專利名稱：：一種治療結(jié)腸癌的藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藥品，是一種治療結(jié)腸癌的藥物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：據(jù)報(bào)道的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率逐年以2%左右遞長率增加，同時治療結(jié)腸癌的藥物也在不斷推向市場。西藥常用藥物主要有氟尿嘧啶、絲裂霉素、亞硝脲素及呋喃氟尿嘧啶等，中藥常用藥主要有消癌平片、珍香膠囊、西黃丸、抗癌平丸、華蟾素口服液、復(fù)方斑蝥膠囊等。臨床表明，有些西藥雖然療效較好，但對胃腸粘膜有較強(qiáng)的刺激作用，并對肝腎有較大損傷，特別是長期服用對患者自身免疫力的損害也較大；中藥的副作用雖然少了很多，但是，療效欠佳；無論是治療結(jié)腸癌未轉(zhuǎn)移癥、還是結(jié)腸癌多發(fā)轉(zhuǎn)移癥，其臨床效果甚微，所以，手術(shù)治療為患者的主要選擇，但是，手術(shù)后的化療期一般均聯(lián)合使用治療結(jié)腸癌的西藥，因此，給患者帶來較大痛苦。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是，提供一種治療結(jié)腸癌的藥物及其制備方法，主要治療結(jié)腸癌未轉(zhuǎn)移癥狀，無毒副作用，配合手術(shù)后的化療期使用，從而減輕患者痛苦。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的，通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種治療結(jié)腸癌的藥物，包括藥物有效成份和藥用輔料制成的藥劑，藥物有效成份為3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷，其結(jié)構(gòu)式為μ30八HC29H46O2423本發(fā)明所述藥劑劑型為片劑或膠囊。本發(fā)明所述藥劑劑型為水針劑或凍干粉劑。本發(fā)明所述藥劑劑型為散劑或顆粒劑。本發(fā)明的一種治療結(jié)腸癌的藥物的制備方法，包括以下步驟①取地榆炭粉碎后為藥物原料，加入原料十倍量的甲醇或乙醇，或含水醇類，常溫或加熱至60°C-90°C，提取1-24小時，重復(fù)提取1-3次，過濾，濾液在常壓或減壓下濃縮得到流浸膏；②將步驟①中流浸膏用5-10倍于流浸膏重量的水分散，取加水量1/3體積的氯仿進(jìn)行萃取，重復(fù)萃取5-8次，將萃取液常壓或減壓回收溶劑，得浸膏；③將步驟②的浸膏進(jìn)行硅膠柱層析分離，采用石油醚_丙酮系統(tǒng)梯度洗脫，將石油醚-丙酮體積比為8020部分合并，回收溶劑，放置后析出白色粉末，抽濾得到3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷；④按重量比取3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷為2090%，其余為藥用輔助料，按照藥劑的常規(guī)制備方法制成藥劑。本發(fā)明藥物的有效成份3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷為單體物質(zhì)，呈白色粉末狀。本發(fā)明藥物有效成份的結(jié)構(gòu)式用高分辨快原子轟擊質(zhì)譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z為409.3474[M-H]+(C29H45O,計(jì)算值409.3465)，分子式為C29H44O15紅外光譜(溴化鉀)cnT13464(OH)，2938(飽和C-H)，1452、1386(CH3)。無畸變極化轉(zhuǎn)移增強(qiáng)譜(DEPT譜)顯示分子中含有7個甲基(CH3),9個亞甲基(CH2),6個次甲基(CH)和7個季炭。核磁共振-氫譜(1H-NMR譜)顯示5個甲基單峰信號δ0.95(Η-26)，1.02(Η-25)，1.05(Η-27)，1.08(Η-24)，1.27(Η-23)和2個甲基雙峰信號0.88(H_29，3H，d,J=6.9Hz),0.96(H_30，3H，d,J=7.9Hz)；—個連氧碳上的氫信號δ3·50(Η-12，1Η，dd，J=10.8，5.2Hz)和一個烯氫信號δ5.71(Η-12，m)。核磁共振-炭譜(13C-NMR)譜顯示4個烯碳特征信號δ117.5(C-12)、δ128.9(C-17)、δ133.5(C-18)和137.6(C-13)以及1個連氧碳信號78.2(C-3)，本發(fā)明藥物有效成份為28位缺失的烏蘇烷型化合物。經(jīng)DEPT譜、異核多重鍵相關(guān)譜(HMBC譜)、異核多量子相干譜(HMQCHf)使本發(fā)明藥物的有效成份C、H歸屬得以確認(rèn)，其名稱為3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷(3β-hydroxy-28-norurs-12,17(18)-dien)。本發(fā)明藥物有效成份來源于地榆炭，地榆炭有較好的凝血止血作用、斂瘡作用。申請人研究發(fā)現(xiàn)，地榆炭中的3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷對結(jié)腸腫瘤細(xì)胞有顯著的抑制其生長的作用，并且還能抑制結(jié)腸腫瘤新生血管的形成，從而為治療結(jié)腸癌未轉(zhuǎn)移癥狀提供了極好的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)表明3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷具有顯著的藥理作用。1、抗腫瘤本發(fā)明藥物的有效成份為烏蘇烷型五環(huán)三萜化合物，熊果酸(烏蘇酸)是該類化合物的代表性成分。熊果酸為一廣譜的抗腫瘤化合物，在體外對多種腫瘤細(xì)胞有毒性作用。熊果酸不但能抑制腫瘤細(xì)胞生長，而且還能抑制腫瘤新生血管的形成。1.1材料人結(jié)腸癌細(xì)胞系ΗΤ29(ΗΤΒ_38，購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所，美國馬里蘭州羅克韋爾市)置于RPMI-1640(Hyclone，美國猶他州洛根市)培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含有10%小牛血清(Hyclone，美國猶他州洛根市)及抗生素(100單位/毫升青霉素，及100毫克/毫升鏈霉素)(Hyclone，美國猶他州洛根市)。細(xì)胞在37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育。受試樣品為3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷，臨用時以二甲亞砜(dimethylsulfoxide,DMS0)溶解，加培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，使DMSO終濃度為1%。1.2.實(shí)驗(yàn)方法取處于指數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞，應(yīng)用0.25%胰酶和3毫摩爾/升乙二胺四乙酸混合消化液進(jìn)行消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升ιχIO4,按每孔0.1毫升接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。無血清RPMI-1640同步化后24小時，細(xì)胞繼續(xù)在不同藥物作用濃度下培養(yǎng)48小時，每濃度組設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)后進(jìn)行噻唑蘭(MTT)比色(MTT5毫克/毫升，37攝氏度，4小時)并繪制藥物濃度與540納米吸光度之間的關(guān)系曲線。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組吸光度/正常組吸光度X100%。1.3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本發(fā)明藥物有效成份對人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的抑制作用由附圖9可知，本發(fā)明藥物有效成份對人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的生長具有較強(qiáng)的抑制作用，并且顯示一定的劑量依賴關(guān)系，在最高劑量(20微克/毫升)時，對細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，達(dá)到93.93%。本發(fā)明所述藥物經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)表明對結(jié)腸癥具有極顯著的治療作用；本發(fā)明藥物對結(jié)腸癌細(xì)胞HT29荷瘤小鼠的治療作用動物實(shí)驗(yàn)如下1、實(shí)驗(yàn)材料人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29(HTB_38，購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所，美國馬里蘭州羅克韋爾市)。ICR小鼠，雌性，體重20士2克(山東大學(xué)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物許可號SCXK魯20030004)；小鼠白介素_2、腫瘤壞死因子-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購自晶美生物工程有限公司。受試藥物3β-輕基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷注射液，生理鹽水稀釋至所需濃度。2、實(shí)驗(yàn)方法將人結(jié)腸癌細(xì)胞株接種于正常小鼠腹腔內(nèi)，讓其大量繁殖，7天后抽取腹水(無血性)，用滅菌生理鹽水稀釋成細(xì)胞濃度為5XIO6個/毫升的接種液，于小鼠腹背側(cè)部皮下注射含5XIO6癌細(xì)胞的懸液0.5毫升，成瘤后用組織塊套管針法皮下移植為實(shí)體瘤。將結(jié)腸癌皮下移植的小鼠隨機(jī)分為5組，各組于移植后第6天開始給藥，陽性組為環(huán)磷酰胺，空白組和模型組為生理鹽水，每天給藥1次，共用7天后停藥。末次給藥24小時后摘眼球取血，收集血液，取血清-20°C備用。臨用前平衡至室溫，按照ELISA試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，測定細(xì)胞因子白介素-2、腫瘤壞死因子-α的水平；頸椎脫白處死小鼠，剝?nèi)×鰤K、胸腺，計(jì)算抑瘤率、胸腺指數(shù)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>與模型組相比*P<0.05#P<0.01與正常組相比#P<0.05##P<0.01受試本發(fā)明藥物可抑制小鼠移植性腫瘤的生長，高、中劑量組抑瘤率分別為51.52%,46.09%，與模型組相比P<0.01或P<0.05；陽性對照環(huán)磷酰胺可明顯抑制小鼠腫瘤的生長，但小鼠體重明顯偏小，胸腺指數(shù)明顯偏低，本發(fā)明藥物各劑量組不會降低小鼠體重和胸腺指數(shù)，本發(fā)明藥物對正常機(jī)體影響較小，無明顯毒副作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>與正常組相比:#Ρ<0.05##Ρ<0.01與模型組相比:*Ρ<0.05**Ρ<0.01與正常組比較，模型組和陽性組荷瘤小鼠細(xì)胞因子水平明顯降低(P<0.01)，與模型組比較，化合物高、中劑量組小鼠細(xì)胞因子明顯升高(P<0.01或0.05)，從而調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的生長分化、激活巨噬細(xì)胞，在抗腫瘤免疫中起著重要的調(diào)節(jié)作用。動物實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明藥物具有極好的結(jié)腸癌腫瘤抑制作用，不會明顯降低小鼠胸腺指數(shù)；還可升高小鼠細(xì)胞因子白介素_2、腫瘤壞死因子-α水平，從而可通過調(diào)節(jié)荷瘤小鼠的免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤的作用。實(shí)驗(yàn)表明由于本發(fā)明藥物對治療結(jié)腸癌有顯著的效果，因此，患者可以在結(jié)腸癌治療中使用本發(fā)明所述的各種藥物劑型。本發(fā)明藥物還可以替代手術(shù)后的化療期聯(lián)合使用的西藥，從而徹底消除西藥的毒副作用。附圖1本發(fā)明藥物有效成份紫外圖譜；附圖2為本發(fā)明藥物有效成份紅外圖譜；附圖3為本發(fā)明藥物有效成份高分辨快原子轟擊質(zhì)譜；附圖4為本發(fā)明藥物有效成份核磁共振氫譜；附圖5為本發(fā)明藥物有效成份核磁共振炭譜；附圖6為本發(fā)明藥物有效成份無畸變極化轉(zhuǎn)移增強(qiáng)譜；附圖7為本發(fā)明藥物有效成份異核多量子相干譜；附圖8為本發(fā)明藥物有效成份異核多重鍵相關(guān)譜；附圖9為本發(fā)明藥物有效成份對人結(jié)腸癌細(xì)胞ΗΤ29的抑制作用效果圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例本發(fā)明藥物包括藥物有效成份和藥用輔料制成的藥劑，藥物有效成份為3β_羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷，其結(jié)構(gòu)式為μ30,J22/ψκΧiδ!HJ27八HC29H46O2423藥物有效成份的重量百分比為20-90%，其余為藥用輔料。本發(fā)明藥物可以制成各種劑型，如注射劑水針劑、凍干粉劑，片劑、膠囊、顆粒劑、散劑或口服液。本發(fā)明藥物的制備方法是先采用地榆炭提取藥物有效成份，然后按照常規(guī)制藥方法制備成所需藥劑，包括以下步驟①取地榆炭粉碎后為藥物原料，加入原料十倍量的甲醇或乙醇，或含水醇類，常溫或加熱至60°C-90°C，提取1-24小時，重復(fù)提取1-3次，過濾，濾液在常壓或減壓下濃縮得到流浸膏；②將步驟①中流浸膏見5-10倍于流浸膏重量的zRiM，取加水量1/3體積的氯仿進(jìn)行萃取，重復(fù)萃取5-8次，將萃取液常壓或減壓回收溶劑，得浸膏；③將步驟②的浸膏進(jìn)行硅膠柱層析分離，采用石油醚_丙酮系統(tǒng)梯度洗脫，將石油醚-丙酮體積比為8020部分合并，回收溶劑，放置后析出白色粉末，抽濾得到3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷；④按重量比取3β-輕基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷為2090%，其余為藥用輔助料，按照藥劑的常規(guī)制備方法制成藥劑。本發(fā)明藥物在制備注射液時，其藥物有效成份的重量比取30-60%為佳，其他藥物劑型有效成份取30-90%為佳，本發(fā)明藥物的有效成份3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷為單體物質(zhì)，呈白色粉末狀。舉例說明幾種劑型①水針劑1000毫升藥物有效成份3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷25克，吐溫8010毫升，氯化鈉8克。取藥物有效成份3β-輕基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷25克，加吐溫8010毫升，注射用水250毫升，加熱溶解，濾過，加10%碳酸鈉調(diào)酸堿度至7.0-7.5，加入氯化鈉，加注射用水至1000毫升，G3垂熔漏斗(玻璃)濾過，分裝，灌封，100攝氏度流通蒸汽滅菌30分鐘，分裝于1毫升安瓿瓶中，每支含有含3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷25毫克。②膠囊劑1000粒藥物有效成份3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷50克，微晶纖維素50克，硬脂酸鎂1克。取藥物有效成份3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷50克，微晶纖維素50克，硬脂酸鎂1克，混勻，裝膠囊，每粒重0.1克，含3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷50毫克。③散劑1000包藥物有效成份3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷50克，乳糖450克。取藥物有效成份3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷50克、乳糖450克，研細(xì)，混勻，過篩，分包，每包重0.5克，含3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷50毫克。④片劑1000片藥物有效成份3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷50克，羥丙甲纖維素20克，糊精30克，硬脂酸鎂1克。藥物有效成份3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷、羥丙甲纖維素、糊精混合，以75%乙醇為粘合劑制濕顆粒，過22目篩，50攝氏度干燥3小時，22目篩整粒，加入硬脂酸鎂混勻壓片，每片重0.1克，含藥物有效成份3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷50毫克。權(quán)利要求一種治療結(jié)腸癌的藥物，其特征在于包括藥物有效成份為3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷和藥用輔料制成的藥劑，3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷的結(jié)構(gòu)式為F2009102313298C00011.tif2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療結(jié)腸癌的藥物，其特征在于所述藥劑劑型為片劑或膠囊。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療結(jié)腸癌的藥物，其特征在于所述藥劑劑型為水針劑或凍干粉劑。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療結(jié)腸癌的藥物，其特征在于所述藥劑劑型為散劑或顆粒劑。5.一種治療結(jié)腸癌的藥物的制備方法，其特征在于包括以下步驟①取地榆炭粉碎后為藥物原料，加入原料十倍量的甲醇或乙醇，或含水醇類，常溫或加熱至60°C-90°C，提取1-24小時，重復(fù)提取1-3次，過濾，濾液在常壓或減壓下濃縮得到流浸膏；②將步驟①中流浸膏用5-10倍于流浸膏重量的水分散，取加水量1/3體積的氯仿進(jìn)行萃取，重復(fù)萃取5-8次，將萃取液常壓或減壓回收溶劑，得浸膏；③將步驟②的浸膏進(jìn)行硅膠柱層析分離，采用石油醚-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫，將石油醚-丙酮體積比為8020部分合并，回收溶劑，放置后析出白色粉末，抽濾得到3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷；④按重量比取3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷為20-90%，其余為藥用輔助料，按照藥劑的常規(guī)制備方法制成藥劑。全文摘要本發(fā)明公開了一種治療結(jié)腸癌的藥物及其制備方法，包括藥物有效成份和藥用輔料制成的藥劑，藥物有效成份為3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷，其制備方法步驟①取地榆炭粉碎后為藥物原料，加入甲醇或乙醇，過濾，濾液在常壓或減壓下濃縮得到流浸膏；②將步驟①中流浸膏水分散，氯仿進(jìn)行萃取，得浸膏；③將步驟②的浸膏進(jìn)行硅膠柱層析分離，回收溶劑，放置后析出白色粉末，抽濾得到3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷；④按重量比取3β-羥基-28-缺失-12，17(18)-二烯烏蘇烷為20-90％，其余為藥用輔助料，按常規(guī)制備方法制成藥劑。本發(fā)明主要治療結(jié)腸癌未轉(zhuǎn)移癥狀，無毒副作用，配合手術(shù)后的化療期使用，從而減輕患者痛苦。文檔編號A61P35/00GK101810624SQ200910231329公開日2010年8月25日申請日期2009年12月2日優(yōu)先權(quán)日2009年12月2日發(fā)明者仲英,孫立立,施祖榮,楊書斌,袁振海申請人:山東省中醫(yī)藥研究院