專利名稱：用于肝病治療的基因活化聚乳酸材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于肝病治療的基因活化聚乳酸材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
肝臟是人體內(nèi)物質(zhì)代謝的中心，具有代謝、排毒等功能，因肝癌、脂肪肝、肝硬化、 肝炎等肝臟疾病導(dǎo)致死亡的情況已屢屢發(fā)生，嚴(yán)重威脅著人類健康。研制理想的肝組織工 程支架材料是醫(yī)學(xué)和生物材料科學(xué)領(lǐng)域中的重要方向。 生物材料是指一類可對(duì)機(jī)體組織進(jìn)行修復(fù)、替代與再生，具有特殊功能作用的材 料。生物材料表面在生物和醫(yī)學(xué)中起著至關(guān)重要的作用，因?yàn)樯锊牧现踩肷矬w后，首先 與機(jī)體接觸發(fā)揮生物學(xué)反應(yīng)的就是生物材料表面/界面。而絕大部分生物反應(yīng)，諸如蛋白 吸附、細(xì)胞粘附、遷移及生長(zhǎng)等生物學(xué)行為正是細(xì)胞與材料表面之間的相互作用。深入理 解生物材料表面與細(xì)胞相互作用并進(jìn)行表面修飾是臨床應(yīng)用材料設(shè)計(jì)的關(guān)鍵(Chem. Eng. News, 1999， 73 :51-59)。因此，細(xì)胞/基因活化的生物材料，即第三代生物材料(Science, 2002， 295， 1014-1017)，便應(yīng)運(yùn)而生，它是組織工程發(fā)展的要求和必然趨勢(shì)。從分子水平對(duì) 細(xì)胞進(jìn)行剌激而促進(jìn)細(xì)胞的繁殖分化，進(jìn)而促進(jìn)組織的修復(fù)及再生。最重要的是，細(xì)胞/基 因活化生物材料的產(chǎn)生為基因的可控、耙向性釋放提供了新的思路。將基因釋放和生物材 料研究的有機(jī)結(jié)合，構(gòu)建具有原位基因釋放性能的生物材料表面工程在基因治療和組織工 程研究領(lǐng)域中具有重大意義。 聚乳酸是一種可降解性生物材料，被廣泛的應(yīng)用于組織工程支架和植入體領(lǐng) 域，并獲得了美國(guó)FDA認(rèn)證(Biomaterials 1996;17:175-85.)。然而，聚乳酸作為支架 材料所面臨的最大問(wèn)題是對(duì)生物環(huán)境缺乏組織相容性和抗性(Biomaterials 2001 ;22 : 219-30.)，因?yàn)榫廴樗岜砻娌淮嬖诶诩?xì)胞產(chǎn)生響應(yīng)的活性功能基團(tuán)。為了提高聚乳酸的 生物相容性，促進(jìn)細(xì)胞與材料的相互反應(yīng)，誘導(dǎo)可控的細(xì)胞生物學(xué)行為，研究者對(duì)聚乳酸植 入體的表面工程展開(kāi)了大量的研究。X. B. YANG等用纖維結(jié)合蛋白(FN)和聚賴氨酸(PLL)修 飾聚乳酸表面，與未修飾的材料相比，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)修飾后的聚乳酸材料能提高細(xì)胞的 粘附與鋪展，聚乳酸組織相容性增加(Bone 2001 ;29(6) :523-531) 。 Cai K等用黃芩甙對(duì)三 維聚乳酸支架表面進(jìn)行修飾，結(jié)果表明黃芩甙修飾的聚乳酸支架生物相容性高于未經(jīng)修飾 的聚乳酸支架(Acta Biomater. 2007 ;3 :597-605) 。 C. M. Alves等用乳漿修飾聚乳酸表面， 實(shí)驗(yàn)表明處理后的聚乳酸表面能夠提高蛋白質(zhì)的吸附量，并且有利于細(xì)胞的粘附(Journal ofBiomedical Materials Research Part B :Applied Biomaterials 2008 ;87 :59-66)。
然而，這些方法仍不能解決聚乳酸植入體與肝臟周邊組織的整合、長(zhǎng)期穩(wěn)定性等 問(wèn)題。 半乳糖是肝細(xì)胞表面脫唾液酸糖蛋白受體的特異性配體，使肝細(xì)胞識(shí)別的相應(yīng)位 點(diǎn)并產(chǎn)生特異性相互作用，通過(guò)引入含有半乳糖的殘基，殼聚糖可以增加肝細(xì)胞的附著點(diǎn)。 半乳糖苷化的殼聚糖(galactosylated chitosan，GC)具有良好的生物相容性和降解性，它 與質(zhì)粒DNA形成的多層膜可以在生理?xiàng)l件下發(fā)生降解，使質(zhì)粒DNA或GC/DNA顆粒被釋放；當(dāng)GC/DNA顆粒從多層膜的層狀結(jié)構(gòu)上釋放出來(lái)后，GC攜帶DNA特異的與肝臟細(xì)胞表面脫 唾液酸糖蛋白受體相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)基因傳遞的靶向性；同時(shí)，由于多層膜持續(xù)降解的特點(diǎn)，GC/ DNA顆粒在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生，維持了質(zhì)粒DNA的濃度，細(xì)胞特異的吸收質(zhì)粒DNA后在相應(yīng) 的時(shí)間內(nèi)使質(zhì)粒DNA持續(xù)表達(dá)，達(dá)到基因治療的目的。 將半乳糖苷化的殼聚糖、質(zhì)粒DNA及聚乳酸材料進(jìn)行整合，提供一種新型基因活 化聚乳酸材料，不僅能夠誘導(dǎo)和提高肝細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)支架材料上的黏附性能，提高植 入體的穩(wěn)定性，同時(shí)能夠原位誘導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)，提高肝細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝活性，促進(jìn)肝臟組織 的修復(fù)和再生，進(jìn)一步介導(dǎo)肝靶向性基因轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)基因的可控、靶向性釋放，從而實(shí)現(xiàn)對(duì) 肝病有效治療。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一是提供一種用于肝病治療的基因活化聚乳酸材料， 具有良好的細(xì)胞相容性，不僅能夠原位誘導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)，提高肝細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝活性，促進(jìn) 肝臟組織的修復(fù)和再生，而且能夠提高肝細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)支架材料上的黏附性能，提高 植入體的穩(wěn)定性，進(jìn)一步介導(dǎo)肝靶向性基因轉(zhuǎn)移，有效地調(diào)控基因靶向性釋放并增強(qiáng)細(xì)胞 活力，提高轉(zhuǎn)染率，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝病有效治療。 本發(fā)明所述的用于肝病治療的基因活化聚乳酸材料，包括聚乳酸材料本體，所述 聚乳酸材料本體表面覆有活化層，所述活化層由內(nèi)向外包括依次間隔設(shè)置的質(zhì)粒DNA層和 半乳糖苷化殼聚糖層。 進(jìn)一步，所述聚乳酸材料本體表面與活化層之間設(shè)有聚乙烯亞胺層；
進(jìn)一步，所述活化層中質(zhì)粒DNA層與半乳糖苷化殼聚糖的總層數(shù)為9-21層。
本發(fā)明的目的之二是提供制備所述用于肝病治療的基因活化聚乳酸材料的方法， 包括如下步驟 (1)將所述聚乳酸材料本體浸于聚乙烯亞胺溶液中10-20分鐘后，用去離子水浸 泡l-3次，每次1-2分鐘； (2)將步驟(1)所得聚乳酸材料本體浸入含有質(zhì)粒DNA的磷酸鹽緩沖液中10-20 分鐘后，用去離子水浸泡1-3次，每次1-2分鐘； (3)將步驟(2)所得聚乳酸材料浸于半乳糖苷化殼聚糖的乙酸溶液中10-20分鐘 后，用去離子水浸泡1-3次，每次1-2分鐘； (4)依次重復(fù)步驟(2)和步驟(3)，直至得到所需層數(shù)的用于肝病治療的基因活化 聚乳酸材料。 進(jìn)一步，所述聚乙烯亞胺溶液中包括的組分及相應(yīng)組分在溶液中的濃度分別為 2-5mg/ml的聚乙烯亞胺和100-150mM的氯化鈉； 進(jìn)一步，所述含有質(zhì)粒DNA的磷酸鹽緩沖液pH值為7. 4，質(zhì)粒DNA濃度為0. l_lmg/ ml ; 進(jìn)一步，所述半乳糖苷化殼聚糖的乙酸溶液包括的組分及相應(yīng)組分在溶液中的濃 度分別為質(zhì)量百分比為3% _5%的半乳糖苷化殼聚糖和質(zhì)量百分比為1_3%的乙酸。
本發(fā)明的有益效果是 本發(fā)明的用于肝病治療的基因活化聚乳酸材料具有如下優(yōu)點(diǎn)
a.將半乳糖基與將半乳糖苷化的殼聚糖、質(zhì)粒DNA及聚乳酸材料進(jìn)行整合，利用 肝細(xì)胞表面脫唾液酸糖蛋白受體對(duì)半乳糖基的特異性識(shí)別，提高肝細(xì)胞在殼聚糖表面的附 著點(diǎn)。 b.利用半乳糖苷化的殼聚糖的生物相容性和降解特性，在聚乳酸材料本體表面依 次間隔設(shè)置半乳糖苷化殼聚糖層和質(zhì)粒DNA層形成活化層，在特定時(shí)期內(nèi)，活化層在人體 內(nèi)逐步降解，使質(zhì)粒DNA或GC/DNA顆粒被釋放；當(dāng)GC/DNA顆粒從多層膜的層狀結(jié)構(gòu)上釋放 出來(lái)后，GC攜帶DNA特異的與肝臟細(xì)胞表面脫唾液酸糖蛋白受體相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)基因傳遞的 靶向性。 c.由于多層膜持續(xù)降解的特點(diǎn)，GC/DNA顆粒在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生，維持了質(zhì)粒 DNA的濃度，細(xì)胞特異的吸收質(zhì)粒DNA后在相應(yīng)的時(shí)間內(nèi)使質(zhì)粒DNA持續(xù)表達(dá)，達(dá)到基因治 療的目的。 綜上，本發(fā)明的用于肝病治療的基因活化聚乳酸材料具有良好的細(xì)胞相容性，不 僅能夠原位誘導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)，提高肝細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝活性，促進(jìn)肝臟組織的修復(fù)和再生，而 且能夠提高肝細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)支架材料上的黏附性能，提高植入體的穩(wěn)定性，進(jìn)一步介 導(dǎo)肝靶向性基因轉(zhuǎn)移，有效地調(diào)控基因靶向性釋放并增強(qiáng)細(xì)胞活力，提高轉(zhuǎn)染率，從而實(shí)現(xiàn) 對(duì)肝病有效治療，非常適合臨床應(yīng)用。 本發(fā)明所述的制備用于肝病治療的基因活化聚乳酸材料的方法利用半乳糖苷化
殼聚糖分子與質(zhì)粒DNA之間的靜電作用使半乳糖苷化殼聚糖層與質(zhì)粒DNA層在聚乳酸材料
表面依次沉積，不僅操作簡(jiǎn)單，成本低廉，而且實(shí)施容易，非常適合用于產(chǎn)業(yè)化運(yùn)用。 本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征在某種程度上將在隨后的說(shuō)明書(shū)中進(jìn)行闡述，并
且在某種程度上，基于對(duì)下文的考察研究對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見(jiàn)的，或者可
以從本發(fā)明的實(shí)踐中得到教導(dǎo)。


附圖為H印G2及HEK293細(xì)胞分別在聚乳酸材料1、聚乳酸材料2和聚乳酸材料3 表面得轉(zhuǎn)染效率的對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。應(yīng)當(dāng)理解，所選實(shí)施例僅為了
說(shuō)明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例 ①制備半乳糖苷化殼聚糖 配置NaHC03/乙酸緩沖溶液(緩沖液的pH4. 7，溶液中NaHC03的濃度為0. IN);取 乳糖醛酸(LA)溶于NaHC0乂乙酸緩沖溶液中，制備成摩爾濃度為64mM乳糖醛酸溶液，然后 加入1-乙基_3- (3- 二甲基氨丙基)_碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，所得 溶液中，LA、 NHS和EDC三者的摩爾比為2 : 1 : 1，當(dāng)然，此處LA、 NHS和EDC三者的摩爾
比為1:1:1-2:1:1均可； 室溫下磁力攪拌5min使物料完全溶解后于4。C環(huán)境中放置3小時(shí)，然后室溫反應(yīng) 3小時(shí)，再向溶液中加入殼聚糖(LA與殼聚糖的摩爾比為2 : 1)，持續(xù)攪拌3天，以透析袋在去離子水中透析3天，透析所得溶液經(jīng)冷凍干燥后分別得到半乳糖接枝率為10. 9%半乳 糖苷化殼聚糖固體； ②取半乳糖苷化殼聚糖并將其溶于乙酸溶液，得半乳糖苷化殼聚糖得乙酸溶液；
③將聚乳酸材料本體浸于聚乙烯亞胺溶液中10分鐘，然后用去離子水浸泡1分 鐘； ④再將步驟③所得表面覆有聚乙烯亞胺層的聚乳酸材料浸入含有質(zhì)粒DNA的 pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中20分鐘，然后用去離子水浸泡1分鐘；最后將聚乳酸材料浸于半 乳糖苷化殼聚糖的乙酸溶液中，10分鐘后，用去離子水浸泡1分鐘，本實(shí)施例中，質(zhì)粒DNA為 pSV-P-galactosidase質(zhì)粒；當(dāng)然，所述質(zhì)粒DNA還可以為其他質(zhì)粒，如帶有功能性蛋白基 因序列的質(zhì)粒。 ⑤重復(fù)步驟④的操作直至在聚乳酸材料外表面形成的質(zhì)粒DNA層和半乳糖苷化
殼聚糖層的總層數(shù)為15層，得所需用于肝病治療的基因活化聚乳酸材料。 本實(shí)施例所述聚乙烯亞胺溶液包括的組分及相應(yīng)組分在溶液中的濃度分別為
5mg/ml的聚乙烯亞胺和150mM的氯化鈉，所述磷酸鹽緩沖液pH值為7. 4，緩沖液中質(zhì)粒DNA
濃度為lmg/ml，所述半乳糖苷化殼聚糖的乙酸溶液中包括的組分及相應(yīng)組分在溶液中的濃
度分別為質(zhì)量百分比為5%的半乳糖苷化殼聚糖和質(zhì)量百分比為1%的乙酸。 本實(shí)施例中，聚乳酸材料本體表面與活化層之間設(shè)有聚乙烯亞胺層，其優(yōu)點(diǎn)在于
聚乙烯亞胺通過(guò)物理吸附作用吸附在聚乳酸表面，使不帶電荷的聚乳酸表面帶上正電荷，
其作為引發(fā)層，引發(fā)后續(xù)電解質(zhì)的沉積。當(dāng)然，聚乳酸材料本體表面與活化層之間不設(shè)置聚
乙烯亞胺層同樣可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，區(qū)別在于后續(xù)大分子的沉積效果較差，活化層穩(wěn)定
性較低。 本實(shí)施例中，聚乙烯亞胺溶液中包括的組分及相應(yīng)組分在溶液中的濃度為 2-5mg/ml的聚乙烯亞胺和100-150mM的氯化鈉均可；本實(shí)施例中，所述含有質(zhì)粒DNA的磷 酸鹽緩沖液pH值為7. 4以及質(zhì)粒濃度為0. l-lmg/ml均可；本實(shí)施例中，所述半乳糖苷化殼 聚糖的乙酸溶液包括的組分及相應(yīng)組分在溶液中的濃度為質(zhì)量百分比為3% _5%的半乳 糖苷化殼聚糖和質(zhì)量百分比為1_3%的乙酸均可。 本實(shí)施例中，活化層中質(zhì)粒DNA層和半乳糖苷化殼聚糖總層數(shù)不低于五層即可， 因?yàn)榭倢訑?shù)大于5層的活化層結(jié)構(gòu)較為完善，使用者可以根據(jù)需要限定聚乳酸材料本體表 面活化層的總層數(shù)，以實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間內(nèi)質(zhì)粒DNA的持續(xù)釋放，活化層總層數(shù)以9-21層最佳， 原因在于9層以上的質(zhì)粒DNA層數(shù)是能夠確保質(zhì)粒DNA的總含量，達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)釋放的 目的，但過(guò)多層數(shù)可能導(dǎo)致質(zhì)粒DNA在特定時(shí)間段釋放過(guò)量或難于控制。
所述用于肝病治療的基因活化聚乳酸材料制備方法中，聚乳酸材料本體在聚乙烯 亞胺溶液、磷酸鹽緩沖液以及殼聚糖的乙酸溶液中的浸泡時(shí)間可分別為10-20分鐘，但并 不表示本發(fā)明方法中，各溶液浸泡階段的時(shí)間局限于10-20分鐘，浸泡的目的在于使質(zhì)粒 DNA層及半乳糖苷化殼聚糖層能夠依次間隔附著于聚乳酸材料本體的外表面，由于同層介 質(zhì)(聚陰離子或聚陽(yáng)離子)的同性電荷排斥，理論上傾向于形成單層結(jié)構(gòu)，浸泡時(shí)間長(zhǎng)，可 使聚陰離子或聚陽(yáng)離子層形成更充分，對(duì)聚乳酸材料表面覆蓋更完整，形成的覆蓋層更平 整，浸泡時(shí)間以質(zhì)粒DNA層或者半乳糖苷化殼聚糖能夠完整覆蓋聚乳酸材料表面形成單層
結(jié)構(gòu)即可。
本實(shí)施例中，各溶液對(duì)聚乳酸材料的浸泡結(jié)束后，皆需采用去離子水進(jìn)行浸泡洗 滌，各階段去離子水浸泡的次數(shù)均以l-3次為宜、去離子水浸泡時(shí)間均以每次l-3min為宜， 原因在于浸泡目的在于移除在同一層中可能形成雙層或多層的聚陰離子或聚陽(yáng)離子，以 免它們對(duì)后面鋪層結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性造成影響，但浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則可能導(dǎo)致已形成的多層結(jié) 構(gòu)解離。
結(jié)果驗(yàn)證 H印G2及HEK293細(xì)胞分別在聚乳酸材料1、聚乳酸材料2和聚乳酸材料3表面的 轉(zhuǎn)染效率的鑒定。 本實(shí)施例中所述接枝率為10. 9%的半乳糖苷化殼聚糖與pSV-P -galactosidase 質(zhì)粒修飾的基因活化聚乳酸材料記為聚乳酸材料1。( — )重復(fù)步驟①的操作，區(qū)別在于此步驟中LA與殼聚糖的摩爾比及4 : l，制備 得到接枝率為19. 4%的半乳糖苷化殼聚糖； (二)重復(fù)步驟②-⑤的操作，在另一聚乳酸材料表面構(gòu)建活化層，本步驟所 述活化層包括由內(nèi)向外依次間隔設(shè)置的接枝率為19.4%的半乳糖苷化殼聚糖層與質(zhì)粒 pSV-P -galactos idase層，所得基因活化聚乳酸材料記為聚乳酸材料2 ;
(三)重復(fù)步驟②_⑤的操作，在第三個(gè)聚乳酸材料表面構(gòu)建活化層，本步驟所述 活化層包括由內(nèi)向外依次間隔設(shè)置的殼聚糖層與質(zhì)粒pSV-P -galactosidase層，所得基 因活化聚乳酸材料記為聚乳酸材料3 ;(四)將H印G2及HEK293細(xì)胞分別接種在聚乳酸材料1、聚乳酸材料2和聚乳酸材 料3的表面。H印G2細(xì)胞及HEK293細(xì)胞接種密度分別為150000cells/well和80000cells/ well ;分別用DMEM培養(yǎng)基加10%的新生牛血清對(duì)三種聚乳酸材料表面的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)， 細(xì)胞在材料表面培養(yǎng)2天后，以0. 25%胰酶消化，收集細(xì)胞并用半乳糖苷酶檢測(cè)試劑盒 (Sigma公司產(chǎn)品)檢測(cè)三種體系中半乳糖苷酶在H印G2及HEK293細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果如圖 1。 從圖可知，不同活化層修飾的聚乳酸表面對(duì)基因轉(zhuǎn)染存在細(xì)胞選擇性；對(duì)于細(xì)胞 表面表達(dá)脫唾液酸糖蛋白受體(半乳糖為其配體)的H印G2而言，轉(zhuǎn)染率隨著半乳糖接枝 率的上升而增加，而HEK293細(xì)胞不存在這種趨勢(shì)；與聚乳酸材料3的表面相比，其它兩種基 因活化的聚乳酸材料表面都可促進(jìn)半乳糖苷酶的表達(dá)，且半乳糖苷酶表達(dá)量也隨著半乳糖 接枝率的上升而增加，說(shuō)明半乳糖苷化殼聚糖/質(zhì)粒DNA活化的聚乳酸表面能夠調(diào)控基因 釋放并增強(qiáng)細(xì)胞活力，提高轉(zhuǎn)染率。 最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較 佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技 術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本 發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
一種用于肝病治療的基因活化聚乳酸材料，其特征在于包括聚乳酸材料本體，所述聚乳酸材料本體表面覆有活化層，所述活化層由內(nèi)向外包括依次間隔設(shè)置的質(zhì)粒DNA層和半乳糖苷化殼聚糖層。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于肝病治療的基因活化聚乳酸材料，其特征在于所述聚 乳酸材料本體表面與活化層之間設(shè)有聚乙烯亞胺層。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于肝病治療的基因活化聚乳酸材料，其特征在于所述活化層中質(zhì)粒DNA層與半乳糖苷化殼聚糖的總層數(shù)為9-21層。
4. 制備權(quán)利要求1所述的用于肝病治療的基因活化聚乳酸材料的方法，其特征在于 包括如下步驟(1) 將所述聚乳酸材料本體浸于聚乙烯亞胺溶液中10-20分鐘后，用去離子水浸泡1-3次，每次l-2分鐘；(2) 將步驟(1)所得聚乳酸材料本體浸入含有質(zhì)粒DNA的磷酸鹽緩沖液中10-20分鐘 后，用去離子水浸泡1-3次，每次1-2分鐘；(3) 將步驟(2)所得聚乳酸材料浸于半乳糖苷化殼聚糖的乙酸溶液中10-20分鐘后，用 去離子水浸泡1-3次，每次1-2分鐘；(4) 依次重復(fù)步驟(2)和步驟(3)，直至得到所需層數(shù)的用于肝病治療的基因活化聚乳 酸材料。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備用于肝病治療的基因活化聚乳酸材料的方法，其特征在 于所述聚乙烯亞胺溶液中包括的組分及相應(yīng)組分在溶液中的濃度分別為2-5mg/ml的聚 乙烯亞胺和100-150mM的氯化鈉。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備用于肝病治療的基因活化聚乳酸材料的方法，其特征在 于所述含有質(zhì)粒DNA的磷酸鹽緩沖液pH值為7. 4，質(zhì)粒DNA濃度為0. l_lmg/ml。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備用于肝病治療的基因活化聚乳酸材料的方法，其特征在 于所述半乳糖苷化殼聚糖的乙酸溶液包括的組分及相應(yīng)組分在溶液中的濃度分別為質(zhì) 量百分比為3% _5%的半乳糖苷化殼聚糖和質(zhì)量百分比為1-3%的乙酸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于肝病治療的基因活化聚乳酸材料，包括聚乳酸材料本體和活化層，活化層包括由內(nèi)向外依次間隔設(shè)置的質(zhì)粒DNA層和半乳糖苷化殼聚糖層，所述基因活化聚乳酸材料具有良好的細(xì)胞相容性并且能夠原位誘導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)，可增強(qiáng)肝細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)支架材料上的黏附性能，提高植入體的穩(wěn)定性，進(jìn)一步介導(dǎo)肝靶向性基因轉(zhuǎn)移，有效地調(diào)控基因靶向性釋放并增強(qiáng)細(xì)胞活力，提高轉(zhuǎn)染率，從而實(shí)現(xiàn)肝病的治療；本發(fā)明還提供了所述基因活化聚乳酸材料的制備方法，利用半乳糖苷化殼聚糖分子與質(zhì)粒DNA之間的靜電作用使半乳糖苷化殼聚糖層與質(zhì)粒DNA層在聚乳酸材料表面依次沉積，不僅操作簡(jiǎn)單，成本低廉，而且實(shí)施容易，非常適合用于產(chǎn)業(yè)化運(yùn)用。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101745151SQ20091025089
公開(kāi)日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者胡燕, 蔡開(kāi)勇 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)