專利名稱：一種乳腺癌抑癌蛋白的鑒定及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及到一種乳腺癌抑癌蛋白PIASl (proteininhibitor of activated STAT 1)的鑒定，及其在乳腺癌基因治療中的應用。
背景技術：
乳腺癌是發(fā)生于乳腺腺體及導管的惡性腫瘤，是女性發(fā)病率最高的癌癥，是當今 世界人類疾病中最常見的發(fā)病和死亡原因之一，嚴重威脅著人類的生命和健康。因此乳腺 癌的防治已是世界性的保健問題，是世界衛(wèi)生組織重點防治的疾病。根據(jù)美國癌癥協(xié)會ACS 的數(shù)據(jù)，在美國，10萬人中乳腺癌發(fā)病率約為113. 3人，在我國，乳腺癌的發(fā)病率正逐年上 升，在許多大城市已高居女性腫瘤的首位，給社會和家庭帶來巨大的財產(chǎn)損失和精神痛苦。目前，乳腺癌的發(fā)病機理還不完全清楚，尚無有效預防措施。眾所周知，大多數(shù)癌 癥包括乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個長時間的，慢性的病理變化過程，目前所用乳腺癌的診斷 方法只能診斷出瘤體已長到一定體積的癌癥，這在許多情況下，已為時過晚。當前乳腺癌的 治療仍以藥物治療、放療以及手術切除為主，但至今還沒有一種行之有效的診斷和治療方 法。手術雖然切除了腫瘤病灶，但也部分甚至全部切除了相應的組織器官，喪失了其正常的 功能；而放療在放射線殺傷腫瘤細胞的同時，也對機體正常組織細胞產(chǎn)生了損傷作用，很大 程度限制了腫瘤治療；藥物治療由于療效不強和具有較強的毒副作用，而給患者遭成極大 的身體和心里創(chuàng)傷。和其他癌癥一樣，乳腺癌的有效預防和治療也有待于弄清和闡明乳腺 癌的發(fā)病機理，因此基因療法就顯得尤為重要。AIB “amplified in breast cancer 1)是一種癌蛋白，它的 mRNA 的高水平往往 伴隨著乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，并導致病人存活率的下降；人類AIBl轉基因過表達的小鼠，則 伴隨著乳腺的異常增生和乳腺癌的發(fā)生；AIBl和表皮生長因子受體酪氨酸激酶HER2的過 表達會伴隨著對藥物它莫西芬(Tamoxifen)治療抗性的產(chǎn)生，導致治療失效。此外，AIBl作 為轉錄輔激活因子，促進了轉錄因子如雌激素受體(ERa)等的轉錄激活，進一步促進乳腺 癌的發(fā)生、發(fā)展。癌蛋白AIBl能增強乳腺癌多條信號轉導通路的能力表明，AIBl是乳腺癌 治療的一個潛在靶標。針對乳腺癌細胞，通過一定的方式抑制AIBl的活性，是預防和治療乳腺癌的一 種策略。而蛋白質(zhì)的活性是受蛋白質(zhì)的化學修飾所調(diào)控的，其中蛋白質(zhì)的SUM0(Small ubiquitin-like modifier)化修飾是重要的調(diào)控方式之一。SUMO化修飾是SUMO小分子在 ATP存在的情況下，經(jīng)一系列酶如SUMO活化酶(El) ,SUMO結合酶(E2)、SUM0連接酶(E3)的 催化作用，最終與靶蛋白底物結合。SUMO化修飾在信號轉導、核質(zhì)運輸、轉錄活性抑制等方 面均發(fā)揮著重要的作用。我們研究證明AIBl的SUMO化修飾可以抑制AIBl的轉錄活性，并 鑒定出 PIASl (protein inhibitor of activated STAT 1)蛋白是 AIBl 發(fā)生 SUMO 化修飾 的E3連接酶。以前對PIAS蛋白家族的研究，大多表明其作為蛋白質(zhì)之間相互作用的構架 蛋白，參與包括 STAT (Signal transducer and activator oftranscription)、Wnt、TGF β、 NF- κ B等在內(nèi)的細胞信號轉導通路，而PIASl作為AIBl發(fā)生SUMO化修飾的Ε3連接酶還沒有報道。因此，通過蛋白質(zhì)的SUMO化修飾來調(diào)控癌蛋白AIBl的活性，將對乳腺癌的抑制產(chǎn) 生良好的效果，可應用于乳腺癌的基因治療當中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種乳腺癌的抑癌蛋白PIASl的鑒定方法。 PIASl蛋白能和癌蛋白AIBl發(fā)生相互作用，PIASl蛋白是癌蛋白AIBl發(fā)生SUMO化修飾的 E3連接酶，并能有效地抑制乳腺癌細胞MCF-7的生長和增殖。本發(fā)明的技術方案是從研究癌蛋白AIBl的SUMO化修飾入手，采用生物技術，首 先證明出PIASl蛋白和癌蛋白AIBl發(fā)生相互作用；進而鑒定出PIASl蛋白是AIBl發(fā)生 SUMO化修飾的E3連接酶，并使癌蛋白AIBl的轉錄活性得到抑制；最后通過動物實驗證明， 將表達PIASl蛋白的質(zhì)粒pcMV5-Flag-PIASl轉入MCF-7細胞，再將這種過表達PIASl的 MCF-7細胞注射入裸鼠(BALB/c，Charles River,Beijing,China)雙側乳房的脂肪中，能有 效地抑制乳腺癌細胞MCF-7的生長和增殖。本發(fā)明的效果和益處是將PIASl基因在乳腺癌細胞中過表達，從而起到預防和 治療乳腺癌的作用，這種基因治療的新方法將克服傳統(tǒng)的藥物治療、放療以及手術切除等 方法所給病人帶來的精神上和肉體上的痛苦，使乳腺癌的防治更為安全有效。惡性腫瘤如 乳腺癌是世界衛(wèi)生組織重點防治的疾病，它給社會和每個家庭帶來巨大的財產(chǎn)損失和精神 痛苦，攻克乳腺癌這一難題必將會帶來巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。


圖1是證明抑癌蛋白PIASl和癌蛋白AIBl在體內(nèi)存在相互作用的免疫共沉淀 實驗結果圖。圖1中A和B實驗均采用人乳腺癌MCF-7細胞系。圖1中A實驗采用兔源 anti-AIBl抗體，圖左是陰性對照，首先沉降內(nèi)源性的AIBl蛋白，用鼠源anti-PIASl抗 體檢測內(nèi)源PIASl蛋白，箭頭指示的是目的條帶PIASl蛋白，其分子量約75kDa。圖1中 B實驗采用兔源anti-PIASl抗體，圖左作為陰性對照，同樣首先沉降PIASl蛋白，再用鼠 源anti-AIBl檢測內(nèi)源AIBl蛋白，箭頭指示的是目的條帶AIBl蛋白的位置，其分子量約 160kDao實驗結果證明了抑癌蛋白PIASl與癌蛋白AIBl在MCF-7細胞內(nèi)存在著相互作用。圖2是證明抑癌蛋白PIASl的過表達能促進癌蛋白AIBl的SUMO化修飾的實驗 結果圖。實驗采用的是乳腺癌MCF-7細胞系，圖中自左向右依次轉入pcMV5空載體(陰 性對照)、pcMV5-Flag-PIASl、喪失E3連接酶活性的pcMV5_Flag_PIASl (M)突變體，即 PIASl的351位的半胱氨酸(C)突變成絲氨酸(S)。經(jīng)過兔源anti-AIB 1抗體沉降，鼠源 anti-SUMO-Ι抗體檢測，我們在相應位置，箭頭指示處，可以看到SUM0-1化修飾的AIBl條 帶，并且發(fā)現(xiàn)過表達野生型PIASl蛋白能增強癌蛋白AIBl的SUMO化修飾，而過表達SUMO 連接酶E3功能喪失的PIASl (C351S)突變體則沒有這種現(xiàn)象。圖3是證明抑癌PIASl抑制癌蛋白AIBl轉錄活性的熒光素酶報告基因的 實驗結果圖。圖3中縱軸表示熒光素酶活性的相對值，橫軸表示轉入5組不同質(zhì)粒 的細胞樣品。將Gal4-Luc質(zhì)粒分別和pcDNA3. 1空載體、pcDNA3. l-Gal4_DBD_AIBl、 pcMV5-Flag-PIASl按照一定比例轉入C0S-7細胞系。測定報告基因的活性，可以看出，過表 達pcDNA3. 1-Gal4-DBD-AIB1能增強報告基因的轉錄活性，但AIBl的轉錄活性受PIASl的抑制，并且這種抑制作用隨著PIASl表達量的增加，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。圖4是動物實驗證明過表達抑癌蛋白PIASl能抑制乳腺癌的結果圖。圖4中A 是轉染pcMV5空載體的乳腺癌MCF-7細胞注射入雌性裸鼠的實驗結果；而圖4中B是轉染 pcMV5-Flag-PIASl質(zhì)粒的乳腺癌MCF-7細胞注射入雌性裸鼠的實驗結果，橢圓線的部分， 圖中B和圖中A相比，過表達PIAS1蛋白的裸鼠腫塊明顯被抑制了。
具體實施例方式以下結合技術方案和附圖詳細敘述本發(fā)明的具體實施方式
。1.證明抑癌蛋白PIASl和癌蛋白AIBl在體內(nèi)存在相互作用的免疫共沉淀實驗IOcm培養(yǎng)板接種人類乳腺癌MCF-7細胞系，于37°C 5% CO2條件下，采用含10% 胎牛血清(Hyclone公司)的DMEM細胞培養(yǎng)液(Gibco公司)培養(yǎng)48小時后，冰冷PBS緩 沖液清洗細胞后，加裂解液(50mM Tris-HCl, pH 8. 0,150mM NaCl, 1% Nonidet P-40 和 0. 5% sodium deoxycholate，以及 1 100稀釋的蛋白酶抑制劑(Roche Applied Science, Indianapolis, IN))裂解細胞，4°C 12000轉，離心10分鐘后取上清。圖1中A實驗是上清加兔源anti-AIBl抗體；B實驗是上清加兔源anti_PIASl 抗體(santa cruz 公司)，于 4°C孵育過夜后，加 Protein A-Sepharose 4B 50ul 于 4°C孵 育 4 小時。40C 5000 轉離心 10 分鐘，用洗液(20mM Tris-HCl, pH 7. 5,800mM NaCl,0. 5% Nonidet P_40，and 0. 05% sodium deoxycholate)清洗 4 次后，去除上清。加 6XSDS 上樣 緩沖液和DDT后煮沸5分鐘，跑8% SDS-聚丙烯酰胺電泳，將蛋白采用電轉儀(Pall Corp) 在100V條件下電轉90分鐘到醋酸纖維素膜(Millipore公司)上。10%的脫脂牛奶封閉 膜2小時后，依次用一抗圖1中A實驗加鼠源anti-PIASl抗體；B實驗加鼠源anti-AIBl 抗體(santa cruz公司)，和二抗HRP標記的羊抗鼠抗體(Roch公司)孵育，再用化學發(fā)光 試劑(Amersham Biosciences)發(fā)光，并在膠片上曝光，相顯色出條帶。2.證明PIASl過表達促進AIBl的SUMO化修飾實驗IOcm培養(yǎng)板接種人乳腺癌MCF-7細胞，培養(yǎng)40小時后，用 Lipofectamine2000 (Invitrogen)按照產(chǎn)品說明，分別將pcMV5空載體、 pcMV5-Flag-PIASl、喪失E3連接酶活性的pcMV5_Flag_PIASl (M)突變體質(zhì)粒，各24 μ g轉 染進細胞中。轉染4小時后，換10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)24小時。冰冷PBS緩沖液清洗 細胞3次后，加裂解液裂解細胞，4°C 12000轉離心10分鐘，取上清。上清加兔源anti-AIB 1抗體于4°C孵育過夜后加Protein A-Sepharose 4B 50ul于4°C孵育2-4小時。4°C 5000 轉離心 10 分鐘，用洗液(20mM Tris-HCl, pH 7. 5,800mMNaCl,0. 5 % Nonidet P-40，and 0. 05% sodium deoxycholate)清洗4次后去除上清。加6XSDS上樣緩沖液和DDT后煮沸 5分鐘，用8% SDS-聚丙烯酰胺電泳，將蛋白電轉到醋酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉膜 2小時后，依次用一抗鼠源anti-SUMO-Ι抗體(santa cruz公司)，和二抗HRP標記的羊 抗鼠抗體(Roch公司)孵育，再用化學發(fā)光試劑發(fā)光，并在膠片上曝光顯出條帶。3.證明PIASl抑制AIBl轉錄活性的熒光素酶報告基因?qū)嶒?4孔培養(yǎng)板接種C0S-7細胞系，于37°C 5% CO2條件下采用含10%胎牛血清 (Hyclone公司)的DMEM細胞培養(yǎng)液(Gibco公司)在37 °C 5 % CO2條件下培養(yǎng)14小 時后，采用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)按照產(chǎn)品說明進行哺乳動物瞬時轉染實驗，將 pcDNA3. 1 空載體、pcDNA3. l-Gal4_DBD_AIBl、pcMV5_Flag_PIASl 分別和 pcDNA3. 1-Gal4-Luc按照一定比例轉入C0S-7細胞系中。轉染4小時后，細胞的培養(yǎng)液由 無酚紅無血清的培養(yǎng)液轉換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24小時后，用冰冷PBS 清洗，收集裂解細胞，再用熒光素酶報告基因試劑盒(Promega公司)來檢測轉錄活性。4.證明過表達PIASl能抑制乳腺癌的實驗IOcm培養(yǎng)板接種人乳腺癌MCF-7細胞，培養(yǎng)40小時后，用 Lipofectamine2000 (Invitrogen)按照產(chǎn)品說明，將 pcMV5 空載體和 pcMV5_Flag_PIASl 分 別轉染進不同的MCF-7細胞中，4小時后，換10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)24小時。收獲生 長狀態(tài)良好的細胞，按約110個細胞/0. Iml注射入4周大小的雌性裸鼠(BALB/c，Charles River, Beijing, China)雙側乳房的脂肪中。第21周處死裸鼠，并用游標卡尺測量腫瘤的
大小。
序列表
<110>大連理工大學環(huán)境與生命學院
<120> 一種乳腺癌抑癌蛋白的鑒定及其應用
<130> 一種乳腺癌抑癌蛋白的鑒定及其應用
<160>2
<170>Patent in version 3. 3
<210>1
<211>516
<212>DNA
<223>pcMV5-Flag-PIASl 質(zhì)粒中 PIASl 的基因序列
PIASl 的基因編號NCBI Reference Sequence :NM_019663. 3
SEQ ID NO 1
atggcggacagtgcggaactaaagcaaatggttatgagccttagagtttctgaactccaagtactgttg
ggctacgctgggaggaacaagcacggacgcaaacacgaacttcttacaaaagccctgcatttgttaaaggctggctgtagtcctgctgtacaaatgaaaattaaag aactctacaggaggcggttccctcagaaaattatgacgcctgcggacttgtctatccccaacgtacattcaagtcctatgcctccgactctttctccatccaccattccac agetcacttatgatggccaccctgcatcatccccactactccctgtttctcttctgggacccaaacatgaactggaactcccacatctcacgtcagcgctgcacccagtccac ccggacataaagctgcagaagctaccattctatgacctgttggatgaactgatcaagcccaccagtctagcttcagacaacagccagcgctttcgggaaacctgttttgc atttgccttgacaccacaacaggtgcagcagatcagcagctccatggatatttctgggaccaaatgtgacttcacagtgcaggtccaattaaggttttgtttatcaga aaccagttgtccacaagaagatcacttcccacccaacctttgtgtaaaagtgaatacaaaaccttgcagccttccaggttaccttccacctactaaaaacggtgtggaaccaa agcgacctagccgaccaattaatatcacctcacttgtccgattgtccacgacagtaccaaataccattgttgtttcttggactgcagaaattggaagaacctattccatg gcagtatatcttgtaaaacagttgtcctcaacagttcttcttcag
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權利要求
一種乳腺癌抑癌蛋白的鑒定，其特征在于在乳腺癌MCF 7細胞系中，PIAS1蛋白和AIB1發(fā)生相互作用，PIAS1蛋白是癌蛋白AIB1發(fā)生SUMO化修飾的E3連接酶，并且能使癌蛋白AIB1的轉錄活性得到抑制。
2.一種乳腺癌抑癌蛋白的應用，其特征還在于將表達PIASl蛋白的質(zhì)粒 pcMV5-Flag-PIASl轉入MCF-7細胞中，能有效地抑制乳腺癌細胞MCF-7的生長和增殖，用于 乳腺癌的基因治療。
全文摘要
一種乳腺癌抑癌蛋白的鑒定及其應用，屬于生物技術領域。提供一種乳腺癌抑癌蛋白的鑒定，其特征在于篩選出PIAS1(protein inhibitor of activated STAT 1)蛋白和AIB1(amplified in breast cancer 1)發(fā)生相互作用，PIAS1蛋白是癌蛋白AIB1發(fā)生SUMO化修飾的E3連接酶，并且能使癌蛋白AIB1的轉錄活性得到抑制；其特征還在于將表達PIAS1蛋白的質(zhì)粒pcMV5-Flag-PIAS1轉入MCF-7細胞中，動物實驗證明能有效地抑制乳腺癌細胞MCF-7的生長和增殖。本發(fā)明的效果和益處是這種基因治療的新方法用于乳腺癌患者，將克服傳統(tǒng)的藥物治療、放療以及手術切除等方法所給病人帶來的精神上和肉體上的痛苦，并將帶來巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。
文檔編號A61P15/14GK101923095SQ200910220338
公開日2010年12月22日 申請日期2009年11月27日 優(yōu)先權日2009年11月27日
發(fā)明者伍會健, 劉文棟, 洪永德, 過倩萍 申請人:大連理工大學