專(zhuān)利名稱(chēng)：miR-223的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及miR-223的新用途。
技術(shù)背景
在2000年，隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃(human genome project, HGP)中人類(lèi)基因 組草圖繪制工作的完成，揭開(kāi)了組成人體10萬(wàn)個(gè)基因的30億個(gè)堿基對(duì)的秘密。研究 人員發(fā)現(xiàn)編碼基因的數(shù)目大約2-2. 5萬(wàn)左右，只占整個(gè)基因組長(zhǎng)度的1.5%，而剩下 的98. 5 %為非編碼序列。非編碼RNA包括核糖體RNA (rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA (tRNA)在內(nèi)的 組成性表達(dá)RNA (constructive RNA)和小干擾RNA (siRNA)、microRNA在內(nèi)的調(diào)控性 RNA(regulatoryRNA)。MicroRNA這種非編碼調(diào)控RNA，是由機(jī)體自我產(chǎn)生，具有18-25個(gè)堿 基，主要通過(guò)與靶基因信使RNA(mRNA)3’非翻譯區(qū)(3’ -UTR)配對(duì)結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的調(diào) 控。microRNA在個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化凋亡、疾病發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程起著重要作用， 它可以以轉(zhuǎn)錄水平或者轉(zhuǎn)錄后水平方式調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)。目前，根據(jù)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)顯 示miRNA總數(shù)達(dá)五千個(gè)左右，miR-223就是其中的一個(gè)。腫瘤是危害人類(lèi)身體健康的首要疾病之一，據(jù)報(bào)道癌癥患者的平均生存率僅為5 年，而癌癥治愈率只有20% -30%左右。過(guò)去十年我國(guó)雖然在腫瘤的防治方面取得了很大 進(jìn)展，出現(xiàn)了許多新技術(shù)新方法，發(fā)展了多種抗腫瘤免疫治療，但到目前為止，這些方法遠(yuǎn) 沒(méi)有達(dá)到人們的預(yù)期效果，一個(gè)重要的原因就是缺少生物治療。目前腫瘤治療中發(fā)展最為 迅速的一個(gè)領(lǐng)域是靶向藥物治療，被大家廣泛重視，同時(shí)基因治療代表著未來(lái)腫瘤防治方 向。髓系來(lái)源抑制細(xì)胞(MDSC)是近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者體內(nèi)大量聚積的一類(lèi)細(xì) 胞，參與腫瘤細(xì)胞的免疫編輯，包括免疫清除，免疫對(duì)抗，免疫逃逸三個(gè)過(guò)程，其在人類(lèi)外 周血的增高表達(dá)已經(jīng)在腎細(xì)胞癌，乳腺癌，結(jié)腸癌等中得到證實(shí)。在小鼠模型中，MDSCs 可積聚在骨髓、脾和外周血中。MDSCs是一群具有高度異質(zhì)性的髓系細(xì)胞群體，包括包括 1/3為末成熟巨噬細(xì)胞和樹(shù)突樣細(xì)胞，其他的是處于分化早期的髓系細(xì)胞。MDSCs在人表 達(dá)為⑶33+HLAT)R-細(xì)胞，在小鼠表達(dá)為CDllb+Gr-Γ細(xì)胞。小鼠⑶llb+Gr-Γ細(xì)胞通過(guò)形 態(tài)學(xué)、分子組成和功能學(xué)三方面分成了兩個(gè)亞型單核細(xì)胞型(MO-MDSCs)類(lèi)似炎癥性的 單核細(xì)胞，表達(dá)Ly6C標(biāo)記；低密度的多形核白細(xì)胞型(PMN-MDSCs)類(lèi)似不成熟的白細(xì)胞， 表達(dá)Ly6G標(biāo)記，它們都對(duì)T淋巴細(xì)胞有抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠⑶llb+Gr-Γ細(xì)胞中 白介素-10 (IL-10)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF- β )，白介素_6 (IL-6)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (VEGF)，類(lèi)前列腺素，前列腺素E2(PGE2)和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子α (SDF α )這些腫瘤相關(guān)因 子的釋放抑制了免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的成熟和分化，從而影響了細(xì)胞分化的正常途徑，導(dǎo)致MDSCs 的大量積聚。但是目前對(duì)于遺傳因素究竟如何影響MDSCs在腫瘤細(xì)胞中積聚的機(jī)制還沒(méi)有 具體闡明。腫瘤患者體內(nèi)大量積聚髓系來(lái)源抑制細(xì)胞(MDSCs)，這類(lèi)細(xì)胞可造成腫瘤細(xì)胞的 免疫逃逸。雖然具體抑制免疫的機(jī)制尚不明確，但MDSCs可抑制淋巴細(xì)胞的增殖并促使其凋亡；另外MDSCs可通過(guò)影響一氧化氮合酶、精氨酸酶的活性來(lái)影響腫瘤的生長(zhǎng)。因此通過(guò) 降低這群細(xì)胞，或促使其分化，可有助于腫瘤免疫激活，將是很有前景的腫瘤免疫輔助治療方法。因此，發(fā)現(xiàn)和研究可以抑制MDSCs在腫瘤細(xì)胞中積聚的因子對(duì)于腫瘤的預(yù)防、治
療等方面有著重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供miR-223的新用途。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是miR-223具有抑制髓系來(lái)源抑制細(xì)胞積聚的用途。優(yōu)選的，所述miR-223通過(guò)阻礙髓系來(lái)源抑制細(xì)胞(MDSCs)的積聚從而具有抑制 腫瘤生長(zhǎng)的用途。優(yōu)選的，所述腫瘤為腎細(xì)胞癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌或卵巢癌。優(yōu)選的，所述腫瘤為結(jié)腸癌、肺癌或卵巢癌。優(yōu)選的，所述腫瘤為結(jié)腸癌。優(yōu)選的，所述miR-223在制備用于抑制腫瘤生長(zhǎng)的藥物中的用途，即制備以 miR-223為靶點(diǎn)的藥物來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。優(yōu)選的，所述miR-223在制備用于抑制結(jié)腸癌、肺癌或卵巢癌生長(zhǎng)的藥物中的用途。優(yōu)選的，所述miR-223在制備用于抑制結(jié)腸癌生長(zhǎng)的藥物中的用途。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)分析對(duì)miR-223的功能進(jìn)行了初步研 究，發(fā)現(xiàn)miR-223具有抑制MDSCs的功能，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)miR-223具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的用途， 可以將miR-223設(shè)計(jì)為靶向藥物來(lái)治療腫瘤，對(duì)腫瘤臨床免疫治療有著潛在的巨大應(yīng)用價(jià) 值，并且為進(jìn)一步研究miR-223的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。


圖1是；實(shí)施例中所使用的引物圖譜；圖2是流式細(xì)胞分析對(duì)MDSCs分群結(jié)果圖譜；圖3是腫瘤鼠體內(nèi)MDSCs對(duì)miR-223的抑制圖譜；圖4是miR-223在不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械谋磉_(dá)圖譜；圖5是不同miRNA對(duì)MDSCs積累的影響圖譜；圖6是miR-223及其抑制劑對(duì)MDSCs積累的影響圖譜；圖7是不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蠱DSCs表達(dá)圖譜；圖8是miR-223及其抑制劑對(duì)MO-MDSCs和PMN-MDSCs積累的影響圖譜；圖9是MEF2C對(duì)MDSCs積累的影響圖譜；圖10是MEF2C對(duì)MDSCs不同亞群細(xì)胞的積累的影響圖譜；圖 11 是MEF2C 圖譜；圖12是miR-223對(duì)靶分子MEF2C表達(dá)的影響驗(yàn)證圖譜；
圖 13 是miR-223、miR-223 抑制劑、MEF2C3，UTR 及 MEF2C3，UTR 突變體及對(duì) MDSCs 的影響圖譜；圖14是miR-223抑制劑對(duì)腫瘤鼠體內(nèi)Grl+⑶lib+細(xì)胞分化的影響圖譜；圖15是不同腫瘤細(xì)胞上清和PGE2對(duì)MDSCs的分化的影響圖譜；圖16是與不同腫瘤細(xì)胞上清和PGE2共培養(yǎng)的BMCs中miR-223前體、成熟miR-223及MEF2C表達(dá)水平隨時(shí)間變化的圖譜；圖17是miR-223、MEF2C對(duì)BMCs分化的影響圖譜；圖18是miR-223與腫瘤生長(zhǎng)速度關(guān)系圖譜。
具體實(shí)施例方式為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖及具體實(shí) 施方式對(duì)本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1構(gòu)建腫瘤小鼠模型、BMCs的制備以及miRNA基因和3’ -UTR的表達(dá)構(gòu)建(1)腫瘤鼠模型的建立使用4-6周的雌性BALB/C鼠和C57BL/6鼠(北京動(dòng)物中心)，并且至少在實(shí)驗(yàn)前 一周將鼠飼養(yǎng)在不存在對(duì)鼠致病的病原體的環(huán)境內(nèi)，保證鼠處于病原體免疫狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)構(gòu) 建了 s. c.腫瘤模型(靜脈注射腫瘤模型)，包括在BALB/C鼠內(nèi)構(gòu)建CT26結(jié)腸癌(ATCC)模 型，以及在C57BL/6鼠體內(nèi)構(gòu)建Lewis肺癌模型和1D8卵巢癌模型(Ruby，Texas大學(xué))，鼠皮 下一次性注射100微升PBS，內(nèi)含5 X IO5腫瘤細(xì)胞。模型構(gòu)建時(shí)每個(gè)模型所注射的腫瘤細(xì)胞 的數(shù)量是以在注射后3-4周內(nèi)能形成一個(gè)直徑約為1. 5厘米的腫瘤為依據(jù)的，對(duì)于構(gòu)建好 的實(shí)驗(yàn)鼠，在腫瘤直徑約為0. 25厘米時(shí)，通過(guò)球后靜脈向模型鼠體內(nèi)一次性注射2. 5X IO6 轉(zhuǎn)染BMCs。(2)免疫磁珠法制備BMCs從患有CT26結(jié)腸癌、Lewis肺癌、1D8卵巢癌的小鼠的脾臟和血液中獲取細(xì)胞，按 照MACS公司擬定好的計(jì)劃通過(guò)免疫磁珠法制備BMCs，使用⑶4T淋巴細(xì)胞、⑶8T淋巴細(xì)胞 和B淋巴細(xì)胞的陽(yáng)性選定磁珠去除獲得的BMCs中⑶4+T淋巴細(xì)胞、⑶8+T淋巴細(xì)胞和B淋巴 細(xì)胞。具體實(shí)現(xiàn)上，殺死CT26結(jié)腸癌模型鼠，以無(wú)菌注射器分別從小鼠的脾臟和血液中獲 取細(xì)胞，使用水破壞紅細(xì)胞，并進(jìn)行血清封閉；用3mlPBS懸浮細(xì)胞，首先加入⑶8+T淋巴細(xì) 胞、⑶4+T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的抗體30 μ 1，在冰上靜置15分鐘后，用PBS洗一遍；之后 加入⑶4+Τ淋巴細(xì)胞、⑶8+Τ淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的陽(yáng)性選定的磁珠(MACS) 35 μ 1，冰上靜 置30分鐘，用PBS洗兩遍，得到不含⑶8+淋巴細(xì)胞、⑶4+Τ淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的BMCs。 除非特殊指明，下述實(shí)施例中所使用的BMCs均不含CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞和B淋 巴細(xì)胞。(3) miRNA基因和3，-UTR的表達(dá)構(gòu)建將鼠的基因組中的miR223，miR142-5p，miR181a-l 基因于 Hind III 和 Xho I 位點(diǎn) 克隆到pcDNA3. 1表達(dá)載體上。從ATCC購(gòu)買(mǎi)含有SP0RT6/MEF2C完全編碼序列(cDNA clone MGC :67973IMAGE =4500786)的表達(dá)載體，此編碼序列中包含一個(gè)含有miR-223種子序列的 3’_UTR。按照說(shuō)明書(shū)，通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的方法從鼠脾臟細(xì)胞的基因組DNA克隆MEF2C的3，UTR，并將其在Sac I和Not I位點(diǎn)連接到pIS2熒光素酶報(bào)告載體(Addgene)上。如圖1所示，設(shè)計(jì)4種不同的引物并通過(guò)上述PCR的方法構(gòu)建MEF2C的3’-UTR的突變 體1、突變體2，突變體經(jīng)過(guò)質(zhì)粒DNA測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。本發(fā)明中miR-223通過(guò)設(shè)計(jì)引物后克隆得到，其堿基序列為tctgg ccatctgcag tgtcacgctc cgtgtatttg acaagctgag ttggacactctgtgtggtag agtgtcagtt tgtcaaatac cccaagtgtg gctcatgcct atcag 與公開(kāi)的 miR-223的堿基序列一致。實(shí)施例2miR-223在小鼠MDSCs中的表達(dá)量(1)流式細(xì)胞分析使用研磨法分別從患有CT26結(jié)腸癌的小鼠的脾臟和血液中取細(xì)胞制備單細(xì)胞懸 液1)小鼠用CO2處死，立即無(wú)菌取脾；2)將脾浸入裝有冷PBS的培養(yǎng)皿中，用鈍頭剪刀剪去白色的結(jié)締組織，換入另一 個(gè)裝有冷PBS的培養(yǎng)皿中以清洗脾臟；3)再次換入一個(gè)裝有冷PBS的培養(yǎng)皿中；4)用小的彎頭手術(shù)剪剪切脾臟成3mm左右的小塊；5)用IOml塑料一次性注射器的尾部背面輕輕按壓研磨脾臟小塊，此時(shí)會(huì)看到很 多脾單細(xì)胞進(jìn)入PBS中；6)使用Falcon(BD生物公司)過(guò)濾獲得單細(xì)胞懸液，用冷PBS洗滌2次，每次 1000r/min，離心 10 分鐘；7)將細(xì)胞懸浮于RPMI 1640 (含10%熱滅活胎牛血清)中，用臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活 細(xì)胞數(shù)(在95%上)；8)調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2 X IO6細(xì)胞/ml。從BD生物公司購(gòu)買(mǎi)異硫氰酸熒光素、聚乙烯和與抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合的 CD-I lb (Ml/70)、Gr-I (RB6-8C5)、Ly6G(lA8)以及 Ly6C(AL21)抗體。細(xì)胞染色后在含有 1 %仲甲醛和1 % FCS (胎牛血清)的PBS溶液中再懸浮，得到MDSCs。在進(jìn)行流氏細(xì)胞分析 (FAScan, Becton Dickson)前將懸液在4°C條件下保存，每組分析過(guò)程都用同型的單克隆抗 體對(duì)照作為負(fù)對(duì)照。如圖2所示，通過(guò)流式細(xì)胞分析對(duì)MDSCs進(jìn)行分群，包括Pl (⑶llb+Gr-Γ細(xì)胞)及 它的兩個(gè)亞群P2 (Ly6C+ly6G+細(xì)胞)和P3 (IyeGlyeC+細(xì)胞)。(2)通過(guò)RT-PCR檢測(cè)miR-223在模型鼠MDSCs中的表達(dá)量用RT-PCR 的方法在 CDllb+Gr-Γ 細(xì)胞(Pl)，Ly6C+ly6G+細(xì)胞(P2)和 ly6Gly6C+細(xì) 胞(P3)中，從miR-223前體和成熟miR-223兩個(gè)方面共同檢測(cè)miR-223在鼠MDSCs中的表 達(dá)水平，擴(kuò)增U6(內(nèi)參基因)的小RNA(用于成熟miRNA的，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)作為每一 個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的內(nèi)源性對(duì)照。所有的反應(yīng)都平行進(jìn)行三組，因?yàn)檎郫B產(chǎn)生的變化按照制造商 的說(shuō)明(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)采用Δ ACt的方法進(jìn)行計(jì)算。RT-PCR 反應(yīng)體系A(chǔ)MV 逆轉(zhuǎn)錄酶0. 5 μ L
RNA 酶抑制劑IyL上下游弓丨物混合物2 μ LRNA 0. 5 μ gdNTP<10mM/each> 4μ L
Taq 酶(2. 5u/μ L) 0. 5 μ L10 X RT-PCR Buffer 2. 5 μ L_加雙蒸水至25 μ LRT-PCR 反應(yīng)程序45 "C30min
94。C 5 min 94 0C 30s
50 0C 30s I 25 循環(huán) 72 0C Imin 72 0C 5 rain」如圖3所示，首先測(cè)量了 miR-223在來(lái)自腫瘤鼠和無(wú)病鼠的脾臟的⑶llb+Gr-Γ 細(xì)胞的表達(dá)，RT-PCR結(jié)果顯示來(lái)自腫瘤鼠脾臟的⑶1 lb+Gr-Γ細(xì)胞內(nèi)miR-223前體和 成熟miR-223的表達(dá)水平均低于無(wú)病鼠體內(nèi)的表達(dá)水平。進(jìn)一步研究表明，不論是在 MO-MDSC (CDl lb+Ly6G-Ly6C+)細(xì)胞還是 PMN_MDSC(CDllb+Ly6C+Ly6G+)細(xì)胞中，miR-223 前 體和成熟miR-223的表達(dá)水平與無(wú)病鼠體內(nèi)的表達(dá)水平相比也都受到抑制。(3)使用基因芯片技術(shù)檢測(cè)miR-223的表達(dá)水平根據(jù)制造商的說(shuō)明用提取液(Irwitrogen公司Mtrizol裂解細(xì)胞的上清)和 RNeasy試劑盒(QIAGEN公司)從經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞分群的PI、P2、P3細(xì)胞中提取RNA。對(duì)于 miR-223,定量RT-PCR方法使用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的7900的一羥色胺的序列檢測(cè)系統(tǒng)的標(biāo) 準(zhǔn)熒光定量PCR試劑盒。擴(kuò)增U6的小RNA (用于成熟miRNA的，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)和管 家基因(U6)的mRNA(用于基因和miRNA前體的，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)作為每一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品 的內(nèi)源性對(duì)照。所有的反應(yīng)都平行進(jìn)行三組，因?yàn)檎郫B產(chǎn)生的變化按照制造商的說(shuō)明(應(yīng) 用生物系統(tǒng)公司)采用Δ ACt的方法進(jìn)行計(jì)算。RT-PCR 反應(yīng)體系A(chǔ)MV 逆轉(zhuǎn)錄酶0. 5 μ LRNA 酶抑制劑IyL上下游弓丨物混合物 2 μ LRNA 0. 5 μ gdNTP<10mM/each> 4μ LTaq 酶(2. 5u/μ L) 0. 5 μ L10 X RT-PCR Buffer 2. 5 μ L_
加雙蒸水至25 μ LRT-PCR 反應(yīng)程序45 "C 30min
<formula>formula see original document page 8</formula>
miRCURY LNA 微小RNA基因芯片和miRCURY LNA 微小RNA基因芯片由中國(guó)上海 康成生物公司提供。將基因芯片與腫瘤鼠的P2、P3細(xì)胞和無(wú)病鼠的P2、P3細(xì)胞進(jìn)行雜交 (交由上海康成生物公司處理)。如圖4所示，通過(guò)熒光發(fā)光檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)化的miRNA 表達(dá)譜的哺乳動(dòng)物miRNA的分析上執(zhí)行的是來(lái)自患有CT26腫瘤的BALB/c mice鼠的脾臟 的MO-MDSC和PMN-MDSC細(xì)胞，這些細(xì)胞也抑制了較低水平的miR-223，腫瘤鼠體內(nèi)P2、P3 細(xì)胞的數(shù)量均高于無(wú)病對(duì)照鼠體內(nèi)P2、P3細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果表明腫瘤相關(guān)MDSCs也降低了 miR-223的表達(dá)，即miR-223在MDSCs中表達(dá)量減少。實(shí)施例3轉(zhuǎn)染miR-223使miR-223表達(dá)量升高后對(duì)MDSCs的積累的影響1.移植和轉(zhuǎn)染按照生產(chǎn)協(xié)議(Amaxa，Germany)，運(yùn)用核轉(zhuǎn)染(nucleofection)的方法對(duì)CT-26 結(jié)腸癌BALB/C鼠的不同結(jié)構(gòu)的BMCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，即殺死小鼠取骨髓細(xì)胞，用1640培養(yǎng)基將 BMCs吹下來(lái)，加PBS離心；用PBS稀釋至1*107/100 μ 1個(gè)細(xì)胞，加質(zhì)粒5 μ g\100 μ 1，混勻 后放入電轉(zhuǎn)儀；將電轉(zhuǎn)儀調(diào)至Stemcell程序進(jìn)行電轉(zhuǎn)，每次加樣100 μ 1，電轉(zhuǎn)后打入老鼠 體內(nèi)即可。從Dharmacon購(gòu)買(mǎi)miRNA抑制劑和抑制劑對(duì)照，從Santa Cruz購(gòu)買(mǎi)siRNA和siRNA 的對(duì)照。對(duì)于寡核苷酸(miRNA抑制劑和抑制劑對(duì)照以及siRNA和siRNA對(duì)照)的轉(zhuǎn)染，在 IOOnM的指示寡核苷酸濃度下，運(yùn)用脂質(zhì)體(Invitrogen)用IOOnM的指示寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì) 胞。同時(shí)轉(zhuǎn)染了兩個(gè)與造血組織有關(guān)的特異性的miR142-5p和miR181-a-l的前體作為對(duì) 照組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在500μ1的PBS培養(yǎng)液中，大約有IX IO7個(gè)細(xì)胞通過(guò)尾部血管被移植到 同種CD-26腫瘤模型鼠中。三個(gè)星期后，取外周血細(xì)胞和脾細(xì)胞。2.流式細(xì)胞分析(1)直接染色1)取上述約IO6的BALB/C鼠的外周血細(xì)胞和脾細(xì)胞置于尖底離心管內(nèi)，管內(nèi)液體 要少些，加入 CD-llb(Ml/70)，Gr-1(RB6-8C5)、Ly6G(lA8)以及 Ly6C(AL21)抗體，在 4°C溫 度下靜置25分鐘；2)用冷的10%小牛血清、0. 疊氮鈉溶液，l/15mol/l PBS(pH4. 4)離心清洗細(xì) 胞 2 次，IOOOrpm 離心 5min ；3)加入500 μ 1 PBS緩沖液待測(cè)。
(2)用固定劑固定其中固定液配方是用0.37% 1.5%甲醛和PBS配成pH7. 4的固定液，固定方法是將上述經(jīng)免疫熒光染色的細(xì)胞離心沉淀，再加入固定液混勻，放在4°C溫度下保存。(3)使用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行測(cè)量分析如圖7所示，CT-26結(jié)腸癌和Lewis肺癌s. c.接種后，脾臟的⑶llb+Grl+MDSCs在 腫瘤發(fā)生后幾周內(nèi)產(chǎn)生了明顯的增多。如圖5、圖6所示，用miR-223轉(zhuǎn)染的BMCs的模型鼠 的脾臟中Grl+CDllb+細(xì)胞的比例明顯的低于移植了用mirl42-5p、mirl81a-l或者對(duì)照組 轉(zhuǎn)染的BMCs的模型鼠的脾臟中Grl+CDllb+細(xì)胞所占的比例；當(dāng)給BALB/c腫瘤鼠注射了轉(zhuǎn) 染了 miR-223抑制劑(0. 5nM左右)的BMCs后，脾臟內(nèi)Grl+⑶lib+細(xì)胞隨著腫瘤的生長(zhǎng)明 顯的增加，而只轉(zhuǎn)染了抑制劑對(duì)照組的鼠，Grl+⑶lib+細(xì)胞的比例并不發(fā)生變化。3. RT-PCR對(duì)成熟的miR223、miR142_5p和miR181-a_l，通過(guò)定量RT-PCR方法使用應(yīng)用生 物系統(tǒng)公司的7900的一羥色胺的序列檢測(cè)系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR試劑盒、擴(kuò)增U6的小 RNA (用于成熟miRNA的，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)和管家基因的mRNA (用于基因和miRNA前體 的，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)作為每一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的內(nèi)源性對(duì)照。所有的反應(yīng)都平行進(jìn)行三組， 因?yàn)檎郫B產(chǎn)生的變化按照制造商的說(shuō)明(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)采用△ ACt的方法進(jìn)行計(jì) 笪弁。RT-PCR 反應(yīng)體系A(chǔ)MV 逆轉(zhuǎn)錄酶0. 5yLRNA 酶抑制劑IyL上下游弓I物混合物 2 μ LRNA 0. 5μ gdNTP<10mM/each> 4μ LTaq 酶(2. 5u/μ L) 0. 5 μ L10 X RT-PCR Buffer 2. 5 μ L_加雙蒸水至25 μ LRT-PCR 反應(yīng)程序45 "C 30min
<formula>formula see original document page 9</formula>如圖5所示，RT-PCR結(jié)果顯示與移植了只用miR-223空白對(duì)照轉(zhuǎn)染的BMCs的鼠 脾臟的細(xì)胞內(nèi)miR-223的表達(dá)相比，移植了用miR-223、mir-142和mir-181轉(zhuǎn)染的BMCs的 鼠脾臟的細(xì)胞內(nèi)miR-223的表達(dá)水平明顯升高；如圖6所示，而在與移植了只用miR-223空白對(duì)照轉(zhuǎn)染的BMCs的鼠脾臟的細(xì)胞內(nèi)miR-223的表達(dá)相比，移植了用miR-223轉(zhuǎn)染的BMCs 的鼠脾臟的細(xì)胞內(nèi)miR-223的表達(dá)水平明顯升高的同時(shí)，用miR-223抑制劑空白對(duì)照和用 miR-223抑制劑轉(zhuǎn)染的BMCs的鼠脾臟的細(xì)胞內(nèi)miR-223的表達(dá)相比則沒(méi)有明顯變化。與從無(wú)病鼠的脾臟取出的Grl+⑶lib+細(xì)胞相比，由于腫瘤相關(guān)的 Grl+CDllb+MDSCs的作用，減少了腫瘤鼠體內(nèi)miR-223的表達(dá)。這暗示著miR-223參與了在 患有腫瘤的小鼠體內(nèi)MDSCs積累的過(guò)程。流氏細(xì)胞分析的結(jié)果暗示miR-223在腫瘤鼠骨髓細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)過(guò)程中，阻止了 BMCs分化成為MDSCs。通過(guò)使用miR-223的抑制劑使miR-223 處于低表達(dá)水平，當(dāng)給CT-26腫瘤鼠注射了轉(zhuǎn)染了 miR-223抑制劑的BMC s后，脾臟內(nèi) Grl+⑶lib+細(xì)胞隨著腫瘤的生長(zhǎng)明顯的增加，而只轉(zhuǎn)染了抑制劑對(duì)照的鼠，Grl+⑶lib+細(xì) 胞的比例并不發(fā)生變化。綜上表明miR-223的表達(dá)對(duì)MDSCs的積累起抑制作用。實(shí)施例4轉(zhuǎn)染miR-223對(duì)MO-MDSCs和PMN-MDSCs的積累的影響為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-223對(duì)MDSCs積累的影響，在進(jìn)行了 BMCs細(xì)胞移植三個(gè)星 期后，使用通過(guò)⑶lib、Ly6C及Ly6G三種表面標(biāo)記的熒光抗體，分別取外周血細(xì)胞和脾細(xì) 胞進(jìn)行熒光染色用于流式細(xì)胞分析(方法同實(shí)施例3)。其中CDllb+Ly6C+Ly6G+的細(xì)胞為 PMN-MDSCs，而CD1 lb+Ly6G_Ly6C+的細(xì)胞則為MO-MDSCs。如圖8所示，通過(guò)分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn) 與移植了只用對(duì)照轉(zhuǎn)染的BMCs的小鼠相比，在移植了用miR-223轉(zhuǎn)染了的BMCs的小鼠脾 臟中，不論是Ly6G+Ly6C+或者CDllb+Ly6C+還是CDllb+Ly6G+細(xì)胞所占的比例都降低；相 反的，與移植了只用miR-223抑制劑對(duì)照轉(zhuǎn)染的BMCs的小鼠相比，移植了用miR-223抑制 劑轉(zhuǎn)染的BMCs的小鼠脾臟中Ly6G+Ly6C+、CDllb+Ly6C+和CDllb+Ly6G+的比例都明顯的升 高。由于Gr-I細(xì)胞是Ly6G和Ly6C雙陽(yáng)性，并且?guī)缀跛械腉r-I細(xì)胞都是⑶lib陽(yáng)性，所 以 miR-223 對(duì)腫瘤鼠的 CDllb+Ly6G_Ly6C+ 的 MO-MDSCs 和 CDllb+Ly6C+Ly6G+ 的 PMN-MDSCs 的分化都具有抑制作用。實(shí)施例5轉(zhuǎn)染MEF2C后MDSCs的積聚1.轉(zhuǎn)染 MEF2C按照說(shuō)明書(shū)的步驟，通過(guò)核轉(zhuǎn)染的方法，殺死小鼠取骨髓細(xì)胞，用1640培養(yǎng)基將 BMC s吹下來(lái)，加PBS離心；用PBS稀釋至1*107/100 μ 1個(gè)細(xì)胞，加質(zhì)粒5 μ g\100 μ 1，混 勻后放入電轉(zhuǎn)儀；將電轉(zhuǎn)儀調(diào)至Stemcell程序進(jìn)行電轉(zhuǎn)，每次加樣100μ 1，電轉(zhuǎn)后打入老 鼠體內(nèi)即可。用MEF2C、MEF2C的空載對(duì)照、靶向MEF2C的siRNA以及siRNA的空載對(duì)照對(duì) CT-26患有結(jié)腸癌的鼠的BMC進(jìn)行轉(zhuǎn)染(Amaxa，Germany)。2.流氏細(xì)胞分析在進(jìn)行了 BMC s細(xì)胞移植三個(gè)星期后，使用通過(guò)⑶llb、Gr_l的表面標(biāo)記的熒光抗 體，分別取外周血細(xì)胞和脾細(xì)胞進(jìn)行熒光染色用于流式細(xì)胞分析(方法同實(shí)施例3)。如圖 9所示，結(jié)果表明與只移植了用對(duì)照轉(zhuǎn)染的BMCs的小鼠相比，移植了用MEF2C轉(zhuǎn)染的BMCs 的小鼠不論是脾臟還是外周血中⑶llb+Grl+細(xì)胞數(shù)量都增多，而且靶向MEF2C的siRNA消 除了 MEF2C對(duì)⑶llb+Grl+細(xì)胞分化的作用，而對(duì)照的siRNA空載并沒(méi)有產(chǎn)生有效的影響。3. RT-PCR對(duì)于MEF2C 基因在 Pl (CDllb+Gr-I+ 細(xì)胞)、P2 (Ly6C+ly6G+ 細(xì)胞)和 P3 (ly6G-ly6C+細(xì)胞)細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè)，定量RT-PCR方法引物使用定時(shí)定量PCR試劑(Qiagen)。所有的 反應(yīng)都平行進(jìn)行三組，因?yàn)檎郫B產(chǎn)生的變化按照制造商的說(shuō)明(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)采用 Δ ACt的方法進(jìn)行計(jì)算。如圖10 所示，MEF2C 在腫瘤鼠脾臟內(nèi)的 CDllb+Gr-1+、CDllb+Ly6C+Ly6G+ 和 ⑶1 lb+Ly6G-Ly6C+細(xì)胞內(nèi)在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)也高于無(wú)病鼠，這更進(jìn)一步的指明了 MEF2C對(duì) 腫瘤鼠體內(nèi)MDSCs積累的促進(jìn)作用，從而證明了作為miR-223的靶分子，MEF2C參與腫瘤鼠 體內(nèi)MDSCs的擴(kuò)增、分化過(guò)程，并起著重要的促進(jìn)作用。RT-PCR 反應(yīng)體系A(chǔ)MV 逆轉(zhuǎn)錄酶0. 5 μ LRNA 酶抑制劑IyL上下游弓丨物混合物 2 μ LRNA 0. 5μ gdNTP<10mM/each> 4μ LTaq 酶(2. 5u/μ L) 0. 5 μ LIOXRT-PCR Buffer 2. 5 μ L_加雙蒸水至25 μ LRT-PCR 反應(yīng)程序45 "C30min<formula>formula see original document page 11</formula>實(shí)施例6miR-223以MEF2C作為靶分子對(duì)MDSCs的分化進(jìn)行調(diào)控應(yīng)用TargetScan結(jié)合PicTar和miRanda軟件進(jìn)行分析，如圖11所示，發(fā)現(xiàn)在 鼠的miR-223的175個(gè)保守位點(diǎn)和35個(gè)不完全保守位點(diǎn)中至少含有172個(gè)保守的靶位 點(diǎn)。在MEF2C的3，UTR中包含兩個(gè)靶區(qū)，一個(gè)保守區(qū)(1264-1270)和一個(gè)不完全保守區(qū) (1674-1680)。軟件預(yù)測(cè)miR-223的3，UTR能與MEF2C結(jié)合并抑制其表達(dá)。1. Western 印跡分析在室溫下封閉液中與第一抗體反應(yīng)一個(gè)小時(shí)，通過(guò)用過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗(試 劑盒)和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑(Amersham公司)對(duì)這種蛋白質(zhì)抗體復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)，具體實(shí)現(xiàn) 為(1)轉(zhuǎn)染按照說(shuō)明書(shū)的步驟，通過(guò)核轉(zhuǎn)染的方法，用MEF2C、MEF2C的空白對(duì)照、miR-223和 miR-223的空白對(duì)照分別轉(zhuǎn)染RAW264. 7細(xì)胞，共轉(zhuǎn)48小時(shí)后進(jìn)行Western Blot (兔子抗MEF2C的多克隆抗體是從Abnova Corporation購(gòu)買(mǎi)的)。(2)蛋白樣品的制備1)倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液；2)每瓶細(xì)胞加3ml4°C預(yù)冷的PBS，平放輕輕搖動(dòng)1分鐘洗滌細(xì)胞 ，然后棄去洗液； 重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液，然后把培養(yǎng)瓶置于冰上；3)按Iml裂解液加10 μ LPMSF (苯甲基磺酰氟)(IOOmM)，搖勻置于冰上；4)每瓶細(xì)胞加400 μ L含PMSF的裂解液，于冰上裂解30分鐘，為使細(xì)胞裂解充分 培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)；5)裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)，然后用加樣器將細(xì)胞碎片 和裂解液移至1. 5ml離心管中；6) 4"C 12000rpm 離心 5 分鐘；7)將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到0. 5ml的離心管中放平_20°C保存。(3)電泳1) SDS-PAGE 凝膠配制SDS-PAGE凝膠使用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒進(jìn)行配置。2)樣品處理在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，于沸水浴中加 熱4分鐘，以充分變性蛋白。3)上樣與電泳冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE凝膠加樣孔內(nèi)即可。為了便于觀 察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，200V電壓 電泳60min。(4)轉(zhuǎn)膜1)取一塊PAGE膠，浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中，同時(shí)把兩張同樣大小的濾紙和兩張海綿 也浸泡于緩沖液中；2)剪一塊同樣大小的PVDF膜，做如下處理首先浸于100%甲醇溶液10秒，然后 浸于去離子水3分鐘，最后浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中3分鐘；3)電轉(zhuǎn)三明治順序如下正極(白色) 海綿濾紙PVDF 膜PAGE 膜濾紙海綿負(fù)極(黑色)。(5)將三明治夾子放入預(yù)裝有電轉(zhuǎn)緩沖液的電泳槽中，加蓋，接通電源恒壓100V， 30分鐘；(6)將完成后的PVDF膜用去離子水沖洗，放入5%脫脂奶粉中，室溫30分鐘，用 TBST (電泳緩沖液)洗膜三次，每次5分鐘；(7)加入一抗，室溫一小時(shí)，用TBST洗膜3次，每次5分鐘；
(8)加入酶標(biāo)二抗，室溫一小時(shí)，用TBST洗膜3次，每次5分鐘；(9) ECL顯色A液和B液按1 1混合加到膜上，暗室壓片7分鐘，顯影液1分鐘， 定影液1分鐘。如圖12所示，與軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果一致，miR-223抑制MEF2C在mRNA水平和蛋白水 平的表達(dá)。 2. Luciferase (熒光素酶報(bào)告基因分析)對(duì)于轉(zhuǎn)染的腎(人胚腎)293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天用250毫升細(xì)胞密度為4Χ IO4的 培養(yǎng)基將細(xì)胞在48孔板進(jìn)行鋪板，根據(jù)制造商的建議，使用核轉(zhuǎn)染技術(shù)(Amaxa生物系統(tǒng)； PIS2柏林，德國(guó))將細(xì)胞與顯示表達(dá)式質(zhì)粒、海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒(試劑盒) 用脂質(zhì)體2000 (Invitrogen公司)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，通過(guò)轉(zhuǎn)染后24小時(shí)使用雙熒光素酶試劑盒 測(cè)定海腎和螢火蟲(chóng)熒光素酶的活動(dòng)，海腎熒光素酶的活性根據(jù)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性進(jìn)行標(biāo) 準(zhǔn)化，具體實(shí)現(xiàn)為1)轉(zhuǎn)染按照說(shuō)明書(shū)的步驟，通過(guò)核轉(zhuǎn)染(nucleofection)的方法，殺死小鼠取骨 髓細(xì)胞，用1640培養(yǎng)基將BMCs吹下來(lái)，加PBS離心；用PBS稀釋至1*107/100 μ 1個(gè)細(xì)胞， 加質(zhì)粒5 μ g\100 μ 1，混勻后放入電轉(zhuǎn)儀；將電轉(zhuǎn)儀調(diào)至Stemcell程序進(jìn)行電轉(zhuǎn)，每次加樣 100 μ 1，電轉(zhuǎn)后打入老鼠體內(nèi)即可。用MEF2C的3，UTR轉(zhuǎn)染腎(人胚腎)293Τ細(xì)胞、MEF2C 的3，UTR和miR-223空白對(duì)照共同轉(zhuǎn)染腎(人胚腎)293T細(xì)胞、miR-223和MEF2C的3，UTR 共同轉(zhuǎn)染腎(人胚腎)293T細(xì)胞、miR-223和MEF2C的3，UTR突變體1共同轉(zhuǎn)染腎(人胚 腎)293T細(xì)胞以及miR-223和MEF2C的3，UTR突變體2共同轉(zhuǎn)染腎(人胚腎)293T細(xì)胞； 另外構(gòu)建一組由miR-223抑制劑對(duì)照和0. InMUOnM和IOOnM miR-223抑制劑轉(zhuǎn)染的293T 細(xì)胞；2)制備被動(dòng)裂解緩沖液IXPLB 將1倍體積的5XPassive Lysis ；Buffer (PLB) 加到4倍體積的蒸餾水中，混合均勻，在4°C儲(chǔ)存1個(gè)月；3)制備 LAR II 用 Luciferase Assay Buffer II (目錄號(hào) E1980105ml)溶解凍干 粉 Luciferase Assay Substrate, _20°C存儲(chǔ) 1 個(gè)月；4)制備 Stop & Glo 試劑加 0. 2ml 的 50 X Stop & Glo 酶到 IOml 的 Stop & Glo 緩沖液中，制成IXStop & Glo 試劑；5)根據(jù)說(shuō)明書(shū)的建議使用核轉(zhuǎn)染技術(shù)(Amaxa生物系統(tǒng)；pIS2柏林，德國(guó)) 將細(xì)胞與顯示表達(dá)式質(zhì)粒、海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒(Promega)用脂質(zhì)體 2000 (Invitrogen公司)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，將用MEF2C的3，UTR轉(zhuǎn)染的腎(人胚腎)293T細(xì)胞、 用MEF2C的3，UTR和miR-223空白對(duì)照共轉(zhuǎn)的腎(人胚腎)293T細(xì)胞、用miR-223和MEF2C 的3，UTR共轉(zhuǎn)的腎(人胚腎)293T細(xì)胞、miR-223和MEF2C的3，UTR突變體1共轉(zhuǎn)以及 miR-223和MEF2C的3，UTR突變體2共轉(zhuǎn)的腎(人胚腎)293T細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前一天用250 毫升細(xì)胞密度為4X104的培養(yǎng)基將細(xì)胞在48孔板進(jìn)行鋪板。如圖13所示，轉(zhuǎn)染后24小 時(shí)使用雙熒光素酶試劑盒(Promega)測(cè)定海腎和螢火蟲(chóng)熒光素酶的活動(dòng)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 統(tǒng)計(jì)分析時(shí)采用了檢定的方法，95%的置信限度被認(rèn)為是有意義的，定義為P < 0. 05。如圖12所示，對(duì)MEF2C的3’UTR進(jìn)行熒光素酶報(bào)告檢測(cè)進(jìn)一步確認(rèn)了 miR-223調(diào) 控MEF2C基因表達(dá)的特異調(diào)節(jié)。如圖13所示，MEF2C的3，UTR種子序列的突變體解除了 miR-223的抑制活性，暗示著這個(gè)負(fù)調(diào)控過(guò)程特異性的作用于先前預(yù)測(cè)的miR-223的靶位點(diǎn)；而且miR-223的抑制 劑也能明顯的阻塞miR-223對(duì)熒光素酶活性的負(fù)調(diào)控。6)細(xì)胞裂解(1)除去培養(yǎng)細(xì)胞中的培養(yǎng)基；(2)用1 XPBS清洗培養(yǎng)細(xì)胞，去掉清洗液；(3)按48孔65ul將IXPLB加入到培養(yǎng)孔中。7)被動(dòng)裂解在室溫輕緩晃動(dòng)培養(yǎng)板15分鐘，把裂解液轉(zhuǎn)移到檢測(cè)試管中。8)轉(zhuǎn)染后24小時(shí)測(cè)定海腎和螢火蟲(chóng)熒光素酶的活動(dòng)設(shè)置自動(dòng)進(jìn)樣器1和2分別分裝100ul的LARII和Stop&Glo 試劑；測(cè)量時(shí)，使用1_2秒延遲和5_10秒讀數(shù)。在螢光 發(fā)光儀上(Luminometer)(1)加入 20ul PLB 裂解液(2)加入 lOOulLARII(3)檢測(cè)螢火蟲(chóng)螢光素酶(4)加入 100ulStop&Glo 試劑(5)檢測(cè)海腎螢光素酶的活性(6)其它孔如此循環(huán)操作。對(duì)MEF2C的3，UTR進(jìn)行熒光素酶報(bào)告檢測(cè)也進(jìn)一步確認(rèn)了 miR-223調(diào)控MEF2C基 因表達(dá)特異的調(diào)節(jié)。如圖13所示，MEF2C的3’ UTR種子序列的突變體解除了 miR-223的 抑制活性，暗示著這個(gè)負(fù)調(diào)控過(guò)程是特異性的作用于先前預(yù)測(cè)的mi R-223的靶位點(diǎn)；而且 miR-223的抑制劑也能明顯的阻塞miR-223對(duì)熒光素酶活性的負(fù)調(diào)控，隨著miR-223抑制劑 濃度的增大對(duì)熒光酶活性的負(fù)調(diào)控作用就越小。實(shí)施例7血液分析為了進(jìn)一步了解miR-223對(duì)MDSCs分化的影響，進(jìn)行血液分析。如實(shí)施例3所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染和移植，三個(gè)星期后，取外周血細(xì)胞。首先使用 CDllb (M1/70)和Grl (RB6-8C5)抗體對(duì)BMCs進(jìn)行流氏細(xì)胞分析(方法如實(shí)施例2)，結(jié)果如 圖14所示(圖14右側(cè)第二幅圖上箭頭為紅色箭頭，第四幅圖上箭頭為藍(lán)色箭頭)，與只移 植了用對(duì)照轉(zhuǎn)染的BMCs的鼠相比，移植了被miR-223轉(zhuǎn)染的BMCs的鼠的外周血中的Grl 和CDllb處于高表達(dá)水平的細(xì)胞比例降低；相反的，與只移植了用抑制劑對(duì)照轉(zhuǎn)染的BMCs 的鼠相比，移植了被miR-223抑制劑轉(zhuǎn)染的BMCs的鼠外周血中Grl和⑶lib處于高表達(dá)水 平的細(xì)胞比例升高，這顯示了移植了被miR-223轉(zhuǎn)染的BMCs的鼠的外周血中，低水平的Grl 和⑶lib表達(dá)細(xì)胞的異常的積累，提示著miR-223的確影響B(tài)MCs分化成為MDSCs。然后制 備血涂片，在顯微鏡下(400倍)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，與移植了只轉(zhuǎn)染對(duì)照的BMCs相比， 移植了用miR-223轉(zhuǎn)染的BMCs的鼠的外周血中有更多粒細(xì)胞(紅色箭頭)；同樣的，對(duì)于 粒細(xì)胞前體細(xì)胞，這些粒細(xì)胞顯示不規(guī)則的細(xì)胞核分裂和核染色質(zhì)的凝聚不足。而在移植 了轉(zhuǎn)染了 miR-223抑制劑的BMCs的鼠外周血中，粒細(xì)胞樣的細(xì)胞增多(藍(lán)色箭頭)，這些細(xì) 胞有一個(gè)不尋常的熟核成熟，分葉增多的形態(tài)特征。總體來(lái)說(shuō)，結(jié)果都表明miR-223對(duì)腫瘤 鼠體內(nèi)MDSCs數(shù)量的增加和分化有著重要的抑制作用。
實(shí)施例8體外腫瘤相關(guān)的miR-223調(diào)節(jié)⑶llb+Gr_l+細(xì)胞的分化研究將小鼠BMCs暴露在PGE2 (前列腺素2)或與CT_26、1D8腫瘤細(xì)胞上清液或者只與 空白對(duì)照共同培養(yǎng)后，使用⑶llb(Ml/70)和Grl (RB6-8C5)抗體對(duì)BMCs進(jìn)行流氏細(xì)胞分 析(方法如實(shí)施例2)，可以發(fā)現(xiàn)如圖15所示與對(duì)照組相比，與CT-26、1D8腫瘤細(xì)胞上清或 者與PGE2共同培養(yǎng)時(shí)，BMCs可以分化成⑶llb+Gr-l+細(xì)胞的比例明顯上升；而在共同培養(yǎng) 0,6,24. 48. 72小時(shí)后，取上述四種處理的BMCs細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)，如圖16所 示，雖然在暴露于腫瘤相關(guān)因子之后，miR-223的前體和成熟mir-23的表達(dá)水平有短暫的 上調(diào)，但是隨著B(niǎo)MCs分化為⑶llb+Grl+細(xì)胞，在腫瘤相關(guān)的MDSCs中，miR-223的前體和 成熟miR-223的表達(dá)水平都下調(diào)，這暗示著miR-223的表達(dá)可能受到能被腫瘤相關(guān)因子感 應(yīng)的功能分子的調(diào)控；相反的，作為miR-223的靶分子，MEF2C的表達(dá)水平在短暫的下調(diào)之 后上調(diào)。

RT-PCR反應(yīng)體系
AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0. 5 ii L
RNA酶抑制劑1 P L 上下游引物混合物2yL
RNA 0. 5u g
dNTP<10mM/each> 4u L
Taq 酶(2. 5u/ u L) 0. 5 u L
10XRT-PCR Buffer 2. 5u L
加雙蒸水至 RT-PCR反應(yīng)程序 45 °C 30min
<formula>formula see original document page 15</formula>為了進(jìn)一步確定miR-223及其靶分子MEF2C在調(diào)節(jié)BMCs分化成為⑶llb+Grl+細(xì) 胞中的作用，在轉(zhuǎn)染后2天和4天后使用CDllb(Ml/70)和Grl(RB6-8C5)抗體對(duì)miR-223 和MEF2C轉(zhuǎn)染的BMCs進(jìn)行分析。如圖17所示，與培養(yǎng)的只用對(duì)照組分轉(zhuǎn)染的BMCs相比， 培養(yǎng)的用miR-223轉(zhuǎn)染的BMCs細(xì)胞中CDllb+Grl+細(xì)胞的比例要低；相反的，在培養(yǎng)的轉(zhuǎn) 染了 MEF2C的BMCs細(xì)胞中⑶llb+Grl+細(xì)胞的比例明顯上調(diào)，這就證明了 MEF2C在誘導(dǎo) ⑶llb+Grl+細(xì)胞分化中的促進(jìn)作用。實(shí)施例9miR-223與腫瘤生長(zhǎng)速度的關(guān)系在7、11、15、19、23、27天殺死小鼠，取出移植了用]\^卩2(、]\^卩2(空白對(duì)照、11111 -223和miR-223的空白對(duì)照轉(zhuǎn)染的BMCs的腫瘤小鼠體內(nèi)CT26腫瘤，測(cè)量其大小、重量、體積。如 圖18所示，與只移植了用對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BMCs的小鼠相比，移植了用miR-223轉(zhuǎn)染的BMCs 的小鼠腫瘤的生長(zhǎng)速度減慢；相反的，與只移植用對(duì)照載體的小鼠相比，移植了 MEF2C的小 鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)速度加快。因此，miR-223不只抑制了⑶llb+Gr-Ι+細(xì)胞的積累，而且也 抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。綜上所述，髓系來(lái)源抑制細(xì)胞(MDSCs)可造成腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，同時(shí)MDSCs可抑制淋巴細(xì)胞的增殖并促使其凋亡；另外MDSCs能通過(guò)影響一氧化氮合酶、精氨酸酶的活 性來(lái)影響腫瘤的生長(zhǎng)。因此降低這群細(xì)胞或促使其分化，將是很有前景的腫瘤免疫輔助治 療方法。本發(fā)明中通過(guò)上述實(shí)施例的研究表明，MDSCs在抑制T細(xì)胞應(yīng)答和在癌癥時(shí)誘導(dǎo)T 細(xì)胞耐受中起著重要的作用，而miR-223可以有效抑制MDSCs的積累，并且通過(guò)抑制MDSCs 積聚從而減緩腫瘤生長(zhǎng)速度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了 miR-223對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展的抑制作用。上述參照具體實(shí)施方式
對(duì)該miR-223的新用途進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說(shuō)明性的而不 是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個(gè)實(shí)施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的 變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
miR-223具有抑制髓系來(lái)源抑制細(xì)胞積聚的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述miR-223具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述腫瘤為腎細(xì)胞癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺 癌或卵巢癌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述腫瘤為結(jié)腸癌、肺癌或卵巢癌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述腫瘤為結(jié)腸癌。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5之一所述的用途，其特征在于所述miR-223在制備用于抑制腫 瘤生長(zhǎng)的藥物中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于所述miR-223在制備用于抑制結(jié)腸癌、肺 癌或卵巢癌生長(zhǎng)的藥物中的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述miR-223在制備用于抑制結(jié)腸癌生 長(zhǎng)的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)分析對(duì)miR-223的功能進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)miR-223具有抑制MDSCs的功能，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)miR-223具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的用途，可以將miR-223設(shè)計(jì)為靶向藥物來(lái)治療腫瘤，對(duì)腫瘤臨床免疫治療有著潛在的巨大應(yīng)用價(jià)值，并且為進(jìn)一步研究miR-223的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101804207SQ20091024480
公開(kāi)日2010年8月18日 申請(qǐng)日期2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月15日
發(fā)明者劉喬飛, 張園, 張苗苗, 楊榮存, 王萌萌, 陳穎瑩 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)