態(tài)。將細胞用CD80、 CD86 (Immunotech)和CD83 (BD PharMingen)的抗體染色,然后通過流式細胞儀 分析。如圖7A所示,LZ-8誘導(dǎo)了 MoDCs中CD80、 CD83和CD86的表 達。這些結(jié)果與在小鼠BMDCs中的一致。
此外,還檢測了 LZ-8刺激后MoDCs的細胞因子的生成。為了檢測細 胞因子的生成,培養(yǎng)24小時后,收集用TLR配體或有效LZ-8培養(yǎng)的MoDC 培養(yǎng)物的上清液。通過使用人流式微球分析(cytometric bead array)試劑 盒(BDPharMingen)檢測細胞因子。如圖7B所示,檢測了 TNFa、 IFN-y、 IL-2和IL-6。令人意想不到的是,當(dāng)與TLR-激活的細胞相比較時,還發(fā) 現(xiàn)LZ-8誘導(dǎo)了 MoDCs的IFN-y和IL-2的生成。這些數(shù)據(jù)證明LZ-8能激 活人DCs,這與其在小鼠DCs上的作用一致。
雖然已經(jīng)足夠詳細地描述和舉例說明了本發(fā)明,使本領(lǐng)域的技術(shù)人員 能夠制造和使用它,但是在不脫離本發(fā)明的宗旨和范圍的情形下,各種替 換、修改和改進是顯而易見的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易理解本發(fā)明能夠充分實現(xiàn)本發(fā)明的目的,并 獲得所提到的結(jié)果和優(yōu)點,以及其中固有的優(yōu)點。生成它們的過程和方法 是優(yōu)選實施例的代表,是示意性的,并不用來限制本發(fā)明的保護范圍。本 領(lǐng)域的技術(shù)人員容易想到其中的修改以及其他用途。這些修改也包含在本 發(fā)明的精神內(nèi)并受到權(quán)利要求范圍的限定。
權(quán)利要求
1.LZ-8蛋白或LZ-8蛋白處理的樹突狀細胞通過激活樹突狀細胞和巨噬細胞增強天然和獲得性免疫的用途。
2. 如權(quán)利要求l所述的用途,其特征在于,LZ-8蛋白是從靈芝中分離 得到或者通過重組蛋白技術(shù)在酵母或細菌系統(tǒng)中制備得到。
3. 如權(quán)利要求l所述的用途,其特征在于,激活樹突狀細胞生成細胞 因子和趨化因子。
4. 如權(quán)利要求l所述的用途,其特征在于,激活樹突狀細胞進一步包 含樹突狀細胞的成熟。
5. 如權(quán)利要求l所述的用途,其特征在于,巨噬細胞生成細胞因子。
6. 如權(quán)利要求4所述的用途,其特征在于,樹突狀細胞的成熟經(jīng)過促 分裂原活化蛋白激醇路徑或NF-kB的激活。
7. 如權(quán)利要求4所述的用途,其特征在于,樹突狀細胞的成熟誘導(dǎo)了 T細胞的激活和增殖。
8. 如權(quán)利要求3所述的用途,其特征在于,細胞因子選自由腫瘤壞死 因子-ou白細胞介素-1(3、白細胞介素-6、白細胞介素-10和白細胞介素-12組成的群組。
9. 如權(quán)利要求3所述的用途,其特征在于,趨化因子選自由單核細胞 趨化蛋白l、巨噬細胞炎性蛋白la、巨噬細胞炎性蛋白1(3組成的群組,并 且在激活時調(diào)節(jié)正常T-細胞表達和分泌。
10. 如權(quán)利要求6所述的用途,其特征在于,促分裂原活化蛋白激酶路 徑選自由JUNN-端激酶、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶和p38組成的群組。
11. 如權(quán)利要求7所述的用途,其特征在于,T細胞生成的細胞因子選 自由白細胞介素-2、白細胞介素-4和干擾素-Y組成的群組。
12. 如權(quán)利要求l所述的用途,其特征在于,進一步結(jié)合樹突狀細胞疫 苗的應(yīng)用。
13. —種LZ-8蛋白融合抗原在增強抗原免疫原性中的用途。
14. 如權(quán)利要求12所述的用途,其特征在于,LZ-8蛋白融合抗原是通過重組蛋白技術(shù)在酵母或細菌系統(tǒng)中制得。
15. 如權(quán)利要求12所述的用途,其特征在于,LZ-8蛋白融合抗原用作 免疫輔助劑。
16. 如權(quán)利要求13所述的用途,其特征在于,抗原的免疫原性通過 LZ-8在體內(nèi)誘導(dǎo)的T細胞激活增強。
17. —種組合物,其特征在于,包含LZ-8蛋白處理的樹突狀細胞。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于LZ-8蛋白或以LZ-8蛋白處理的樹突狀細胞通過激活樹突狀細胞和巨噬細胞增強天然和獲得性免疫的用途;以及一種LZ-8蛋白融合抗原在增強抗原免疫原性中的用途。本發(fā)明更提供一種組合物,其內(nèi)含以LZ-8蛋白處理的樹突狀細胞,可刺激T細胞的活化。
文檔編號A61K39/00GK101584861SQ20091020291
公開日2009年11月25日 申請日期2009年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月16日
發(fā)明者朱清良, 陳子智 申請人:益生生技開發(fā)股份有限公司