專利名稱：一種規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在傷口急救以及外科手術(shù)中，創(chuàng)面出血與滲血是經(jīng)常遇到的難題，血液的大量流 失會危及生命，同時，血液是天然的微生物培養(yǎng)基，出血或滲血都會增加感染的幾率，從而 降低手術(shù)的成功率。良好的止血技術(shù)成為手術(shù)成功的關(guān)鍵，所以外科止血是手術(shù)技術(shù)的核 心之一。暫時性控制出血、盡快覆蓋包扎傷口，將傷口與外界隔離以減少感染機會，為清創(chuàng) 創(chuàng)造良好的創(chuàng)面條件。平時嚴(yán)重交通傷、戰(zhàn)時火器傷、恐怖襲擊、搶險救災(zāi)以及塌方、臺風(fēng)、 地震、泥石流等自然災(zāi)害可造成短時間內(nèi)同時出現(xiàn)大批傷員。對這些傷員傷口的院前急救 歷來是創(chuàng)傷急救醫(yī)學(xué)甚為關(guān)注的問題。理想的止血材料應(yīng)該具有止血迅速、無剌激性、無急 性毒性、無慢性毒性、無致畸致癌性等特點，并且要有滿足不同需求的可控的降解速度，優(yōu) 異的生物相容性。 膠原蛋白，又稱為膠原，是脊椎動物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣泛的一組硬蛋白， 是組成脊椎動物身體結(jié)構(gòu)的重要材料，也是在哺乳動物中含量最豐富的蛋白。膠原由多糖 蛋白分子組成，是結(jié)締組織的主要蛋白成分，占機體總蛋白的20 30%。機體中大約一半 的膠原蛋白存在于皮膚中，膠原蛋白占真皮和筋腱干重的70%，相當(dāng)于體重的6%。類人膠 原蛋白是將人體已知序列膠原蛋白的一段mRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，經(jīng)過特定序列重復(fù)和 修飾，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌中，并經(jīng)過高密度發(fā)酵、分離提取及純化而得，由西安巨子生物基因 技術(shù)股份有限公司發(fā)明并獨家生產(chǎn)。它從根本上解決了動物提取膠原蛋白的水不溶性和病 毒隱患(瘋牛病、豬瘟疫、禽流感)等問題，并且具有良好的生物學(xué)特性和功能，促新細(xì)胞形 成和促上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞生長功能相比動物體提取膠原蛋白優(yōu)良，免疫排異反應(yīng)低。
殼聚糖是目前已知存在于自然界中的唯一一種帶陽離子能被生物降解的分布極 其廣泛的高分子材料，大量存在于昆蟲、甲殼綱動物外殼及真菌的細(xì)胞壁中，是地球上僅次 于纖維素的第二大可再生資源，其不溶于水及有機溶劑，很難被人體利用。其脫乙?；?產(chǎn)物稱為殼聚糖(化學(xué)名P (l-4)-氨基-2-脫氧氨基-D-葡萄糖)，則能被人體吸收利用。 這類多糖既可生物合成，又可生物降解，與動物的器官組織及細(xì)胞有良好的生物相容性，無 毒，降解過程中產(chǎn)生的低分子寡聚糖在體內(nèi)不積累，幾乎無免疫原性。 雖然膠原蛋白和殼聚糖都具有良好的生物相容性，但是單純用膠原蛋白或者殼聚 糖止血材料機械性能較差，止血效果不理想，不能滿足臨床手術(shù)的要求，經(jīng)過反復(fù)試驗，發(fā) 明得到了理想的復(fù)合止血材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，該方法工藝簡單，所 制備的止血海綿機械性能良好、生物相容性優(yōu)異，徹底杜絕了動物膠原蛋白止血材料所不可避免的病毒隱患，保證了止血材料的安全性。
本發(fā)明內(nèi)容如下 —種規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，包括以下步驟
1)將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成1. 0% 2. 0%的溶液；
2)將殼聚糖用稀酸溶解成0. 5% 1. 0%的溶液； 3)將上述兩種溶液混合均勻，加入混合液總量2. 0% 5. 0%的甘油或山梨醇，混 合攪拌、過濾后真空脫泡； 4)將上述混合液注入不同規(guī)格的模具中，_40°C _80°〇預(yù)凍2 10h，然后真空 冷凍干燥； 5)將上述完成冷凍干燥的海綿使用O. 1% 1.0%的戊二醛溶液在25°〇 451:溫 度下進(jìn)行交聯(lián)10 20h ; 6)將交聯(lián)完成的類人膠原蛋白止血海綿使用蒸餾水進(jìn)行多次洗滌，洗滌完成后再 次真空冷凍干燥； 7)上述凍干完成后的海綿密封后Co-60滅菌得到類人膠原蛋白止血海綿成品。
上述溶液濃度為質(zhì)量百分比濃度。 上述步驟中，所用的類人膠原蛋白為使用基因重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)的一 種人源型膠原蛋白，該蛋白與人體免疫排異反應(yīng)更弱，促進(jìn)受損組織修復(fù)能力更強，而且不 存在病毒隱患。 上述步驟中，所用的殼聚糖的脫乙酰度為70% 95%。
上述步驟中，所用的殼聚糖分子量為105 5X105Da。 上述步驟中，類人膠原蛋白和殼聚糖混合過程中干重質(zhì)量比為(5 20) : l，所用 的稀酸為稀鹽酸、稀醋酸或稀乳酸中的任意一種。 上述步驟中，使用的模具可以根據(jù)臨床手術(shù)的要求做出任意大小或形狀，對海綿 的理化性能、止血效果和生物相容性不造成影響。 本發(fā)明提供的止血材料具有適宜的微觀結(jié)構(gòu)和空隙率，具有優(yōu)良的機械強度和可 控的降解速率，對于各種體表和體內(nèi)創(chuàng)傷止血迅速、生物相容性良好。與目前臨床廣泛應(yīng)用 的止血材料相比，類人膠原蛋白止血海綿具有顯著的優(yōu)點它的免疫排異反應(yīng)更弱，而且徹 底杜絕了動物膠原蛋白所不可避免的病毒隱患，質(zhì)量更加穩(wěn)定、成本更低。
具體實施例方式
下面通過具體實施實例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實施例1 : 將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成1.0%的溶液，將脫乙酰度為70%、分子量為20 萬道爾頓的殼聚糖用1.0%乙酸溶解成1.0%的溶液，然后將兩者按5 : l(類人膠原蛋白 與殼聚糖干重質(zhì)量比為(5 20) : 1)混合，加入溶液總量的2.0%的甘油，攪拌均勻后，過 濾后真空脫泡，注入適當(dāng)形狀的模具中，并于-4(TC真空冷凍干燥后使用0. 1%的戊二醛溶 液在室溫下交聯(lián)10h，交聯(lián)完成后使用蒸餾水洗滌數(shù)次，再次真空冷凍干燥成型，密封后使 用Co-60滅菌得到類人膠原蛋白止血海綿成品。
實施例2 :
將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成2. 0%的溶液，將脫乙酰度為95%、分子量為50 萬道爾頓的殼聚糖用0.5%乙酸溶解成0.5%的溶液，然后將兩者按10 : l(質(zhì)量比)混 合，加入溶液總量的1.0X的丙三醇，攪拌均勻后，并于-5(TC真空冷凍干燥后使用0.5%的 戊二醛溶液在37t:下交聯(lián)20h，交聯(lián)完成后使用蒸餾水洗滌數(shù)次，再次真空冷凍干燥成型， 密封后使用Co-60滅菌得到類人膠原蛋白止血海綿成品。
實施例3 : 將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成1. 0%的溶液，將脫乙酰度為90%、分子量為30 萬道爾頓的殼聚糖用0.5%鹽酸酸溶解成1.0%的溶液，然后將兩者按15 : l(質(zhì)量比)混 合，加入溶液總量的1. 2%的山梨醇，攪拌均勻后，并于-S(TC真空冷凍干燥后使用0. 8%的 戊二醛溶液在45t:下交聯(lián)12h，交聯(lián)完成后使用蒸餾水洗滌數(shù)次，再次真空冷凍干燥成型， 密封后使用Co-60滅菌得到類人膠原蛋白止血海綿成品。
實施例4 : 將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成2. 0%的溶液，將脫乙酰度為80%、分子量為40 萬道爾頓的殼聚糖用1.0%稀乳酸溶解成0.5%的溶液，然后將兩者按12 : l(質(zhì)量比)混 合，加入溶液總量的1. 0%的山梨醇，攪拌均勻后，并于-S(TC真空冷凍干燥后使用0. 4%的 戊二醛溶液在37t:下交聯(lián)10h，交聯(lián)完成后使用蒸餾水洗滌數(shù)次，再次真空冷凍干燥成型， 密封后使用Co-60滅菌得到類人膠原蛋白止血海綿成品。
實施例5 : 將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成1. 5%的溶液，將脫乙酰度為85%、分子量為10 萬道爾頓的殼聚糖用0.5%鹽酸溶解成0.5%的溶液，然后將兩者按16 : l(質(zhì)量比)混 合，加入溶液總量的1.5X的甘油，攪拌均勻后，并于-8(TC真空冷凍干燥后使用0.3%的戊 二醛溶液在室溫下交聯(lián)20h，交聯(lián)完成后使用蒸餾水洗滌數(shù)次，再次真空冷凍干燥成型，密 封后使用Co-60滅菌得到類人膠原蛋白止血海綿成品。
實施例6 : 將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成1. 8%的溶液，將脫乙酰度為95%、分子量為50 萬道爾頓的殼聚糖用1.0%稀乳酸溶解成1.0%的溶液，然后將兩者按8 : l(質(zhì)量比)混 合，加入溶液總量的1. 0%的山梨醇和0. 5%的甘油，攪拌均勻后，并于-S(TC真空冷凍干燥 后使用1.0%的戊二醛溶液在4(TC下交聯(lián)15h，交聯(lián)完成后使用蒸餾水洗滌數(shù)次，再次真空 冷凍干燥成型，密封后使用Co-60滅菌得到類人膠原蛋白止血海綿成品。
權(quán)利要求
一種規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，其特征在于包括以下步驟1)將類人膠原蛋白用蒸餾水溶解成1.0％～2.0％的溶液；2)將殼聚糖用稀酸溶解成0.5％～1.0％的溶液；3)將上述兩種溶液混合后再加入甘油和/或山梨醇攪拌均勻，過濾后真空脫泡；4)將上述混合液注入不同規(guī)格的模具中，-40℃～-80℃預(yù)冷凍后進(jìn)行真空冷凍干燥；5)上述干燥完成后的海綿使用0.1％～1.0％的戊二醛溶液交聯(lián)；6)交聯(lián)完成后使用蒸餾水洗滌數(shù)次后再次凍干成型；7)上述凍干完成后的海綿密封后Co-60滅菌得到類人膠原蛋白止血海綿成品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，其特征在于所用的類人膠原蛋白為使用基因重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)的一種人源型膠原蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，其特征在于所用的殼聚糖的脫乙酰度為70% 95%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，其特征在于所用的殼聚糖分子量為105 5X 105Da。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任意之一所述規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，其特征 在于所用的稀酸為稀鹽酸、稀醋酸或稀乳酸中的任意一種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任意之一所述規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，其特征 在于類人膠原蛋白與殼聚糖混合過程中質(zhì)量比為(5 20) : 1。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任意之一所述規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，其特征 在于在類人膠原蛋白和殼聚糖混合溶液中加入了重量百分比為2. 0% 5. 0%的甘油和/ 或山梨醇。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任意之一所述規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，其特征在于所用的模具可以根據(jù)臨床需求制成任意形狀。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法，包括以下步驟將類人膠原蛋白用溶解成1.0％～2.0％的溶液；將殼聚糖用稀酸溶解成0.5％～1.0％的溶液；將上述兩種溶液混合均勻，加入甘油和/或山梨醇，混合攪拌、過濾后真空脫泡；將上述混合液注入模具中于-40℃～-80℃預(yù)凍，冷凍干燥后使用0.1％～1.0％的戊二醛溶液交聯(lián)，交聯(lián)完成后使用蒸餾水洗滌數(shù)次后再次真空冷凍干燥，然后Co-60滅菌后得到類人膠原蛋白止血海綿成品。與目前臨床廣泛應(yīng)用的止血材料相比，所制備的止血海綿機械性能良好、生物相容性優(yōu)異，徹底杜絕了動物膠原蛋白止血材料所不可避免的病毒隱患，保證了止血材料在臨床使用中的安全性。
文檔編號A61L15/42GK101695581SQ20091021851
公開日2010年4月21日 申請日期2009年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月26日
發(fā)明者朱晨輝, 段志廣, 范代娣, 馬曉軒 申請人:西北大學(xué);