專利名稱：一種特異性多糖制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種革蘭氏陰性細菌特異性多糖(也稱o-特異性多糖)制備方法。本
發(fā)明特別涉及的特異性多糖可以作為原材料或終產品用于疾病診斷、預防、治療等，也可制 備特異性多糖的標準品或參比品，尤其可用于制備偶聯疫苗。
背景技術：
革蘭氏陰性細菌的特異性多糖是脂多糖的一部分。脂多糖是革蘭氏陰性細菌外膜 外側的最主要成分，由3部分組成，分別是特異性多糖、核心多糖和脂類A。其中特異性多糖 是位于細菌最外側的結構，是細菌逃避宿主免疫攻擊的保護層，也是宿主免疫細胞俘獲細 菌的靶點，它決定了細菌的抗原特性，反映了細菌的血清型別；核心多糖是連接特異性多糖 和脂類A的部分；脂類A是脂多糖的致熱源部分。由于特異性多糖部分決定著細菌的血清 型別，在結構上具有型特異性，因此，是細菌診斷、病原菌預防和傳染病治療的重要目標。
由于特異性多糖是脂多糖中的一部分，因此，文獻記載的特異性多糖制備方法都 是在純化獲得脂多糖的基礎上，通過對脂多糖的水解，進而純化獲得特異性多糖。謝貴林 (福氏2a痢疾桿菌0-特異性多糖與破傷風類毒素結合疫苗的制備及其免疫學特性，《微 生物學免疫學進展》，2001年第29巻第1期)、王燕(宋內氏痢疾桿菌0-SP-TT結合疫苗 的制備及其免疫學特性的研究，《微生物學免疫學進展》，2002年第30巻第2期)等以特 異性多糖制備細菌性痢疾結合疫苗時，就是先純化出細菌脂多糖，經過弱酸水解、超速離 心、層析純化后，制備出特異性多糖。國外制備特異性多糖的方法也都是采用先提取脂多 糖，再通過對脂多糖的水解、純化，制備出特異性多糖。AnnaTurska-Szewczuk (Alteration ofO—specific polysaccharide structure of symbiotically defective Mesorhizobium loti mutant2213.1 derived from train NZP2213, Acta.Biochimica Polonica， 2008， Vol. 55， No. 1) 、Maciej ewska A (Structural analysis of the 0_specific polysaccharide isolated from Plesiomonasshigelloides 051 lipopolysaccharide， Carbohydr Res. 2009 12 ;344)禾口Per印elov AV， (Structure ofthe 0_polysaccharide of Escherichia coli 0112ab containing L_iduronic acid， Carbohydr Res. 200825 ;343) 等研究特異性多糖結構時，就是在純化獲得脂多糖的基礎上，進一步水解、純化制備出特異 性多糖部分。 以脂多糖為基礎制備特異性多糖是目前的通用方法。脂多糖的制備有多種方式， 包括最常用的熱酚抽提法、PCP法(酚_氯仿_石油醚法)、三氯醋酸法等。但通過提取脂 多糖后再純化特異性多糖存在有制備工藝復雜、使用苯酚等對人體和環(huán)境有危害的有機試 劑、產率低等眾多不利因素，需要更簡潔、有效的制備方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明創(chuàng)造了一種從菌體直接分離、純化制備特異性多糖的方法。 本發(fā)明的方法通過對菌體的直接水解，得到特異性多糖粗品，再經純化獲得特異性多糖。
因此，本發(fā)明的特異性多糖的制備方法，包括以下步驟 1)菌體處理， 2)菌體水解， 3)從水解液中分離特異性多糖， 4)純化特異性多糖。
本發(fā)明所述的菌體是革蘭氏陰性細菌經過培養(yǎng)收獲的活菌體或滅活菌體。
本發(fā)明所述菌體處理包括超聲、微波、重離子轟擊、凍融、機械攪磨等物理方式處 理，也可以采用Tween、Triton、膽酸類(如脫氧膽酸鈉)等表面活性劑等化學方式，還可以 采用溶菌酶、脂酶等生物處理方式。這些處理方式可單一采用、也可以混合使用。處理的目 的是使菌體容易水解。 本發(fā)明所述菌體水解是將菌體用酸或酶進行水解，步驟包括將菌體充分懸浮于 水、鹽水或緩沖液中，懸浮濃度(W/V)為100-0. 01 %，較佳濃度為50-0. 1%，良好濃度為 20-1%，最佳濃度為10-5%。菌懸液用酸或酶水解，最佳采用酸水解。酸可采用硫酸、鹽酸、 硝酸、磷酸等強酸，也可采用醋酸、三氯醋酸、檸檬酸、丁二酸、石炭酸等弱酸，最佳為醋酸。 酸水解的濃度為10-0. 01 % ，較佳濃度為5-0. 1 % ，最佳濃度為2-1 % 。水解可以在靜止或攪 拌條件下進行，溫度為0-20(TC，較佳溫度為50-15(TC，最佳溫度為90-100°C。水解時間根 據水解條件從數天到數分鐘不等，其中，1%醋酸IO(TC攪拌水解的時間為10-360分鐘，較 佳時間為30-180分鐘，最佳時間為60-120分鐘。
水解后得到的水解產物中含有特異性多糖。 本發(fā)明所述從水解液中分離包括通過適當手段去除菌體及碎片，常用方法有離 心、中空纖維過濾、超濾、深層過濾等。 還包括在水解完成后或去除菌體碎片后調整pH值至中性。 本發(fā)明所述純化特異性多糖，包括在用以下方法進行純化，有機溶劑分離、超濾分
離、層析分離，這些方法可以單一使用，也可以相互搭配使用。 熟悉生化分離的實驗人員均可以按現有技術中的方法進行上述操作。 本發(fā)明的方法，其優(yōu)點在于 1)簡化了流程，減少了操作環(huán)節(jié)，節(jié)省了時間。 2)去除了苯酚等高危害有機溶劑的使用，減少了對操作人員和環(huán)境的損害。
3)特異性多糖產量較常規(guī)方法提高數倍。


圖1為制備流程圖。
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發(fā)明。本實施例只是一種舉例，是本發(fā)明的解決方
案之一，并非將本發(fā)明局限于實施例。 實施例一細菌發(fā)酵培養(yǎng) 大腸桿菌菌種開啟后，接種至5ml LB培養(yǎng)基中，35t:震蕩培養(yǎng)6小時，轉種于500ml LB培養(yǎng)基中，搖床35t:震蕩培養(yǎng)6-8小時，轉種至10L菌種罐中，培養(yǎng)6_8小時 后，接種IOOL發(fā)酵罐，培養(yǎng)至對數生長末期，甲醛滅活后，離心收集菌體。50L培養(yǎng)液可獲得 1. 2Kg左右的濕菌體。
實施例二特異性多糖提取 200g菌體溶解至4000ml注射用水中，充分攪拌，升高溫度至IO(TC，加入冰醋酸至 終濃度1 % ，攪拌90分鐘，降溫至4°C ，調整pH值至中性，離心去除菌體，加入乙醇至濃度 25%，放置3小時以上，離心收集上清，加入乙醇至終濃度70-80%，放置過夜，離心收集沉 淀。沉淀用無水乙醇和丙酮各洗滌2遍，抽干獲得特異性多糖粗品，可使用到對純度要求較 低的領域。200g菌體可獲得特異性多糖粗品4g左右。
實施例三特異性多糖純化 通過實施例二制備的特異性多糖，可控制蛋白質3 %以內，核酸5 %以內，若需要 更高純度，可按本實施例進一步純化。 溶解特異性多糖至5-20mg/ml，離心收集上清，10K超濾膜循環(huán)洗滌，收集濾過液， 3K超濾膜濃縮、洗滌，收取截留液，乙醇沉淀或凍干收集純化多糖。可控制蛋白質1%以內， 核酸1%以內。 實施例四特異性多糖純化 特異性多糖粗品也可以通過本實施例的方法進一步純化。 溶解特異性多糖至5-20mg/ml，離心收集上清。上清液經羥基磷灰石層析，收集流 穿液，3K超濾膜濃縮、洗滌，乙醇沉淀或凍干收集純化多糖。
權利要求
一種特異性多糖的制備方法，其特征在于，以菌體為原料，對菌體直接水解，得到特異性多糖粗品，再經純化獲得特異性多糖。
2. 權利要求1的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1) 菌體處理，2) 菌體水解，3) 從水解液中分離特異性多糖，4) 純化特異性多糖。
3. 權利要求l的制備方法，其特征在于，所述菌體指經過培養(yǎng)收獲的活菌體或滅活菌體。
4. 權利要求l的制備方法，其特征在于，所述處理包括超聲、微波、重離子轟擊、凍融、 機械攪磨等物理方式處理，也可以采用Tween、 Triton、膽酸類(如脫氧膽酸鈉)等表面活 性劑等化學方式，還可以采用溶菌酶、脂酶等生物處理方式，這些處理方式可單一采用、也 可以混合使用。
5. 權利要求l的制備方法，其特征在于，所述水解包括酸解和酶解，可與處理同時進 行，所述酸解可采用硫酸、鹽酸、硝酸、磷酸等強酸，也可采用醋酸、三氯醋酸、檸檬酸、丁二 酸、石炭酸等弱酸，最佳為醋酸。
6. 權利要求1的制備方法，其特征在于，所述酸水解濃度為10-0.01%，最佳濃度為 2-1% ;水解溫度為0-20(TC，最佳溫度為90-10(TC，水解時間為數分鐘到數天，最佳時間為 60-120分鐘。
7. 權利要求l的制備方法，其特征在于，所述從水解液中分離包括通過適當手段去除 菌體及碎片，常用方法有離心、中空纖維過濾、超濾、深層過濾等。
8. 權利要求l的制備方法，其特征在于，還包括在水解完成后或去除菌體碎片后調整 pH值至中性。
9. 權利要求1的制備方法，其特征在于，所述純化特異性多糖，包括用以下方法進行純 化，有機溶劑分離、超濾分離、層析分離，這些方法可以單一使用，也可以相互搭配使用。
10. 權利要求1的制備方法，其特征在于，步驟如下200g菌體溶解至4000ml注射用水 中，充分攪拌，升高溫度至IO(TC ，加入冰醋酸至終濃度1 % ，攪拌90分鐘，降溫至4°C ，調整 pH值至中性，離心去除菌體，加入乙醇至濃度25X，放置3小時以上，離心收集上清，加入乙 醇至終濃度70-80%，放置過夜，離心收集沉淀，沉淀用無水乙醇和丙酮各洗滌2遍，抽干獲 得特異性多糖粗品，純化過程包括，溶解特異性多糖至5-20mg/ml，離心收集上清，10K超濾 膜循環(huán)洗滌，收集濾過液，3K超濾膜濃縮、洗滌，收取截留液，乙醇沉淀或凍干收集純化多糖 或溶解特異性多糖至5-20mg/ml，離心收集上清。上清液經羥基磷灰石層析，收集流穿液，3K 超濾膜濃縮、洗滌，乙醇沉淀或凍干收集純化多糖。
全文摘要
特異性多糖(也稱O-特異性多糖)是脂多糖的一個組成部分，本發(fā)明涉及一種特異性多糖制備方法，該方法利用水解手段，以完整菌體為出發(fā)材料，通過對菌體的直接水解制備特異性多糖，制備出的特異性多糖可以作為原材料或終產品用于疾病診斷、預防、治療等，也可制備特異性多糖的標準品或參比品，尤其可用于制備偶聯疫苗。
文檔編號A61K39/02GK101693747SQ20091023640
公開日2010年4月14日 申請日期2009年10月28日 優(yōu)先權日2009年10月28日
發(fā)明者朱衛(wèi)華, 杜琳 申請人:北京綠竹生物制藥有限公司;