專利名稱：：香青蘭總?cè)铺崛∥锛捌渲苽浞椒ê陀猛镜闹谱鞣椒?br>技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種香青蘭總?cè)铺崛∥锛捌渲苽浞椒ê蛻?yīng)用，屬于天然藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：香青蘭分布于華北、東北、西北等省區(qū)，新疆以南疆和東疆栽培較多。獨(dú)聯(lián)體國家及俄羅斯，印度，歐洲等亦有分布。栽培植物生于山地林邊或草坡上。我國資源十分豐富。香青蘭藥用全草為干燥地上部分。夏季盛花期采割，除去雜質(zhì)，曬干?；ǘ辔s，藍(lán)紫色。氣清香，葉微辛。由新疆維吾爾醫(yī)院和維吾爾藥業(yè)有限公司提供的資料得知，香青蘭，維吾爾名為巴迪然吉布亞，處方被收載于維吾爾古典醫(yī)籍《阿里卡農(nóng)》至今已有800多年的歷史，《買克散艾地維》至今已有500多年的歷史，《易斯?fàn)柊⒃尽泛汀顿I克散易克買提》至今已有100多年的歷史。它在維吾爾醫(yī)和民間用于治療冠心病及血液質(zhì)旺盛(高血壓)、寒性神經(jīng)性頭疼、寒性感冒、氣管炎等疾病，幾百余年的實(shí)踐證明。療效確切、顯著。香青蘭提取物對多種自由基具有清除作用，對于異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠急性心肌缺血具有保護(hù)作用，單方制齊U"益心巴迪然吉布亞顆粒"治療冠心病具有良好的療效，臨床研究表明，益心巴迪然吉布亞顆粒治療管性病心絞痛的總有效率達(dá)到85.5%，與復(fù)方丹參片療效相當(dāng)?，F(xiàn)有技術(shù)中，對香青蘭的藥理研究大多是集中在其對心血管系統(tǒng)的治療作用上，其成分的提取制備也都在對其具有治療心血管作用的總黃酮類上。如在部頒標(biāo)準(zhǔn)維藥分冊收載的成方中，組方含香青蘭的制劑有6中，均用于心悸、心痛方面疾病的治療；中國專利CN101537039A公開了一種香青蘭總黃酮提取物及其制備方法和應(yīng)用，制備的有效部位中主要為黃酮類化合物；中國專利CN101219161A公開了一種香蘭提取物和香蘭滴丸生產(chǎn)方法，其提取物中也主要是黃酮類成分。而部頒標(biāo)準(zhǔn)維藥分冊中，記載的功能主治不僅包括心血管方面的治療作用，其還具有保肝健脾的作用，而對香青蘭在治療肝病有效部位及其制備工藝的研究，還未有相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種具有保肝作用的香青蘭有效部位。研究人員發(fā)現(xiàn)，在將香青蘭的乙醇提取物，經(jīng)石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取后，對其各部分進(jìn)行體外抗乙肝病毒藥效觀察，發(fā)現(xiàn)其氯仿部位對乙肝病毒具有較強(qiáng)的抑制作用，有效成分為熊果酸、齊墩果酸等三萜類成分。本發(fā)明香青蘭有效部位提取物中，總?cè)祁惓煞植坏陀?0%，齊墩果酸和熊果酸的含量占總?cè)i的重量百分含量不低于80%。本發(fā)明的再一目的在于提供一種制備具有保肝作用的香青蘭有效部位的方法。本發(fā)明制備方法包括如下步驟(1)將香青蘭乙醇提取液濃縮，回收乙醇后得浸膏，浸膏加水煮沸洗滌，過濾；[OO11](2)浸膏以堿水液溶解，過濾，取濾液；(3)濾液加濃鹽酸，攪拌均勻，過濾，得不溶物；(4)不容物以蒸餾水洗脫至水洗液呈中性；(5)不溶物以乙醇溶解，脫色劑脫色；(6)脫色后的乙醇液上聚酰胺吸附樹脂住，以不高于30%的乙醇沖洗色譜柱，收集30%乙醇洗脫部分，濃縮，干燥，即得。其中，提取香青蘭所用的乙醇為80%_95%的乙醇，回流提取2-4次；香青蘭乙醇提取濃縮后的浸膏以熱水洗滌次數(shù)為2-4次。本發(fā)明中，溶解浸膏所用的堿水為O.1%_5%的氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀或碳酸氫鉀中的任意一種，優(yōu)選為0.5%的氫氧化鈉。在堿水液中，加入濃鹽酸，調(diào)節(jié)后藥液的pH為1-3。本發(fā)明中，步驟(5)中所用的乙醇為80%_95%的乙醇，以回流的方式溶解；脫色劑脫色時，所用的脫色劑為活性炭，活性炭的加入量為10-15g/L藥液，脫色后趁熱過濾，濾液再經(jīng)加壓濃縮至小體積后(相對密度為1.101.20)，將濃縮液上已處理好的聚酰胺吸附樹脂柱(聚酰胺的粒度選30-60目或60-90目范圍)，柱床已不高于30%的乙醇洗脫6_10個柱床體積，收集此部分洗脫液，濃縮干燥即得。具體地，本發(fā)明香青蘭總?cè)频闹苽浞椒ò?1)香青蘭粉碎成粗粉，以80%-95%的乙醇回流提取2_4次，過濾，合并乙醇提取液，濾液減壓濃縮至浸膏，浸膏中加蒸餾水，煮沸洗滌2-4次，過濾，棄水洗液，得不溶物；(2)不溶物加0.5%的氫氧化鈉水溶液，加熱溶解，室溫冷卻，過濾，取濾液，濾渣以0.5%的氫氧化鈉溶液洗滌，將洗滌液合并至濾液中，備用；(3)堿水液加濃鹽酸調(diào)pH至藥液pH為1-3，靜置，過濾，濾渣以蒸餾水洗滌至水洗液呈中性，取濾渣，備用；(4)濾渣加80%-95%的乙醇回流溶解，溶解后加入活性炭，繼續(xù)回流30min，活性炭的加入量為10-15g/L藥液，趁熱過濾，濾液減壓濃縮至藥液相對密度為1.10-1.20，備用；(5)濃縮液上聚酰胺吸附樹脂住，以不高于30%的乙醇洗脫6-10個柱體積，收集此部分洗脫液，合并，減壓濃縮，干燥，得總?cè)铺崛∥?。本發(fā)明所得香青蘭提取物可以單獨(dú)制成所需的制劑，用于肝病的治療，也可以加入其它制藥上可接受的賦形劑制備成所需的制劑，也可以和其它藥物組合使用用于制備肝病的藥物。依據(jù)本發(fā)明方法所得的總?cè)铺崛∥?，其中提取物中總?cè)频暮坎坏陀?0%，且熊果酸和齊墩果酸二者總量占總?cè)频牧坎坏陀?0%。具體實(shí)施例以下從制備本發(fā)明實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明提取物的制備方法，所列舉的實(shí)施例并不是為了限制本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)說明書公開的內(nèi)容中明顯想到的別的實(shí)施方式也屬于本發(fā)明。實(shí)施例1取香青蘭干燥藥材1000g，粉碎成粗粉，加入8倍量85%的乙醇回流提取3次，過濾，合并濾液，濾液減壓濃縮成浸膏狀，所得浸膏用熱水洗滌3次，過濾，棄水洗液，所得不溶物加10倍重量的0.5%的氫氧化鈉水溶液，充分?jǐn)嚢?，溶解，靜置，過濾，取濾液，濾渣再以0.5%的氫氧化鈉水溶液洗滌，堿水洗液并入到上濾液中，濾液加濃鹽酸調(diào)pH值至1.0，充分?jǐn)嚢?，靜置，過濾，得不溶物以蒸餾水洗至水洗夜呈中性，棄水洗液，所得不溶物以6倍重量的90%乙醇回流溶解，并加入活性炭(10g/L藥液)，繼續(xù)回流30min，趁熱過濾，濾液減壓濃縮至相對密度為1.IO，將濃縮液上已處理好的30-60目聚酰胺吸附樹脂，以30%的乙醇洗脫聚酰胺樹脂柱，洗脫劑用量約為柱床體積的8倍，收集30%的乙醇洗脫部分，減壓濃縮，真空干燥，得香青蘭總?cè)铺崛∥?9.2g，其中總?cè)坪繛?2.4%，熊果酸和齊墩果酸二者之重量之和為40.7%。實(shí)施例2取香青蘭干燥藥材1000g，粉碎成粗粉，加入10倍量95%的乙醇回流提取3次，過濾，合并濾液，濾液減壓濃縮成浸膏狀，所得浸膏用熱水洗滌3次，過濾，棄水洗液，所得不溶物加8倍重量的5%的碳酸氫鈉水溶液，充分?jǐn)嚢瑁芙?，靜置，過濾，取濾液，濾渣再以5%的碳酸氫鈉水溶液洗滌，堿水洗液并入到上濾液中，濾液加濃鹽酸調(diào)pH值至2.0，充分?jǐn)嚢?，靜置，過濾，得不溶物以蒸餾水洗至水洗夜呈中性，棄水洗液，所得不溶物以5倍重量的90%乙醇回流溶解，并加入活性炭(15g/L藥液)，繼續(xù)回流30min，趁熱過濾，濾液減壓濃縮至相對密度為1.15，將濃縮液上已處理好的60-90目聚酰胺吸附樹脂，以25%的乙醇洗脫聚酰胺樹脂柱，洗脫劑用量約為柱床體積的8倍，收集25%的乙醇洗脫部分，減壓濃縮，真空干燥，得香青蘭總?cè)铺崛∥?8.6g，其中總?cè)坪繛?5.8%，熊果酸和齊墩果酸二者之重量之和為54.5%。2、總?cè)祁惢衔锖繙y定依據(jù)三萜類化合物在高氯酸作用下能與香草醛產(chǎn)生顏色反應(yīng)，在546nm處有最大吸收，采用分光光度法測定。烏蘇酸標(biāo)準(zhǔn)品精確配置濃度為lmg/ml的烏蘇酸樣品，取0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml置5ml容量瓶中，IO(TC烘干，冷卻后，每瓶加入0.5ml5X的香草醛，0.8ml高氯酸，搖勻置6(TC水浴保溫10min，取出后，用乙酸定容至5ml，搖勻后，546nm測定吸收值，以濃度對光吸收值做標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品配置取香青蘭提取物，同法配置成lmg/ml樣品夜，取0.1、0.2、0.3ml分別置5ml容量瓶中IO(TC烘干，冷卻后，每瓶加入O.5ml5X的香草醛，0.8ml高氯酸，搖勻置6(TC水浴保溫10min，取出后，用乙酸定容至5ml，搖勻后，546nm測定吸收值，對比標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品總?cè)i的含量。3、熊果酸、齊墩果酸含量測定對照品溶液的配置精密稱取熊果酸、齊墩果酸對照品各9.6mg，至10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成lml含0.96mg的對照品溶液，分別吸取對照品溶液25、100、200、400和600yl至5ml容量瓶中，用甲醇頂容至刻度。樣品溶液的配置精密稱取香青蘭提取物100mg，置100ml容量瓶中，先加入甲醇適量，超聲5min，然后加入甲醇至刻度，搖勻，精密量取續(xù)濾液10ml，至100ml容量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，即得。5為87:例1的基半乳提取物平。測定用RP-HPLC法測定，色譜條件檢測波長210nm，流動相甲醇-水(體積比:13);流速1.Oml/min;柱溫35t:，測定樣品中熊果酸和齊墩果酸的含量。藥理實(shí)施例以下從藥理藥效學(xué)方面來說明本發(fā)明提取物的有益效果，所用提取物均為由實(shí)施方法制備得到。一、對化學(xué)性肝損傷小鼠的治療作用小鼠60只隨機(jī)分為6組，每組10只，即正常對照組，模型組，聯(lián)苯雙酯組，丹參胡、中、低劑量給藥組。連續(xù)7天口服給藥，末次給藥后1小時腹腔注射800mg/kg的氨糖，隔16小時后眼眶取血測定血液升化指標(biāo)ALT，MDA。結(jié)果(表1)顯示本發(fā)明能夠明顯降低氨基半乳糖小鼠的ALT的含量，高劑量組能顯著降低模型組的MDA水表1本發(fā)明提取物對氨基半乳糖小鼠肝損傷模型的影響G±s)組別(mg/kg)ALT(U/L)MDA(nmol/mg肝組織)空白對照模型組聯(lián)苯雙酯組低劑量組中劑量組高劑量組200255010034.26±8.26"561.5±263.1264.5土26.4"389.1±123.5*326.5±81.5**254.2±72.9**0.26±0.05**0.48±0.110.38±0.09*0.43±0.080.41±0.120.36±0.02**與模型組比較*p<0.05，與模型組比較**p<0.01二、對豬血清免疫肝纖維化大鼠的治療作用Wistar大鼠隨機(jī)分成7組空白組、肝纖維化模型組、秋水仙堿組、Y干擾素組、本發(fā)明提取物高、中、低劑量給藥組。除正常組外其余各組實(shí)驗第一天起腹腔內(nèi)注射豬血清造肝纖維化模型，每次O.5ml/只，每周2次，模型組及正常對照組不給藥，其余各組給予相應(yīng)劑量藥物，喂飼加間歇給藥，飼以普通飼料和自來水。第12周頸動脈放血處死動物，取肝臟標(biāo)本，提取總RNA，RT-PCR檢測肝組織中TGF-P1和Smad3mRNA的表達(dá)，并用免疫組化方法觀察TGF-P1和Smad3蛋白的表達(dá)。檢測膠原酶活性，肝組織膠原蛋白含量。實(shí)驗結(jié)果(表2)顯示受試藥與秋水仙堿、Y干擾素均能顯著增加小鼠肝臟膠原酶活性，從而降低肝膠原蛋白的含量，減少膠原沉積。其中高劑量組效果優(yōu)于中劑量組和低劑量組。表2藥物對豬血清免疫肝纖維化大鼠膠原酶活性和肝膠原蛋白的影響6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*與模型組比較p<0.05，**與模型組比較p<0.01三、對豬血清免疫肝纖維化大鼠膠原酶活性的影響結(jié)果(表3)顯示藥物C、D、E能顯著增加小鼠肝臟膠原酶活性，而肝臟膠原活性的升高有助于降低肝膠原蛋白的含量，減少膠原沉積。肝膠原蛋白的含量與理論相似，模型組肝內(nèi)膠原大量沉積，各用藥組和秋水仙堿組較之均有不同程度減少，其中提取物高劑量組效果更為明顯。表3對豬血清免疫肝纖維化大鼠膠原酶活性和肝膠原蛋白的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*與模型組比較p<0.05，w與模型組比較p<0.0權(quán)利要求香青蘭總?cè)苹衔锾崛》椒?，其特征在?1)將香青蘭乙醇提取液濃縮，回收乙醇后得浸膏，浸膏加水煮沸洗滌，過濾；(2)浸膏以堿水液溶解，過濾，取濾液；(3)濾液加濃鹽酸，攪拌均勻，過濾，得不溶物；(4)不容物以蒸餾水洗脫至水洗液呈中性；(5)不溶物以乙醇溶解，脫色劑脫色；(6)脫色后的乙醇液上聚酰胺吸附樹脂住，以不高于30％的乙醇沖洗色譜柱，收集30％乙醇洗脫部分，濃縮，干燥，即得，所得提取物中總?cè)频闹亓堪俜趾坎坏陀?0％，齊墩果酸和熊果酸的含量占總?cè)频闹亓堪俜趾坎坏陀?0％。。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的總?cè)苹衔锏奶崛》椒?，其特征在于提取香青蘭所用的乙醇為80%_95%的乙醇，回流提取2-4次。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的總?cè)苹衔锏奶崛》椒?，其特征在于，香青蘭乙醇提取浸膏以熱水洗滌次數(shù)為2-4次。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的總?cè)苹衔锏奶崛》椒?，其特征在于，溶解浸膏的堿水為0.1%-5%的氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀或碳酸氫鉀中的任意一種。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的總?cè)苹衔锏奶崛》椒ǎ涮卣髟谟诩訚恹}酸后藥液的pH值調(diào)至1-3。6.根據(jù)權(quán)利要求所述的總?cè)苹衔锏奶崛》椒ǎ涮卣髟谟诓襟E(5)中所用的乙醇為80%_95%的乙醇，以回流的方式溶解；脫色劑脫色時，所用的脫色劑為活性炭，活性炭的加入量為10-15g/L藥液，脫色后趁熱過濾。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的總?cè)苹衔锏奶崛》椒?，其特征在于在進(jìn)行步驟6)之前，脫色后的乙醇藥液經(jīng)濃縮至少體積后再上聚酰胺吸附樹脂柱。8.根據(jù)權(quán)利1所述的總?cè)苹衔锏奶崛》椒ǎ涮卣髟谟?，具體包括如下步驟(1)香青蘭粉碎成粗粉，以80%_95%的乙醇回流提取2-4次，過濾，合并乙醇提取液，濾液減壓濃縮至浸膏，浸膏中加蒸餾水，煮沸洗滌2-4次，過濾，棄水洗液，得不溶物；(2)不溶物加0.5%的氫氧化鈉水溶液，加熱溶解，室溫冷卻，過濾，取濾液，濾渣以0.5%的氫氧化鈉溶液洗滌，將洗滌液合并至濾液中，備用；(3)堿水液加濃鹽酸調(diào)pH至藥液pH為l-3，靜置，過濾，濾渣以蒸餾水洗滌至水洗液呈中性，取濾渣，備用；(4)濾渣加80%-95%的乙醇回流溶解，溶解后加入活性炭，繼續(xù)回流30min，活性炭的加入量為10-15g/L藥液，趁熱過濾，濾液減壓濃縮至藥液相對密度為1.10-1.20，備用；(5)濃縮液上聚酰胺吸附樹脂住，以不高于30%的乙醇洗脫6-10個柱體積，收集此部分洗脫液，合并，減壓濃縮，干燥，得總?cè)铺崛∥铮側(cè)祁惓煞植坏陀?0%，齊墩果酸和熊果酸的含量占總?cè)频闹亓堪俜趾坎坏陀?0%。9.含有權(quán)利要求1-8中任意一權(quán)利要求制備方法所得總?cè)铺崛∥锏乃幬锝M合物。10.依據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一權(quán)利要求所述的總?cè)铺崛∥锏闹苽浞椒ㄋ锰崛∥镌谥苽涓尾∷幬镏械挠猛?。全文摘要本發(fā)明涉及一種香青蘭總?cè)祁惢衔锏奶崛》椒?，香青蘭乙醇提取液經(jīng)濃縮、熱水洗滌、堿溶、酸沉、脫色、吸附柱色譜純化即得香青蘭總?cè)铺崛∥铮孟闱嗵m提取物中總?cè)祁惓煞植坏陀?0％，齊墩果酸和熊果酸的含量占總?cè)频闹亓堪俜趾坎坏陀?0％，本發(fā)明香青蘭總?cè)铺崛∥锞哂斜８巫o(hù)肝的作用，可用以制備肝病藥物。文檔編號A61K36/53GK101785799SQ20091024863公開日2010年7月28日申請日期2009年12月22日優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日發(fā)明者關(guān)屹,閆冬申請人:沈陽億靈醫(yī)藥科技有限公司;關(guān)屹