專利名稱：：通用的注射用重組人血清白蛋白融合蛋白制劑配方的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物制品用于治療和預(yù)防的制造
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是重組人血清白蛋白與治療性蛋白質(zhì)形成的融合蛋白用于臨床治療用藥的生產(chǎn)制造。本發(fā)明使用了特定的制劑配方和生產(chǎn)工藝步驟，尤其是將融合蛋白以特異、簡單有效的制劑配方和形成凍干產(chǎn)品應(yīng)用于臨床用藥的制造(特別是制劑由簡單而行之有效的醇、糖、表面活性劑和適宜鹽緩沖液組合，劑型采用凍干粉針)。該制劑可以保證適用于所有由人血清白蛋白形成的融合蛋白的注射用針劑，適用于皮下、肌注或靜脈等途徑給藥。特別適用于經(jīng)酵母菌或傳代脊椎動物細(xì)胞分泌表達的重組人血清白蛋白融合蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用。本發(fā)明的制劑配方步驟簡單、通用并具有獨特和意想不到的效果。
背景技術(shù)：
：人血清白蛋白(HSA)是人血液中最豐富的蛋白質(zhì)，構(gòu)成血液中蛋白總量的一半，其作用為維持滲透壓，結(jié)合并運輸營養(yǎng)物和代謝物，HSA作為一種基本載體，攜帶傳遞蛋白質(zhì)、脂肪酸、類固醇和激素分子等，其穩(wěn)定的惰性性質(zhì)是維持血壓的一個重要組成部分。在血液中的半衰期長達14-20天。血清白蛋白是一個球狀非糖基化，分子量為66kd的血清蛋白質(zhì)。人血清白蛋白基因位于4號染色體上有16961堿基對，分為15個間隔區(qū)。經(jīng)RNA加工拼接后形成的mRNA可以編碼的一個具有585個氨基酸的蛋白質(zhì)。這一蛋白(白蛋白前體)在通過高爾基體的轉(zhuǎn)化加工，去除引導(dǎo)多肽，分泌到細(xì)胞外。人血清白蛋白有很大的應(yīng)用及臨床應(yīng)用價值。例如作為藥物可用于治療因血清白蛋白丟失、合成障礙和創(chuàng)傷失血造成的白蛋白含量下降引起的低蛋白血癥；可以作為細(xì)胞培養(yǎng)基的添加成分、可以作為護膚品添加劑、可以作為藥物的輔劑、賦型劑等等。根據(jù)人血清白蛋白的半衰期長的特點，利用基因工程技術(shù)，將人血清白蛋白與人治療性蛋白質(zhì)的融合基因在酵母菌或脊椎動物細(xì)胞中表達加工為融合蛋白，并分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)液中。融合蛋白增加了人治療性蛋白質(zhì)在血清中和儲存時的穩(wěn)定性。于在林、富巖將人血清白蛋白與人粒細(xì)胞剌激因(hGCSF)、人紅細(xì)胞生成素(hEP0)、人白細(xì)胞介素(Interleukins)、人干擾素(Interferons)、人皮膚細(xì)胞生長因子分別形成融合蛋白，該項技術(shù)已在本發(fā)明人的中國授權(quán)發(fā)明專利ZL021428816、ZL2004100428148、ZL2004100573137、美國授權(quán)發(fā)明專利US7，244，833B2、US7，442，371B2、US7，572，437B2和在已提交的中國發(fā)明專利申請(200710059770.3和200710057571.9)中分別公開了人血清白蛋白和不同的治療性蛋白質(zhì)基因相融合所獲得的人血清白蛋白與各種血細(xì)胞增生剌激因子(CPSF)、各種人干擾素及各種皮膚細(xì)胞生長因子，利用基因工程方法重組形成幾十種人血清白蛋白融合蛋白的技術(shù)，且獲得的融合蛋白可在體內(nèi)具有緩慢釋放，與治療性蛋白質(zhì)單體相比，在體內(nèi)給藥后在血液中至少有3-10倍長的半衰期。體外體內(nèi)試驗驗證其具有治療性蛋白質(zhì)的生物活性和藥物功能，并進行了長效新藥的研發(fā)。人血清白蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)工藝已在本發(fā)明人獲得的中國發(fā)明授權(quán)專利中公開(ZL200410057313.7)。人血清白蛋白和人血清白蛋白與治療性蛋白質(zhì)形成的融合蛋白的大規(guī)模分離純化工藝已在本發(fā)明人的中國發(fā)明專利申請中公開(公開號CN101260145A)。現(xiàn)在本發(fā)明人正在將20余種人血清白蛋白與治療性蛋白質(zhì)形成的融合蛋白推進入長效性新藥的研發(fā)階段。為了尋找一種有效、簡單、成本低廉、長期穩(wěn)定可靠又符合臨床用藥的要求而發(fā)明了本通用型制劑配方(制劑配方在本發(fā)明中等同于制劑處方)。研發(fā)中的5種融合蛋白新藥，"注射用重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞剌激因子融合蛋白"、"注射用重組人血清白蛋白/干擾素a2a融合蛋白"、"注射用人血清白蛋白/干擾素a2b"、"外用型人血清白蛋白/人表皮細(xì)胞生長因子融合蛋白"和"注射用人血清白蛋白/EP0融合蛋白"利用這個制劑配方已啟動或已完成了臨床前研究工作，進入臨床試驗研究許可申報階段。在本發(fā)明提交前，未見任何關(guān)于重組人血清白蛋白融合蛋白凍干粉針劑的研究和報道，更未見能具有通用性和具有效性的簡單制劑配方可供任何人血清白蛋白融合蛋白制備注射用針劑來生產(chǎn)臨床試驗用藥的報道。如果獲得一種具有簡便高效的、具公用性、廣譜性和具特異性的能將各種人血清白蛋白融合蛋白都可以用于臨床用藥制造的通用制劑配方和制劑劑型，就可將幾十種具有臨床治療意義的蛋白藥物的制造技術(shù)簡易化、通用化和高性能，這具有真正的實用性和明顯的必要性。生物大分子-蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性可受到多種因素的影B向，而易于發(fā)生分子聚合、形成二聚體、三聚體、四聚體或多聚體形態(tài)；也可以在化學(xué)、蛋白酶適宜環(huán)境條件下起作用，蛋白質(zhì)發(fā)生降解，二者的結(jié)果，均會在蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性上產(chǎn)生變化。對于蛋白制劑，影響其穩(wěn)定性的物理和化學(xué)因素很多，包括溫度、pH、離子強度、表面活性劑、緩沖對、保護劑等。融合蛋白的生物活性在長期貯存時同樣是會受到多種環(huán)境因素的影響。例如對溫度，氧和紫外線高度敏感。由于這些因子的作用，可能發(fā)生多種物理或化學(xué)變化，例如結(jié)合，聚合和氧化斷裂從而蛋白質(zhì)的大大喪失其生物活性。因此如果貯存期間重組人血清白蛋白融合蛋白的穩(wěn)定性不能保證的話，會導(dǎo)致給藥劑量的變化從而影響療效。人血清白蛋白與治療性蛋白質(zhì)形成的融合蛋白是把人血清白蛋白與治療性蛋白質(zhì)通過基因工程方法將融合在一起，但二個蛋白維持各自獨特的功能。由于人血清白蛋白的性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定，因此理論上說融合后的治療性融合蛋白穩(wěn)定性會有大大提高。但不同的人血清白蛋白融合蛋白由于其治療性蛋白質(zhì)的特性完全不同，因此，采用水制劑時必須考量每個融合蛋白自身的不同，進行長時間的制劑篩選和穩(wěn)定性考察，需要耗時至少兩年才能獲得一個完整可靠的數(shù)據(jù)鏈。采用凍干粉針劑則可以保證任何融合蛋白的穩(wěn)定性，凍干粉狀態(tài)使融合蛋白在按規(guī)定條件儲藏時不會有較大變化(形成聚合體或發(fā)生降解或均有生成)。一個穩(wěn)定和通用的制劑配方和生產(chǎn)工藝將可以大大節(jié)省各種融合蛋白的新藥研發(fā)中的人力物力，也可明顯加快研發(fā)的進度和降低研發(fā)成本和風(fēng)險。因此本發(fā)明的重要性不言而喻。重組融合蛋白在臨床上的應(yīng)用方式和給藥途經(jīng)是基本確定的，注射針劑通過皮下、肌注或靜脈給藥。注射用針劑通常由原料藥和具有一定意義和作用的輔料組成制劑配方(處方)。注射用針劑要符合一定的滲透壓和適當(dāng)?shù)膒H緩沖系統(tǒng)。甘露醇、甘氨酸、山梨醇、丙三醇、羥乙基淀粉、右旋糖酐、水解明膠、聚維酮、丙氨酸以及其它氨基酸可作為填充劑和賦型劑用于針劑配方是十分常見的，含量也一般在0.1-10%;乳糖、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、棉子糖和精氨酸可作為穩(wěn)定劑，含量一般在0.1%_4%左右；制劑的緩沖劑系統(tǒng)可由鈣鹽；醋酸鈉鹽、磷酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、氯化鈉鹽從5mM至300mM不等，并使制劑的PH保持在4至8之間。另外，適量的甘草酸單銨丄-半胱氨酸鹽酸鹽、無水亞硫酸鈉、氫氧化鈉溶液，抗氧化劑維生素E、維生素C、硫代硫酸鈉、硫脲，共同加無菌注射用水制備成制劑也是常規(guī)注射用針劑的配方組分。本發(fā)明人在新藥研發(fā)中比較了各種已知制劑的配方和制劑的劑型(水針劑、粉針劑)，分析、研究和進行了大量的試驗，證明了本發(fā)明描述的制劑配方和制劑劑型、對保護和穩(wěn)定人血清白蛋白融合蛋白注射用藥具有意想不到的優(yōu)勢，并已形成注射用臨床治療藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種能穩(wěn)定保存人血清白蛋白與治療性蛋白質(zhì)形成的融合蛋白，并適合于實際臨床使用的含有這種融合蛋白的注射用凍干粉針劑。本發(fā)明的目的是提供一種適合重組人血清白蛋白融合蛋白注射用臨床治療用藥的制劑配方和制劑劑型，這可通過以下步驟達到(1)純化的適用于制備臨床用藥的融合蛋白原液(原料藥)與適量的作為賦型劑的甘露醇、作為穩(wěn)定劑和促溶劑的蔗糖、阻抑融合蛋白形成聚合體的表面活性劑聚山梨酯80、適量的低鹽緩沖液組成符合臨床注射用藥要求的滲透壓和pH值條件下組合形成制劑；(2)從步驟(1)中獲得的含融合蛋白蛋白的制劑，經(jīng)過濾除菌，分裝一定量的制劑進入管狀西林瓶(3)由步驟(2)獲得的目標(biāo)蛋白直接經(jīng)冷凍干燥程序，進行凍干形成具有一定形態(tài)的白色疏松體成為凍干粉針劑；(4)由步驟(3)獲得的凍干粉針劑按所制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定進行檢定，并可用于人類疾病的治療和預(yù)防。本發(fā)明所指的制劑配方可以是各種類型的含有重組人血清白蛋白融合蛋白而形成的臨床用藥形式的凍干粉針劑配方。制劑配方中的組分可以是，包括，但不局限于，各種有利于保護融合蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、有增強融合蛋白的生物學(xué)功能、可以是有助于融合蛋白制劑適于人體的必要緩沖體系和減少注射帶來的對人體的剌激作用的組分。重組人血清白蛋白融合蛋白可以是人血清白蛋白與治療性蛋白質(zhì)以各種不同形式通過基因工程方法和技術(shù)進行連接而成的融合蛋白。人血清白蛋白可以在治療性蛋白質(zhì)肽鏈的N末端或C末端；在人血清白蛋白和治療性蛋白質(zhì)之間的連接方式可以有連接肽或者是沒有連接肽的連接。連接肽的長度可以是i-ioo個氨基酸。沒有連接肽的連接可以是直接連接，即是兩個蛋白質(zhì)分子肽鏈各自均沒有任何氨基酸丟失的條件下形成的連接。人血清白蛋白與治療性蛋白質(zhì)之間的連接還可以是有氨基酸缺失的條件下形成融合蛋白的缺失連接。這種缺失，可以是發(fā)生在兩個蛋白質(zhì)中的一個或兩個蛋白質(zhì)都有不同氨基酸肽鏈長度的缺失。缺失可以是i-ioo個氨基酸的缺失。人血清白蛋白和治療性蛋白質(zhì)形成融合蛋白時，也均可以有在不影響各自生物學(xué)功能的條件下兩個蛋白質(zhì)中的一個或兩個蛋白質(zhì)的肽鏈中發(fā)生氨基酸的替換和改變。為達到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是—種含有人血清白蛋白融合蛋白的注射用粉針劑，所述注射用粉針劑由重組人血清白蛋白和治療性蛋白質(zhì)形成的融合蛋白，并與醫(yī)學(xué)上可接受的賦型劑和穩(wěn)定劑輔料、溶于pH48的藥學(xué)上可接受的鹽緩沖液中，通過冷凍干燥而形成白色疏松體凍干粉針劑，按標(biāo)示量進入注射用水，可迅速復(fù)溶為澄清液體，用于臨床治療作用，所述重組人血清白蛋白融合蛋白的濃度為0.15mg/ml。重組人血清白蛋白融合蛋白的表達和生產(chǎn)制備方法可參考于在林、富巖的授權(quán)發(fā)明專利(美國發(fā)明專利US7，244，833B2、US7，442，371B2、US7，572，437B2，中國發(fā)明專利ZL02142881.6、中國發(fā)明專利ZL200410042814.8、中國發(fā)明專利ZL200410057313.7和中國發(fā)明專利申請公開CN101260145A)等。所述賦型劑和穩(wěn)定性輔料可根據(jù)需要酌情添加，如醇類、氨基酸類和糖類等。本發(fā)明中優(yōu)選的輔料賦型劑為甘露醇、甘氨酸、甲硫氨酸、羥乙基淀粉、右旋糖酐、水解明膠、聚維酮、丙氨酸以及其它氨基酸，穩(wěn)定性輔料為乳糖、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、棉子糖和精氨酸。為阻止蛋白質(zhì)形成聚合體所試驗的表面活性劑為醫(yī)學(xué)可以接受的表面活性劑如聚山梨酯(吐溫)80，聚山梨酯(吐溫)20、環(huán)糊精、右旋糖酐、泊洛沙姆等。制劑的緩沖劑系統(tǒng)可由鈣鹽；醋酸鈉鹽、磷酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、氯化鈉鹽、甘草酸單銨、L-半胱氨酸鹽酸鹽、無水亞硫酸鈉、或氫氧化鈉適當(dāng)含量組成。作為賦型劑的輔料優(yōu)選為甘露醇或甘氨酸或二者均含有，優(yōu)選為甘露醇，含量濃度為26%，優(yōu)選為3-5%，更優(yōu)選為4.0%。具有穩(wěn)定性作用的輔料優(yōu)選為蔗糖和海藻糖，含量濃度為0.5-2%，優(yōu)選為蔗糖0.5-1.5%，更優(yōu)選為1.0%。表面活性劑優(yōu)選為聚山梨酯80，含量濃度為0.001-0.02%，優(yōu)選為0.002-0.006%，更優(yōu)選為0.004%。作為制劑的緩沖液體系優(yōu)選為檸檬酸、磷酸鹽和醋酸鈉鹽，優(yōu)選為磷酸鹽或檸檬酸，含量濃度為5-100mM，優(yōu)選為含量濃度為10-50mM，更優(yōu)選為10mM。制劑的pH值優(yōu)選為4.0-8.0，更優(yōu)選為pH5.0-7.0。制劑配方的摩爾滲透壓優(yōu)選為人體最適范圍200-500mOsm，優(yōu)選為200-400mOsm，更優(yōu)選為220-340mOsm。制劑的最大特點是對人體不會產(chǎn)生任何過敏、增加新的毒副作用。制劑中如果除蔗糖不含有外，提高甘露醇的含量也是可行的。蔗糖的添加較單純的甘露醇對融合蛋白的保護作用更為明顯。在制劑優(yōu)選配方中重組人血清白蛋白融合蛋白的含量可在0.lmg-5mg/ml范圍形成制劑，優(yōu)選為0.2-5mg/ml，更優(yōu)選為0.6-4mg/ml。灌注量在0.2ml-3ml，優(yōu)選為0.5ml-2ml，更優(yōu)選為0.5ml-lml，從而獲得0.3mg-5mg/2.Oml/支；優(yōu)選為0.3mg-2mg/1.Oml/支，更優(yōu)選為0.3mg_l.Omg/0.5ml/支。在原料藥(原液)到成品的生產(chǎn)過程中，所用水為無熱源注射用水，所用試劑均經(jīng)無熱源處理步驟，所用玻璃器材都經(jīng)過干熱烘烤除熱源的處理，所用配方組分均為"藥用級"或"化學(xué)分析純"符合生物制品對制劑配方輔料的要求。冷凍干燥可以使得人血清白蛋白融合蛋白制劑獲得極為穩(wěn)定的保藏狀態(tài)。在水劑配方中，融合蛋白在儲藏時，隨著時間，會形成單體游離的人血清白蛋白和治療性蛋白質(zhì)片斷。這是水劑不可避免的。發(fā)明人經(jīng)過比較水劑和凍干粉針劑，顯示出本發(fā)明的優(yōu)勢十分明顯。重組人血清白蛋白融合蛋白的冷凍干燥生產(chǎn)工藝如下原液加入經(jīng)優(yōu)選的輔料(甘露醇、蔗糖、聚山梨酯80和鹽溶液)配制成半成品，經(jīng)過0.22iim正壓過濾后，分裝西林瓶，每支裝量為O.5ml-2ml，入凍干箱開始凍干程序。凍干曲線為-5(TC預(yù)冷4hr，-2(TC在真空狀態(tài)下升華8hr，然后進行梯度升溫開始解析，-l(TClhr，(TClhr，10°Clhr，29°C(產(chǎn)品溫度升至26t:時啟動極限真空)，解析共約9h，經(jīng)壓力等指標(biāo)檢測后壓蓋，出凍干機，成品加封鋁塑組合蓋。凍干全程約需26h。凍干得到成型的白色疏松體，含水率在3.0%以內(nèi)。在加入標(biāo)示量的注射用水后，可迅速復(fù)溶為無色澄清液體。凍干曲線可由技術(shù)人員進行控制和進行曲線優(yōu)化。本發(fā)明的制劑和劑型是符合醫(yī)學(xué)臨床用藥要求的制劑和劑型，生產(chǎn)制備工藝簡單可控，簡化了可用于生產(chǎn)各種不同的人血清白蛋白融合蛋白的臨床用藥方法，適用于，包括，但不局限于，重組人血清白蛋白和各種治療性蛋白質(zhì)形成的融合蛋白直接制備成為注射用藥。本發(fā)明可適用的融合蛋白有人血清白蛋白與造血細(xì)胞增生剌激因子形成的融合蛋白(于在林，中國專利ZL02142881.6;US7，244，833B2)，包括，但不局限于人血清白蛋白與血紅細(xì)胞增生素(EPO)、與白細(xì)胞介素(ILs)、與干細(xì)胞因子(SCF)、與血小板增生素(TPO)、與粒細(xì)胞集落剌激因子(GCSF)和與巨噬粒細(xì)胞集落剌激因子(GM-GSF)等形成的融合蛋白；有人血清白蛋白與人干擾素形成的融合蛋白(富巖、于在林ZL200410042814.8)，包括，但不局限于與干擾素_a(-2a、-2b或-lb)、與干擾素_|3、與干擾素-Y、與干擾素等形成的融合蛋白；還有人血清白蛋白與皮膚細(xì)胞生長因子形成的融合蛋白(于在林、富巖中國專利申請CN200710059770.3)，包括，但不局限于，與人表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、與人酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)、與人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、與人胰島素樣細(xì)胞生長因子(IGF)、與人角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)、與人血小板衍生生長因子(PDGF)等。在重組人血清白蛋白融合蛋白制劑配方藥劑的穩(wěn)定性考察中，選取的檢定指標(biāo)有凍干粉復(fù)溶速率、澄清度檢測、蛋白質(zhì)純度檢測有SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法和高效液相色譜法、蛋白質(zhì)含量、在細(xì)胞水平的生物活性測定、pH值、各種輔料含量的測定(蔗糖、甘露醇和聚山梨酯80)、水分、無菌檢查、異常毒性檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查等常規(guī)和自行制定的檢定方法來決定配方和凍干工藝是否符合藥劑的要求。附圖1、用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法考察重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞剌激因子融合蛋白(rHSA/GCSF，代號9314)在水劑制劑配方中的穩(wěn)定性。編號1、3、5、7為水劑制劑；編號2、4、6、8為非制劑。1和2為在室溫條件下保存3天；5和6為室溫條件下保存6天。編號3和4為在fC條件下保存3天，編號5和6為在fC條件下保存6天。附圖2、所發(fā)明的制劑處方已穩(wěn)定重復(fù)用于人血清白蛋白/粒細(xì)胞剌激因子融合蛋白、重組人血清白蛋白/干擾素a2a融合蛋白和人血清白蛋白/表皮細(xì)胞生長因子融合蛋白的冷凍干燥成品制造。附圖2(A)為"注射用重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞剌激因子融合蛋白"的凍干粉針劑成品生產(chǎn)實際記錄典型凍干曲線圖流程圖；附圖2(B)為"注射用重組人血清白蛋白/干擾素a2a融合蛋白"的凍干粉針劑成品生產(chǎn)實際凍干曲線記錄流程圖。實施例下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅是用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。實施例1:重組人血清白蛋白融合蛋白在水針劑制劑配方中的表現(xiàn)不同的重組蛋白質(zhì)藥物制成水制劑時的配方各有較明顯的不同，并形成自己的專利配方，例如，重組干擾素a2a和干擾素a2b的水針劑配方不同，重組粒細(xì)胞剌激因子注射液水制劑配方也與重組干擾素的配方不同。以美國Amgen公司的重組人粒細(xì)胞剌激因子注射液NEUPOGEN成品水針劑劑配方作為制劑配方篩選參考，并進行比較。美國Amgen公司的NEUPOGEN注射液規(guī)格0.5ml:每支含有rhGCSF:0.3mg;醋酸0.295mg;甘露醇25.Omg;聚山梨酯80:0.02mg;鈉鹽0.0175mg。所以在此基礎(chǔ)上，以人血清白蛋白/粒細(xì)胞剌激因子融合蛋白(rHSA/GCSF)為例，進行重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞剌激因子融合蛋白的注射用針劑的制劑處方研究。試驗采用非制劑的原液(原料藥，含有10mMNaAc)和完全模擬Amgen的水針劑制劑配方(只將蛋白更換為rHSA/GCSF融合蛋白，其余組分不變)進行比較，考察結(jié)果見附圖1:用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法考察重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞剌激因子融合蛋白(rHSA/GCSF，代號9314)在水針劑制劑配方中的穩(wěn)定性。編號1、3、5、7為水劑制劑；編號2、4、6、8為非制劑。l和2為在室溫條件下保存3天；5和6為室溫條件下保存6天。編號3和4為在fC條件下保存3天，編號7和8為在fC條件下保存6天。由圖中試驗結(jié)果可以清楚看出(i)、不含水針劑配方的原液在4t:及室溫下不穩(wěn)定，4t:6天時、室溫3天時明顯有降解帶產(chǎn)生；室溫6天時絕大部分被降解；(2)、水針劑配方在4t:及室溫下也相對不穩(wěn)定(但比原液要好很多)，4°C6天時、室溫3天時僅有少量降解帶產(chǎn)生；室溫6天時降解帶也明顯有增多；而重組人粒細(xì)胞剌激因子在該水制劑配方中，可以在4t:保持至少兩年的穩(wěn)定。結(jié)果也表明同樣含有人粒細(xì)胞剌激因子蛋白，但與人血清白蛋白形成融合蛋白后，在同樣條件下變得不穩(wěn)定了。結(jié)果表明水劑配方很難獲得一個通用的制品配方。因此，必須重新進行適合于重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞剌激因子融合蛋白的水針劑配方篩選。在沒有文獻參考的條件下，只能逐一進行比較和篩選，這將是一個十分耗時的工作。成功更多是靠"運氣"和經(jīng)驗來幫助。(3)、液體制劑配方與單純原液醋酸鈉緩沖體系對比，保護作用則非常明顯；但為增加成品穩(wěn)定性、滿足長期儲存需要，因此應(yīng)該采用凍干劑型。這樣在凍干粉針劑復(fù)溶后，融合蛋白在室溫條件下將有近48小時的穩(wěn)定，無蛋白質(zhì)降解帶形成(見附圖1中的編號1、3、5、7條帶的表現(xiàn))。(4)制劑配方和制劑形式篩選也考慮了如何保持rHSA/GCSF單體數(shù)量，不形成或減少形成蛋白聚合體的機會。凍干形式比液體形式形成聚合體的機會更小。因此，試驗表明如果采用凍干制劑的方法，可簡單達到增加融合蛋白的穩(wěn)定性的目標(biāo)。本發(fā)明還曾分別對重組人血清白蛋白/干擾素a2a融合蛋白、人重組血清白蛋白/干擾素a2b融合蛋白(帶有連接肽)和人重組血清白蛋白/表皮細(xì)胞生長因子融合蛋白(rHSA/EGF)進行相同的試驗獲得了完全類似的結(jié)果，顯示了水劑的不穩(wěn)定。用甘氨酸來替換制劑配方中的甘露醇，對融合蛋白的穩(wěn)定作用表現(xiàn)明顯要好于甘露醇。但在加速試驗中也沒有發(fā)現(xiàn)其可形成保有融合蛋白在水針劑狀態(tài)持續(xù)維持?jǐn)?shù)月以上穩(wěn)定的跡象。因此可以確定，凍干粉針劑能更好地保證和達到不因融合蛋白的不同，而在單一制劑配方中，經(jīng)冷凍干燥制備成可用于臨床治療用藥的要求。實施例2:凍干劑型_配方中添加糖種類的研究(蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖)本發(fā)明針對人血清白蛋白融合蛋白的分子結(jié)構(gòu)的特定性，在初步處方篩選的選定甘露醇的基礎(chǔ)上，進行了添加不同種類的糖，以考察是否可增加成品凍干制劑的穩(wěn)定性。選取檢驗合格的人血清白蛋白/干擾素a2a原液，配成10mMPB、0.3mg融合蛋白、4%甘露醇、1%蔗糖(或分別是海藻糖、葡萄糖、乳糖)、0.004X吐溫80，pH6.5的制劑，裝量為O.5ml;同時配成10mMPB，0.3mg融合蛋白、5%甘露醇、0.004%吐溫80，裝量0.5ml，做對照。凍干后，進行純度分析。結(jié)果表明，凍干后融合蛋白成品的蛋白純度，在相同的糖含量下(1%)，蔗糖與海藻糖對融合蛋白的保護作用最好，葡萄糖次之，乳糖最差。同時后兩者的復(fù)溶性要遜于蔗糖和海藻糖作為添加劑的配方。當(dāng)蔗糖含量為5%，甘露醇含量為0%時，融合蛋白不能復(fù)溶。因此，從制劑的摩爾滲透壓、對蛋白的保護效果和生產(chǎn)成本考慮優(yōu)選藥用級蔗糖，其在制劑中的含量為1.0%。表-1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例3:凍干劑型_配方中聚山梨酯80含量的研究針對重組人血清白蛋白融合蛋白易于形成聚合體。以重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞剌激因子融合蛋白(rHSA/GCSF)為例進行了詳盡的處方篩選研究。在GCSF分子上有一個自由巰基，當(dāng)兩個GCSF分子相遇可以形成二聚體，并且不能用常規(guī)方法分開，只能通過完全變性分開。形成聚合體使得制備的蛋白質(zhì)生物活性大大下降。在rhGCSF的生產(chǎn)制備時，這種聚合體，是通過完全變性，然后在重新復(fù)性來解決(當(dāng)然得率要下降)。在形成人血清白蛋白融合蛋白后，就不能再通過變性_復(fù)性來解決了。重組人血清白蛋白融合蛋白自己有17個二硫鍵存在，rHSA/GCSF融合蛋白有20個二硫鍵，rHSA/干擾素a2a和rHSA/干擾素a2b各有19個二硫鍵，rHSA/EGF則有21個二硫鍵可能存在。這樣變性后的正確復(fù)性成功率要遠(yuǎn)低于1%。這一分子結(jié)構(gòu)的特定性，使得在Amgen的水針劑配方及本發(fā)明的試驗結(jié)果表明配方應(yīng)該含有一定量的聚山梨酯80，可以明顯減少聚合體的形成，為此在進行配方篩選時，對保護劑聚山梨酯80的添加不同含量(0.002%、0.004%、0.008%、0.01%)的保護效果進行了對比。結(jié)果表明，不論那個重組人血清白蛋白融合蛋白在含有一定量的聚山梨酯80時均可降低聚合體的形成(聚合體形式，可以是形成共價鍵的二聚體，也可以是由于表明分子聚合而形成的聚合體)。有效的聚山梨酯80含量為0.002%-0.01%范圍。雖然0.01%對人體仍然是安全的，但考慮到實際效果和參考已上市銷售的成熟配方，采用有明顯保護作用的0.004%聚山梨酯80為配方的最佳含量。實施例4:在輔料及輔料含量確定后的最適pH值、融合蛋白含量及灌注量的考察在輔料及輔料含量確定后，又進行了pH值、融合蛋白含量和凍干時的灌注量進行考察。在設(shè)定的條件下，例如融合蛋白含量lmg/ml、4X甘露醇、lX蔗糖、0.004X聚山梨酯80時，pH值經(jīng)過pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5的比較，結(jié)果表明對rHSA/GCSF融合蛋白在pH4-6之間沒有觀察到明顯不同。rHSA/干擾素a2a則在pH5_7之間沒有觀察到明顯的不同。根據(jù)臨床用藥特點，通用制劑配方的PH可設(shè)定為6.0。對成品的pH值許可波動范圍確定在±1.0。在選定pH值后，再比較融合蛋白的含量，當(dāng)融合蛋白含量小于0.2mg/ml時，融合蛋白的穩(wěn)定性明顯下降?？紤]到臨床用藥的可能使用的方便劑量，可以確定O.4mg/ml的蛋白含量可作為制劑的處方中容許下線。西林瓶灌注量的測試由0.5ml到2ml不等，對融合蛋白的純度和活性沒有明顯的影響。在凍干時的灌注體積改變和凍干曲線的影響，可以經(jīng)由專業(yè)人員進行調(diào)整解決，屬于本領(lǐng)域技術(shù)操作人員可以根據(jù)其經(jīng)驗和儀器設(shè)備來處理的。實施例5:制劑配方確定后的凍干曲線研究本發(fā)明人通過試驗確定了一個可用于多種重組人血清白蛋白融合蛋白的通用冷凍干燥制劑配方0.02-0.2%重組人血清白蛋白融合蛋白、4.0%甘露醇、1.0%蔗糖、0.004%聚山梨酯80和10mM的磷酸鹽緩沖液，pH5.5。凍干曲線的設(shè)計主要考慮了融合蛋白成品的相對耐熱性，前面的-50°C4hr，冷凍的速度越快，產(chǎn)生的冰晶越小，復(fù)溶時易溶解，同時可以保證樣品凍實，抽真空時不起泡；凍干過程中升華干燥在_201:除去大部分水分，然后通過逐步升溫使制品緩慢的升高溫度，隨著制品溫度的升高使水分進一步降低；最后一步應(yīng)用29t:，并在制品溫度達到26時極限真空，可以使水分降到更低，同時使制品溫度不會升到太高，保證活性不受影響。半成品分裝后，加半塞，放入凍干機冷凍隔板，按照既定凍干程序(表成品凍干程序)進行凍干，凍干程序結(jié)束，壓塞，出凍干箱，軋鋁蓋。進行水分、純度等分析。本發(fā)明中描述的制劑配方和所使用的凍干曲線在"注射用重組人血清白蛋白/粒細(xì)胞剌激因子融合蛋白"[附圖2(A)]、"注射用重組人血清白蛋白/干擾素a2a"[附圖2(B)]的臨床試驗研究用藥制備中得到實際使用。同時也在"重組人血清白蛋白/表皮細(xì)胞生長因子融合蛋白凍干粉"的實際制備生產(chǎn)中得到應(yīng)用。表重組人血清白蛋白融合蛋的成品通用凍干曲線流程<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>當(dāng)然，在實際應(yīng)用于不同的融合蛋白時，還有可能要據(jù)此進行必要的優(yōu)化，以獲得最佳的凍干效果。實施例6:通用重組人血清白蛋白融合蛋白的冷凍干燥制劑配方的長期穩(wěn)定性測定對本發(fā)明篩選和優(yōu)化的適用于所有人血清白蛋白融合蛋白注射用制劑配方和冷凍干燥生產(chǎn)工藝獲得的成品(已實際對三種不同的重組人血清白蛋白融合蛋白進行了20多個批次的冷凍干燥粉針劑的生產(chǎn)制備，每批次從700支至20000支規(guī)模不等)。凍干粉針劑在2-『C的條件下，從2008年5月保藏至2009年11月穩(wěn)定性沒有明顯變化。在25。C的加速試驗中(25t:的3個月，相當(dāng)于2-8t:的18個月)穩(wěn)定性考察中，也沒有明顯變化。按照常規(guī)經(jīng)驗，一般凍干粉針劑在指定的保藏條件下，30個月的有效期是可以保證。穩(wěn)定性試驗選取的檢定指標(biāo)有凍干粉復(fù)溶速率、澄清度檢測、蛋白質(zhì)純度檢測有SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法和高效液相色譜法、蛋白質(zhì)含量、在細(xì)胞水平的生物活性測定、PH值、各種輔料含量的測定(蔗糖、甘露醇和聚山梨酯80)、水分、無菌檢查、異常毒性檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查等中國藥典(2005版三部)方法和自己制定的檢定方法來決定這個配方和凍干工藝是否符合藥劑的要求?？疾旖Y(jié)果表明本發(fā)明的制劑配方對重組人血清白蛋白融合蛋白有很好的保護作用，制品配方適應(yīng)度好，可適于各種所測定的人重組血清白蛋白融合蛋白。已有4個融合蛋白實際使用制劑配方和冷凍干燥生產(chǎn)工藝制備臨床前研究用藥和臨床試驗研究用藥?？梢钥隙ㄆ浞€(wěn)定性和有效性。同時制劑配方簡單、成本低廉、制劑各組分對人體安全有效。權(quán)利要求一種制劑配方用于制備含有人血清白蛋白融合蛋白的注射用凍干粉針劑，其特征在于(1)所述的制劑配方由含有重組人血清白蛋白融合蛋白與藥學(xué)上可接受的賦型劑、穩(wěn)定劑輔料和可接受的鹽緩沖液組成；(2)(1)中所含的重組人血清白蛋白融合蛋白含量為0.01-0.5％，優(yōu)選地是0.02-0.4％；(3)(1)中所含的賦型劑為甘露醇或甘氨酸，穩(wěn)定劑為蔗糖、或海藻糖以及聚山梨酯80，鹽緩沖液為磷酸鹽或醋酸鹽或檸檬酸鹽，優(yōu)選的賦型劑為甘露醇、穩(wěn)定劑為蔗糖和聚山梨酯80，鹽緩沖液為磷酸鹽或醋酸鹽；(4)進一步(3)中的甘露醇含量為2-6％，優(yōu)選地是4.0％，蔗糖含量為0.5-1.5％，優(yōu)選地是1.0％，聚山梨酯80的含量為0.002-0.006％，優(yōu)選地是0.004％，鹽緩沖液的濃度為5-100mM，優(yōu)選地是10mM，pH值為4.0-7.0，優(yōu)選地是pH值5.5-6.5。2.權(quán)利要求1所述制劑配方中的人血清白蛋白融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白是由通過各種連接方式將人血清白蛋白與治療性蛋白質(zhì)基因融合，然后通過酵母菌或脊椎動物細(xì)胞表達制備的重組人血清白蛋白融合蛋白。3.如權(quán)利要求1所述的凍干粉針劑，其特征在于，是利用冷凍干燥技術(shù)將含有藥用級人血清白蛋白融合蛋白和藥用級輔料混合配制而成的液體制劑經(jīng)分裝管狀玻璃容器，由凍干機冷凍干燥而成具有一定形狀的疏松體，在加入標(biāo)示量的注射用水后可迅速復(fù)溶為澄明液體。4.權(quán)利要求1所述的凍干粉針劑是作為各種疾病的臨床治療和預(yù)防用藥物。全文摘要本發(fā)明提供了一種具通用性、簡單、特別有效的制劑配方用于制造注射用重組人血清白蛋白/治療性蛋白質(zhì)融合蛋白的臨床用藥。該制劑配方和冷凍干燥工藝包括將不同的重組人血清白蛋白融合蛋白利用單一有效配方進行配制和經(jīng)冷凍干燥而成的臨床治療用注射針劑。凍干針劑可減少形成斷裂的游離人血清白蛋白、游離的治療性蛋白質(zhì)片斷和融合蛋白聚合體機會。產(chǎn)品可以長期貯存不易分解變質(zhì)；劑量準(zhǔn)確，外觀優(yōu)良；穩(wěn)定性好，安全性高，并大大提高了用藥的安全性。制劑配方和生產(chǎn)工藝步驟簡單、具獨特性、高質(zhì)量和易于產(chǎn)業(yè)化，以及制劑的最大特點是對人體不會產(chǎn)生任何過敏和增加毒副作用等特點。文檔編號A61K47/26GK101693016SQ200910210379公開日2010年4月14日申請日期2009年11月2日優(yōu)先權(quán)日2009年11月2日發(fā)明者萬園,于在林,代月函,富俞淞,富巖,楊小楠,邢靜,韓國,韓旭申請人:北京美福源生物醫(yī)藥科技有限公司;